霍寧寧，李肖莉，邢騫文，李研東*，艾連峰，劉華格

(1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，石家莊 050018；2.河北省獸藥飼料工作總站，石家莊 050035；3.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，石家莊 050000)

隱性藥物是添加于常規(guī)藥物中但未在藥品配方中明確標(biāo)識的系列藥物總稱。隨著農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告[1]的實施，我國養(yǎng)殖業(yè)“減抗、替抗”時代已到來,中獸藥產(chǎn)品因其自身特點受到研制從業(yè)者的追捧，銷量大增。但同時也出現(xiàn)了中獸藥中非法添加多種違禁藥物的現(xiàn)象，不僅擾亂了市場秩序,還對動物和人的身體健康造成不良后果。中獸藥見效較慢，不法分子為了追求利益，在中獸藥中添加非法藥物成分以達(dá)到快速見效的目的往中獸藥產(chǎn)品或者獸藥原料中添加化學(xué)藥物、激素、抗生素等，手法隱蔽,不經(jīng)專業(yè)檢測很難發(fā)現(xiàn)，直到肉、蛋、奶等產(chǎn)品檢出藥物殘留, 追根溯源時才發(fā)現(xiàn)使用的中獸藥中有隱性藥物的非法添加，給養(yǎng)殖者造成非常大的經(jīng)濟(jì)損失，給食品安全帶來巨大隱患。目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于獸藥中非法添加物篩查的公告和方法，除了中國獸藥典規(guī)定的相關(guān)檢驗方法外，只要涉及農(nóng)業(yè)部第2395、2398、2448、2451、2494、2571等號公告[2-3]共計51個檢查方法可供使用。這些方法均是基于紫外分光光度法、薄層色譜、顯微鏡檢查、液相色譜法等方法和設(shè)備，針對樣品單一，方法單一、設(shè)備單一，通量低，適用范圍窄。因此在應(yīng)用和實際檢驗中往往出現(xiàn)方法不適應(yīng)的情況，給檢驗和執(zhí)法帶來很大困難。當(dāng)前多采用的比較先進(jìn)的篩查方法多為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[4-9]，而本文使用高分辨質(zhì)譜建立的篩查方法報道較少。隨著高分辨質(zhì)譜應(yīng)用越來越廣[10-14]，以此為基礎(chǔ)開發(fā)的分析檢測技術(shù)，以其高靈敏度、高分辨率，能夠?qū)Χ喾N未知化合物同時進(jìn)行高通量篩查的優(yōu)勢愈加凸顯[11]。

中獸藥樣品前處理方法多用酸化乙腈和甲醇處理[5-9]，凈化柱凈化后過膜上機(jī)，所檢種類多為某一類藥物檢測，對高通量的上百種化學(xué)藥物還未見報道。結(jié)合日本、美國、歐盟及我國違禁藥物的種類進(jìn)行歸納分類，有抗病毒的藥物、硝基呋喃類、酰胺醇類、氟喹諾酮類、磺胺類、咪唑和呋喃類等有十幾類，故本試驗采用1%甲酸乙腈對樣品中的十幾大類目標(biāo)物進(jìn)行提取，將提取液過凈化管凈化后，在超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱質(zhì)譜進(jìn)行檢測分析，建立小分子篩查數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Thermo TraceFinder篩查軟件分析，建立一種高通量的170種隱性藥物的篩查檢測，前處理方法簡單，具備準(zhǔn)確、高效、快速和高通量的優(yōu)勢，適用于具備儀器條件的政府監(jiān)管部門和第三方檢測機(jī)構(gòu)，為進(jìn)一步優(yōu)化完善中獸藥高通量檢驗方法，拓展更多獸用藥物和非法添加物的篩查途徑提供數(shù)據(jù)支撐，更好的為有需要的企業(yè)提供諸如原材料質(zhì)量風(fēng)險控制、成品監(jiān)督及相關(guān)檢驗需求提供方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 170種獸藥對照品，F(xiàn)irst Standard，阿爾塔公司；乙腈(色譜純)，默克；蒸餾水，屈臣氏；甲酸，賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備 UltiMate 3000-Q-Exactive Focus 超高效液相色譜—串聯(lián)離子阱軌道高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(美國Thermo公司)；BTOFUGE STRATOS型號冷凍離心機(jī)(美國 Thermo 公司)；JJ200 型電子天平(美國雙杰兄弟公司)；GenPureUV-TOC 型高純水發(fā)生器(美國 Thermo 公司)；KQ-500DV 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；MS3DS25 型渦旋振蕩器(IKA公司)；N-EVAP112型氮氣吹干儀(帶加熱裝置)，溫度可控制在(0～100)℃(美國Jnc公司)；Arium 611uV型超純水制備器(賽多利斯公司)。

1.3 試樣溶液制備 稱取中獸藥口服液樣品 1 g(精確至0.02 g)，置于50 mL離心管中，加入20 mL 1%甲酸乙腈溶液，加入3 g氯化鈉，渦旋混勻3 min，超聲提取20 min。12000 r/min 離心10 min；取上清液1.4 mL，加入凈化管(PSA 50 mg、C1850 mg、MgSO4150 mg)中凈化，10000 r/min離心5 min后，取上清1 mL氮吹至近干替換復(fù)溶液為0.2%甲酸水，用0.2 μm 微孔濾膜過濾后，供質(zhì)譜分析用。

1.4 液相色譜條件 色譜柱：Accucore RP-MS柱，(100 mm×2.1 mm，粒徑2.6 μm)；柱溫：30 ℃。流動相：A：0.05%甲酸水；B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

1.5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI 源)，正負(fù)離子檢測模式(ESI+、ESI-)同時掃描，掃描方式為一級全掃描/數(shù)據(jù)依賴型二級質(zhì)譜掃描(Full MS /ddMS2)，源區(qū)主要參數(shù)設(shè)置：鞘氣流速為9 arb，噴霧電壓為3 kV，毛細(xì)管(離子傳輸管)溫度320 ℃，S-lens 電壓55 kV，輔助氣加熱溫度30 ℃。質(zhì)譜一級掃描模式Full MS，掃描范圍(m/z)100～900，一級分辨率70000，進(jìn)入 C-Trap 的離子數(shù)目1e6，離子最大注入時間：100 ms；二級掃描模式ddMS2模式，二級分辨率35000，頂點激發(fā)時間3～6 s，設(shè)置階梯碰撞能20 kV、35 kV和50 kV，動態(tài)排除時間8 s。采集數(shù)據(jù)前使用正負(fù)離子校正液進(jìn)行質(zhì)量軸校正。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過Xcalibur 軟件提取化合物碎片離子信息，通過Trace Finder建立篩查數(shù)據(jù)庫(表2)。

表2 篩查數(shù)據(jù)庫信息Tab 2 Screening database information

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

1.6 篩查結(jié)果判定 根據(jù)歐盟2002/657/EC[15]準(zhǔn)則，應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對目標(biāo)化合物進(jìn)行分析時，篩查規(guī)則中提出，有1個母離子和1個子離子、或2個子離子匹配則確證分析的樣品含有該化合物。對于疑似陽性樣品，進(jìn)一步在ddMS2模式下針對疑似含有的化合物進(jìn)行二級特征碎片離子掃描，當(dāng)有2個或2個以上豐度較高的碎片離子與標(biāo)準(zhǔn)譜圖中相應(yīng)的碎片離子精確質(zhì)量數(shù)偏差小于105且碎片離子的相對豐度比在最大允許偏差范圍內(nèi)時，確證含有該化合物。對供試品溶液進(jìn)行Full MS/ddMS2全掃描， 根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)篩查數(shù)據(jù)庫中的m/z的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間對目標(biāo)化合物進(jìn)行篩查。當(dāng)未知物出峰時間偏差在±0.5 min內(nèi),母離子響應(yīng)值在105及以上，精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，子離子響應(yīng)值在104及以上、精確質(zhì)量數(shù)偏差在5 ppm范圍內(nèi)，同位素豐度比范圍在70%范圍內(nèi)，上述條件全部符合通過的為確認(rèn)陽性樣品，有非法添加化學(xué)藥物存在，否則判定為陰性樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩查結(jié)果分析 在對空白添加樣品進(jìn)行快速篩查時，根據(jù)與篩查數(shù)據(jù)庫比對，當(dāng)藥物上機(jī)濃度5 ng/mL時藥物檢出率為77.33%，藥物上機(jī)濃度20 ng/mL時藥物檢出率為92.18%，方法可基本滿足中獸藥口服液中非法添加化合物的高通量快速檢測。根據(jù)實際樣品檢測結(jié)果，目標(biāo)物出峰周圍無雜峰干擾，如圖1所示的實際樣品在1%甲酸乙腈提取液下的部分目標(biāo)化合物離子的提取色譜圖，且部分待確證的未篩出化合物多為二級碎片離子響應(yīng)值未能達(dá)到設(shè)定范圍，即濃度添加較低靈敏度低，故為未篩出項，此項需要進(jìn)一步使用普通四級桿進(jìn)行定性定量進(jìn)行確證可疑添加物?？傮w上，該方法可將樣品中絕大部分添加的化學(xué)物質(zhì)篩查出，故應(yīng)用該方法處理樣品采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，具備準(zhǔn)確、高效、快速和高通量的優(yōu)勢，能夠應(yīng)用于多種口服液樣品中非法添加未知藥物的快速篩查工作，其準(zhǔn)確率較高。圖2所示為不同添加濃度在不同提取液下的提取效果圖。

圖1 在1%甲酸乙腈提取液下的部分目標(biāo)化合物離子的提取色譜圖Fig 1 Extraction chromatogram of some target compound ions under 1 % formic acid acetonitrile extract

圖2 不同添加濃度在不同提取液下的提取效果Fig. 2 Extraction effect of different concentration in different extracting solution

2.2 儀器方法優(yōu)化 液相色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)對目標(biāo)物的分離和離子化均有影響。實驗以有機(jī)相：水相(2∶98)為初始比例，比較0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸乙腈、甲醇-水和甲醇-0.05%甲酸水四組流動相組分的分離能力，從峰形、分離程度、響應(yīng)強(qiáng)度比較，如圖3所示，喹諾酮類藥物的出峰比較，在甲醇中的結(jié)果要優(yōu)于乙腈，甲醇相比較乙腈，具有更強(qiáng)的極性，對藥物的分離起到明顯的促進(jìn)作用，對分離其他同分異構(gòu)體可提供參考。質(zhì)譜方法優(yōu)化中加入inclusion列表，主要包含了目標(biāo)物的分子信息，使得在離子阱中可以更加精準(zhǔn)的使目標(biāo)物離子化得到碎片信息，提高篩查方法的定性能力，除此之外優(yōu)化了質(zhì)譜掃描動態(tài)排除時間，優(yōu)化時間從8 ～15 s，排除了質(zhì)譜重復(fù)采集強(qiáng)度占優(yōu)勢的某一質(zhì)荷比的母離子的二級質(zhì)譜，影響其他母離子的二級譜圖采集的情況。

圖3 四組流動相對喹諾酮類藥物出峰比較Fig 3 Comparison of four groups of mobile relative quinolones peak注：由左至右依次為乙腈-0.1%甲酸水、0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水、甲醇-水和甲醇-0.05%甲酸水

2.3 前處理優(yōu)化 提取液提取效率對目標(biāo)物的回收率具有明顯影響。根據(jù)前人報道多采用乙腈對目標(biāo)物進(jìn)行提取，且分別使用了不同酸度乙腈對目標(biāo)物提取，因此，本試驗采用五組不同酸度的乙腈，分別為乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈；采用通過式固相萃取小柱PRIME HLB柱和凈化管進(jìn)行凈化，比較查看提取效果，將絕大部分的目標(biāo)物進(jìn)行單標(biāo)校準(zhǔn)查看在凈化管中的回收率如圖4所示。在圖中可以看出，1%甲酸乙腈作為提取液，在凈化管凈化條件下，絕大部藥物回收率在60%左右，由于存在基質(zhì)效應(yīng)，此次在溶劑標(biāo)校準(zhǔn)的回收率下基本滿足試驗要求，基質(zhì)標(biāo)校準(zhǔn)情況下回收率大于60%。試驗發(fā)現(xiàn)，在PRIME HLB柱凈化后，不同酸度提取液樣品中的目標(biāo)物檢出率相近。通過用標(biāo)液驗證PRIME HLB柱對絕大部分目標(biāo)物無吸附和保留，可知pH值對提取液的提取效果無明顯影響。1%甲酸乙腈提取液經(jīng)PRIME HLB柱凈化后的效果與凈化管相近，但大部分目標(biāo)物回收率要低于吸附劑凈化的效果。并且查閱資料得知，由于PSA是一種極性吸附劑，對大多數(shù)基質(zhì)凈化效果較好，多用于去除極性糖類、脂肪酸、親脂色素等極性基質(zhì)，但PSA是一種堿性吸附劑，僅對酸性藥物有吸附作用，因此使用時需添加一定的酸以減少獸藥及殘留的損失；而C18對非極性組分有很強(qiáng)的吸附作用，適合吸附從非極性到中等極性的脂類、糖類等親脂型化合物，但過量的C18同時會吸附親脂性較強(qiáng)藥物，因此，綜合考慮到檢出率和回收率的情況下，在QuEChERs凈化(PSA50 mg、C1850 mg、MgSO4150 mg)中此含量的吸附劑下，1%甲酸乙腈提取效果要好。

圖4 藥物在不同提取液中的回收率分布Fig 4 Recovery distribution of drugs in different extracts

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法比較 中獸藥樣品的隱性藥物的篩查工作，其難點在于樣品的前處理過程。中藥基質(zhì)成分多為多糖、植物源性纖維、色素等物質(zhì)，其中多糖和色素是除雜優(yōu)化的主要目標(biāo)。傳統(tǒng)的獸藥檢測一般是稀釋或簡單的有機(jī)溶劑提取，達(dá)不到本試驗快速分離和凈化基質(zhì)的目的。且有學(xué)者在凈化時采用PRiME HLB柱和HLB 柱凈化，凈化后的回收率低。因此，本次試驗選擇相對簡單的基質(zhì)進(jìn)行初步試驗，經(jīng)查閱資料和試驗研究發(fā)現(xiàn)，中獸藥中的色素和糖分在水中極易分解，故在選擇提取液時，排除了添加水分的提取液，并在提取過程中加入了除水劑NaCl，使得絕大部分藥物提取到有機(jī)相中。其中純有機(jī)相中加入甲酸改變pH值，可以影響凈化效果，并且PSA對pH要求呈酸性，因此在提取液中加入適量的甲酸，使得檢出率和回收率均為最優(yōu)，考慮到綜合情況，最終試驗加入1%甲酸的乙腈。與前人研究相比較，該試驗方法前處理步驟簡單、易于操作，沒有繁瑣的活化、洗脫固相萃取柱、濃縮旋蒸、水解等步驟，提取步驟采用酸化有機(jī)溶劑提取，凈化步驟采用QuEChERs管直接除雜，能夠縮短常規(guī)凈化方式的時間，提高實驗的時效性，及時發(fā)現(xiàn)有問題樣品，使監(jiān)管前移，同時該方法去除基質(zhì)效果良好，靈敏度和準(zhǔn)確度能夠滿足檢測要求。因此，本試驗在充分考慮檢出率和回收率的條件下建立的篩查方法對中獸藥的其他復(fù)雜基質(zhì)具有一定的參考意義。

3.2 篩查方法的比較 在本試驗中使用了分辨率高、選擇性強(qiáng)、準(zhǔn)確定性和優(yōu)勢明顯的軌道阱質(zhì)譜[5]，可同時進(jìn)行高通量的上百種隱性藥物的篩查檢測，一定程度上擴(kuò)充了藥物篩查種類和數(shù)量，與前人做相關(guān)研究的篩查藥物濃度相比較低，篩查目標(biāo)物的二級離子信息匹配由多數(shù)的1個碎片信息滿足定性到該方法的2個碎片信息。又因中藥口服液的樣品特性相對中藥散粉等其他劑型相對簡單，因此，本試驗僅先就口服液進(jìn)行試驗，在前處理去除部分雜質(zhì)干擾的前提下，選擇在實際樣品(獸藥產(chǎn)品)中做外源添加藥物添加，模擬多藥物并存情況下的極限分離效果。并采用Trace Finder篩查軟件建立了170種隱性藥物的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，樣品上機(jī)結(jié)果與篩查數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信息比對，包括母離子、兩個子離子、保留時間與同位素信息的對比，全部符合定性條件即判定為檢出，檢出率滿足分析測定要求。因此本試驗所建立的篩查方法結(jié)果，相對而言更為準(zhǔn)確、可靠。

3.3 改進(jìn)計劃 目前篩查方法基于檢驗的隱性藥物篩查數(shù)據(jù)庫仍在進(jìn)一步擴(kuò)充，數(shù)據(jù)庫藥物種類和數(shù)量陸續(xù)增加和完善，前處理方法也會因藥物種類的增加而進(jìn)一步優(yōu)化，拓寬基質(zhì)考察范圍，優(yōu)化前處理條件，開發(fā)兼容性更強(qiáng)、更高通量的前處理方法是下一步的目標(biāo)。本次試驗方法的建立對提取液和凈化方法進(jìn)行了初步優(yōu)化，對于某些特殊藥物、特殊基質(zhì)的樣品會在今后的實驗中進(jìn)一步開發(fā)和增加進(jìn)來，進(jìn)一步提高實驗的靈敏度和精確度也是需要考慮的，以更加充分發(fā)揮高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢。

本試驗研究建立了一種可應(yīng)用于中獸藥口服液中170種隱性藥物高通量篩查的快速、準(zhǔn)確的定性檢驗方法。該方法可快速鎖定待測樣品中隱性藥物的種類，達(dá)到對中獸藥口服液中隱性藥物的定性信息，高通量液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法篩查水產(chǎn)品藥物殘留可為獸藥企業(yè)監(jiān)控獸藥制劑的質(zhì)量，更為管理部門加強(qiáng)獸藥質(zhì)量監(jiān)控，震懾不法摻假分子提供技術(shù)保障，從源頭上保證動物源性食品的安全。