倪俊芬 陳前嶺 仲向前

（1泗陽(yáng)縣畜牧獸醫(yī)站，江蘇宿遷 223700；2宿遷市畜牧獸醫(yī)站，江蘇宿遷 223899）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）已在我國(guó)“定殖”，且周邊國(guó)家的非洲豬瘟疫情也是多發(fā)頻發(fā)，對(duì)養(yǎng)豬企業(yè)仍存在較大威脅，非洲豬瘟疫情的防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻[1,2]。目前，全球仍無(wú)非洲豬瘟疫苗上市，防控非洲豬瘟仍需靠豬場(chǎng)嚴(yán)格的生物安全[3]。因此，全面了解非洲豬瘟病毒是防控疫病和研發(fā)疫苗較為有效的手段，我國(guó)已有科研單位、高校在解析非洲豬瘟病毒[4,5]。了解非洲豬瘟病毒基因特征，對(duì)防控非洲豬瘟有重要意義[6]。

非洲豬瘟病毒是一種雙鏈DNA分子病毒，基因組長(zhǎng)為170～190 kb[7]，編碼150～200種病毒蛋白，其中有68中結(jié)構(gòu)蛋白和100余種非結(jié)構(gòu)蛋白。經(jīng)解析，非洲豬瘟病毒顆粒由內(nèi)向外依次為病毒基因組、核衣殼、內(nèi)膜、衣殼和外膜組成。擬核基因組包括病毒基因組合核蛋白，其主要蛋白有DNA結(jié)合蛋白p10和pA104R；核衣殼主要蛋白有p150、p37、p35、p34、p14和p15等6種；內(nèi)膜蛋白有 pE183R、p12、p17、pE183L、p54等；衣殼主要蛋白由p72、p49、p14.5等組成；外膜的主要蛋白為CD2v。科研工作者對(duì)非洲豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白位置和功能進(jìn)行了深入研究，為非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)和疫苗研發(fā)提供了大量數(shù)據(jù)支撐。如郭怡德等[8]對(duì)非洲豬瘟病毒的重要毒力蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白等進(jìn)行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)在病毒形態(tài)維持、病毒吸附與入侵宿主細(xì)胞、病毒復(fù)制、病毒對(duì)宿主細(xì)胞代謝調(diào)控及免疫逃逸等方面有50余個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白參與。

1 非洲豬瘟病毒功能基因的研究

非洲豬瘟病毒中已經(jīng)明確功能的有68個(gè)蛋白，且這些蛋白分布在病毒顆粒不同的位置[9]。如p54、p12、p17等屬于內(nèi)膜蛋白；p72是主要的衣殼蛋白；CD2v蛋白是典型的外膜蛋白等。68個(gè)功能蛋白中參與復(fù)制的蛋白約30個(gè)，其余為參與誘導(dǎo)凋亡、破壞凝血、病毒吸附、免疫逃逸等，同時(shí)仍有大部分非洲豬瘟病毒基因功能仍處于未知狀態(tài)[10]。在這些蛋白中，有些蛋白有利于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)；有些有利于蛋白功能結(jié)構(gòu)的研發(fā)，為非洲豬瘟病毒的防控和殺滅提供參考；而還有一些則更有利于疫苗研發(fā)。因此，分析非洲豬瘟病毒蛋白的功能結(jié)構(gòu)，旨在為非洲豬瘟的防控和疫苗研發(fā)提供理論參考。

2 非洲豬瘟病毒的致病基因

2021年之前，為了更好地防控非洲豬瘟病毒，多數(shù)科研工作者以研究非洲豬瘟病毒的致病機(jī)理和非洲豬瘟病毒蛋白的表達(dá)為主，以期能夠更精準(zhǔn)的檢測(cè)到非洲豬瘟病毒。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為CD2v蛋白是快速檢測(cè)非洲豬瘟病毒、研發(fā)非洲豬瘟疫苗的一個(gè)有效目的蛋白。如何慶等[11]對(duì)非洲豬瘟病毒的CD2v的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能進(jìn)行分析，闡明非洲豬瘟病毒的致病機(jī)理。田盼盼等[12]運(yùn)用各種生物信息學(xué)技術(shù)分析了非洲豬瘟病毒CD2v蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)、抗原性等，發(fā)現(xiàn)CD2v蛋白是親水性的分泌蛋白，具有免疫原性且為非過(guò)敏原。凌占業(yè)等[13]通過(guò)真核表達(dá)非洲豬瘟病毒的CD2v重組蛋白，建立了一種快速的ASFV間接ELISA檢測(cè)方法。

非洲豬瘟病毒由于分子量較大而通過(guò)呼吸道、消化道等傳播，因此，在非洲豬瘟病毒的檢測(cè)中，特異性目的基因片段的確定也很重要。侯景等[14,15]在研究非洲豬瘟病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，生豬感染非洲豬瘟病毒后，在第5 d會(huì)檢測(cè)出非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的抗體，第7 d該基因抗體達(dá)到高峰值。同時(shí)，還通過(guò)預(yù)測(cè)分析和亞細(xì)胞定位等方法解析了非洲豬瘟病毒解旋酶D1133L的基因結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)進(jìn)一步解析D1133L基因的功能和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。張?chǎng)斡畹萚16]構(gòu)建了非洲豬瘟病毒重組蛋白pK205R、pE183L、pA104R和pB602L等的多克隆抗體，篩選出p54和pK205R重組蛋白是較好的診斷抗原，可用于非洲豬瘟病毒感染后的早期或中后期血清學(xué)診斷。孫茂文等[17]、向志達(dá)等[18]發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒的A137R蛋白多克隆抗體，具有較好的免疫原性、反應(yīng)性和特異性，為后續(xù)解析非洲豬瘟病毒的A137R蛋白功能和建立ASFV血清學(xué)檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。武悅等[19]構(gòu)建非洲豬瘟多基因家族MGF-505-3R基因重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行表達(dá)。發(fā)現(xiàn)MGF-505-3R蛋白為不穩(wěn)定的疏水蛋白，為我國(guó)非洲豬瘟免疫血清學(xué)診斷試劑的制備及預(yù)防控制奠定了基礎(chǔ)。此外，韓程程等[20]利用非洲豬瘟病毒的p54基因蛋白作為檢測(cè)目標(biāo)，設(shè)計(jì)了Spinach-p54的嵌合式RNA適配體，實(shí)現(xiàn)了在RNA水平對(duì)非洲豬瘟病毒的快速檢測(cè)，且可用于市場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。曾宇晨等[21]建立了基于酶促重組酶擴(kuò)增技術(shù)的非洲豬瘟病毒DNA快速檢測(cè)方法，為非洲豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了一種快速有效的檢測(cè)方法。

3 有利于非洲豬瘟病毒檢測(cè)的蛋白

目前，用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的蛋白種類(lèi)較多，選擇一種靈敏度高、準(zhǔn)確性好的目的蛋白建立非洲豬瘟病毒的ELISA檢測(cè)方法，便于養(yǎng)殖企業(yè)自行檢測(cè)顯得尤為重要。程佳等[22]利用非洲豬瘟病毒EP153R蛋白建立了間接檢測(cè)非洲豬瘟病毒蛋白的ELISA方法，并通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其有較強(qiáng)的特異性和較好的重復(fù)性。鄔旭龍等[23]通過(guò)原核表達(dá)ASFVpK205R重組蛋白，建立了一種快速的ASFV間接ELISA檢測(cè)方法。王彩霞等[24]利用真核表達(dá)的非洲豬瘟病毒p72蛋白為包被抗原，建立了特異性檢測(cè)ASFV抗體的阻斷ELISA方法。王兆貴等[25]篩選以非洲豬瘟病毒pA104R蛋白作為最佳診斷抗原，用于檢測(cè)非洲豬瘟病毒的間接ELISA方法。

此外，在非洲豬瘟病毒蛋白的ELISA檢測(cè)中，抗體的選擇和制備也很重要，選擇正確的抗體可以更好地檢測(cè)出病毒，并可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。顏世君等[26]為研發(fā)非洲豬瘟病毒的免疫診斷學(xué)試劑，制備了抗p22蛋白單克隆抗體。趙少若等[27]通過(guò)研究制備了p11.5蛋白的特異性單克隆抗體；白晶晶等[28]通過(guò)重組法制備了非洲豬瘟病毒p17蛋白的單克隆抗體；耿笑林等[29]制備了非洲豬瘟病毒K145R蛋白的單克隆抗體，趙亞茹等[30]合成了非洲豬瘟病毒K205R基因的單克隆抗體，王西西等[31]制備了DP96R重組蛋白的多克隆抗體；陳蓉等[32]重組了非洲豬瘟病毒p10蛋白和多克隆抗體；李佳佳等[33]制備了非洲豬瘟病毒H240R基因的多克隆抗體，楊博等[34]制備了非洲豬瘟病毒MGF360-9L蛋白的多克隆抗體，李杰等[35]制備了非洲豬瘟病毒p30-54基因融合蛋白的多克隆抗體，這些蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為建立非洲豬瘟病毒抗體、抗原診斷產(chǎn)品的研究提供了重要的生物材料。

在非洲豬瘟病毒單克隆或多克隆抗體的檢測(cè)中，運(yùn)用p30病毒蛋白制備抗體的頻率相對(duì)較高。如黃劍等[36]利用非洲豬瘟病毒p30結(jié)構(gòu)蛋白中的CP204L基因，制備了多克隆抗體，并對(duì)抗體進(jìn)行了表達(dá)，為p30蛋白結(jié)構(gòu)功能研究奠定了基礎(chǔ)。劉靖等[37]構(gòu)建了表達(dá)非洲豬瘟病毒p30蛋白的細(xì)胞系、純化p30蛋白并制備單克隆抗體（MAb），為ASFV p30蛋白的深入研究及ASFV的快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。吳競(jìng)等[38]對(duì)非洲豬瘟病毒的p30基因進(jìn)行了原核表達(dá)，并建立間接ELISA檢測(cè)方法，可初步應(yīng)用于非洲豬瘟病毒抗體的檢測(cè)。同時(shí)，p35[39]、p54[40]、p72[41]、pB602L[42]、pK145R[43]、pK205R[44]等蛋白在檢測(cè)非洲豬瘟病毒中也起著非常重要的作用，為進(jìn)一步研發(fā)非洲豬瘟血清學(xué)診斷方法提供了參考依據(jù)。

4 有利于疫苗研發(fā)的非洲豬瘟病毒基因

當(dāng)前，非洲豬瘟病毒的衣殼蛋白是研發(fā)疫苗的關(guān)鍵蛋白，據(jù)報(bào)道，非洲豬瘟病毒的衣殼蛋白主要成分是p72，此外還有五鄰體頂點(diǎn)蛋白（H240R）及3種不同的次要衣殼蛋白（Minor capsid protein）[45]。因此，對(duì)非洲豬瘟病毒衣殼蛋白基因的解析，成為研發(fā)非洲豬瘟疫苗的參考依據(jù)和思路，研究發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒核衣殼的主要蛋白p72中存在可以制備疫苗的候選基因位點(diǎn)，如高瞻等[46]為預(yù)測(cè)非洲豬瘟病毒2018/AnhuiXCGQ株p72蛋白的T、B淋巴細(xì)胞抗原表位，對(duì)該蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)多表位疫苗，發(fā)現(xiàn)p72蛋白具有多個(gè)潛在的抗原表位，為構(gòu)建非洲豬瘟多表位疫苗提供了依據(jù)。胡永新等[47]通過(guò)合成P72蛋白中的B646L基因，并將該基因與腺病毒骨架載體進(jìn)行重組，經(jīng)細(xì)胞傳代后獲得重組腺病毒，為非洲豬瘟腺病毒疫苗的研制奠定了一定基礎(chǔ)。此外，非洲豬瘟病毒的五鄰體頂點(diǎn)蛋白（H240R）也是疫苗研究的一個(gè)候選基因，王國(guó)強(qiáng)等[48]原核表達(dá)非洲豬瘟病毒次要衣殼五鄰體頂點(diǎn)蛋白（H240R），并研究其免疫原性。發(fā)現(xiàn)ASFV衣殼五鄰體頂點(diǎn)蛋白H240R在原核系統(tǒng)中以包涵體形式表達(dá)，純化復(fù)性的目的蛋白具有良好的免疫原性，并且可以和陽(yáng)性血清反應(yīng)。這些可為進(jìn)一步研究H240R蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及ASFV亞單位疫苗研制提供參考和思路。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，一種由EP402R基因編碼的糖蛋白CD2v在ASFV病毒入侵宿主和傳播擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用。因此，大多科研工作者通過(guò)CD2v蛋白在研發(fā)一些非洲豬瘟病毒的基因缺失疫苗和基因重組疫苗。何慶等[49]對(duì)ASFV的CD2v結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能研究報(bào)道進(jìn)行分析綜述，將為闡明疫苗研發(fā)等提供重要參考。張霽輝等[50]通過(guò)非洲豬瘟病毒的CD2v蛋白構(gòu)建了核酸重組疫苗，通過(guò)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的核酸疫苗可以提高小鼠機(jī)體的免疫應(yīng)答。此外，當(dāng)非洲豬瘟病毒感染豬只后，引起豬器官發(fā)生炎癥反應(yīng)，而病毒中的一些非結(jié)構(gòu)蛋白則可以誘導(dǎo)機(jī)體干擾素的產(chǎn)生，如MGF多基因家族中的一些基因，因此，MGF多基因家族在疫苗研發(fā)中具有重要的作用。蔡建秋等[51]分析了非洲豬瘟病毒中國(guó)Pig/HLJ/2018分離株MGF多基因家族的42條編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位區(qū)域、T細(xì)胞抗原表位區(qū)域分析，篩選出25條優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位序列、20條優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞抗原表位序列，這些B、T細(xì)胞抗原表位區(qū)域?yàn)闃?gòu)建非洲豬瘟多表位疫苗提供了基礎(chǔ)依據(jù)。蔣亞君等[52]重組了非洲豬瘟病毒的MGF360-12L基因，并在鑒定中發(fā)現(xiàn)12L重組蛋白具有較好的穩(wěn)定性，為非洲豬瘟病毒的疫苗研發(fā)提供了生物材料。除以上基因外，還有一些基因也是非洲豬瘟疫苗研發(fā)的重點(diǎn)基因，如非洲豬瘟病毒p49蛋白的B438L基因[53]、非洲豬瘟病毒的pI215L 蛋白[54]等。

5 其他

當(dāng)前，仍沒(méi)有可以普及推廣的非洲豬瘟疫苗，因此，早期豬群的檢測(cè)和生物安全防控，仍舊是防控非洲豬瘟的主要手段。而科研工作者對(duì)非洲豬瘟病毒毒株及基因的解析仍在繼續(xù)，且在為非洲豬瘟疫苗的研發(fā)不斷積累依據(jù)。如張彥兵等[55]通過(guò)分析非洲豬瘟病毒不同毒株E165R基因啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)E165R啟動(dòng)子含有3個(gè)活性區(qū)域，為解析E165R基因提供參考。楊博等[33]對(duì)非洲豬瘟病毒多基因家族中MGF360-9蛋白的研究為對(duì)非洲豬瘟病毒的靶向藥物和疫苗的研發(fā)提供了參考依據(jù)。

6 小結(jié)

綜上所述，科研人員對(duì)非洲豬瘟病毒基因的解析已積累了較多的數(shù)據(jù)，為后期我國(guó)非洲豬瘟的快速檢測(cè)和疫苗的研發(fā)提供了大量依據(jù)。盡管非洲豬瘟病毒基因的解析不斷完善，但養(yǎng)豬企業(yè)不應(yīng)將希望寄托于疫苗的研發(fā)，還是應(yīng)做好養(yǎng)豬場(chǎng)的生物安全防控，并注重養(yǎng)殖技術(shù)人員的素質(zhì)提升，防患于未然，保證養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。