叢山日，劉紅波，許丹菡，張名，馮昌增，黃小琴，孫浩，楊昭慶，馬紹輝

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650118；2.威海市人力資源和社會(huì)保障局，山東威海5323368

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）主要由腸道病毒（enteroviruses，EV）感染引起的［1］。腸道病毒為單股正鏈RNA病毒，目前分為腸道病毒A~L及鼻病毒A、B、C共15類，包含上百種血清型?？滤_奇病毒A組4型（coxsackievirus A4，CV-A4）屬于A組腸道病毒（EV-A），大多數(shù)CV-A4感染者不會(huì)產(chǎn)生或產(chǎn)生輕微的臨床癥狀，但也可引起急性弛緩性麻痹癥（acute flaccid paralysis，AFP）、皰疹性咽峽炎（herpangina，HA）、無(wú)菌性腦膜炎等多種疾?。?］。腸道病毒71型（EV-71）和柯薩奇病毒A組16型（CV-A16）是引起HFMD的主要病原體［2］，但近年來(lái)，CV-A6、CV-A10和CV-A4等引起的HFMD的比例逐漸上升［3-4］。各腸道病毒引起的HFMD臨床表現(xiàn)類似，難以區(qū)別［5］。

本研究對(duì)2019年云南省分離得到的8株CVA4毒株的VP1核苷酸序列進(jìn)行遺傳特性分析，從而了解CV-A4的流行和變異情況，為該地區(qū)HFMD的防治提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1毒株及細(xì)胞 從2019年昆明市某醫(yī)院根據(jù)《手足口病診療指南（2018）》［6］診斷并收集的HFMD患者的糞便中分離得到CV-A4分離株，隨機(jī)挑選8株進(jìn)行遺傳特征分析；人橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞、人胚肺二倍體KMB-17細(xì)胞和非洲綠猴腎Vero細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室保存并提供。

1.2主要試劑 病毒RNA提取試劑盒Axygen Body Fluid DNA／RNA Miniprep Kit購(gòu)自美國(guó)Axygen公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit購(gòu)自日本Ta-KaRa公司。

1.3病毒分離培養(yǎng) 嚴(yán)格按照《手足口病預(yù)防控制指南（2009版）》［7］的要求進(jìn)行樣品處理和病毒分離。分別將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RD細(xì)胞、Vero細(xì)胞和KMB17細(xì)胞消化制成2×105個(gè)細(xì)胞懸液并接種至24孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)為致密單層后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，對(duì)照組加入500μL細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入500μL由0.22μm濾膜處理過(guò)的病毒液（MOI=0.1），緩慢搖動(dòng)后將細(xì)胞板置恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；病毒完全吸附后，補(bǔ)加1 mL細(xì)胞維持液，繼續(xù)將細(xì)胞板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），置-20℃冰箱進(jìn)行反復(fù)凍融。

1.4病毒RNA提取 按照病毒RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。

1.5引物設(shè)計(jì)及合成 以NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的CV-A4毒株的全基因組序列［GenBank序列號(hào)：105／Taian／SD／2017（MK658832）］為參考序列，利用Primer-BLAST對(duì)引物序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)CV-A4毒株的VP1序列引物。CVA4-VP1F：5′-ATGGGAGCAGGGCAAAAGAA-3′（位置：2 348~2 367），CVA4-VP1R：5′-TGTCGCATCCTTGGGCTGTT-3′（位置：3494~3 475），產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 127 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reser v e transcription-polymerasec h ainreaction，RT-P CR）及病毒血清型鑒定 根據(jù)PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄35 min，94℃預(yù)變性2 min，共35個(gè)循環(huán)：94℃變性0.5 min，54℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，最后72℃再延伸10 min。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，使用Sequencher軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接，利用NCBI BLAST工具對(duì)拼接序列進(jìn)行比對(duì)。參考文獻(xiàn)［8］對(duì)病毒血清型進(jìn)行判定。

1.7序列分析 以參考株的地域來(lái)源和分離時(shí)間為依據(jù)，利用NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出279株國(guó)內(nèi)外病毒參考株（見(jiàn)表1），這些病毒參考株由6個(gè)國(guó)家不同地區(qū)于1949—2019年，從HFMD、急性遲緩性麻痹癥（acute flaccid paralysis，AFP）及HA患者等不同健康狀況的人群中分離而來(lái)。利用Mega 6.06軟件的鄰位拼接法（neighborjoining method，NJ）對(duì)分離株和參考株的VP1序列進(jìn)行分析，根據(jù)文獻(xiàn)［9］構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)圖。使用Geneious 9.0.2軟件對(duì)分離株與參考株的VP1序列進(jìn)行核苷酸一致性和氨基酸同源性分析，將比對(duì)后的VP1核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，與39株國(guó)內(nèi)外CV-A4參考株VP1氨基酸序列進(jìn)行變異位點(diǎn)分析。

表1 部分CV-A4參考株的基本信息Tab.1 Basic information of partial CV-A4 reference strains

續(xù)表1部分CV-A4參考株的基本信息Tab（Continued）.1 Basic information of partial CV-A4 reference strains

2 結(jié)果

2.1CV-A4分離株 從2019年昆明市婦幼保健院收集的459份HFMD患者的糞便中分離得到26株CV-A4分離株中，隨機(jī)挑選8株CV-A4云南分離株進(jìn)行遺傳特性分析，序列已上傳至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。將8株云南分離株分別命名為K38／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱K38，基因登錄號(hào)：MT591569）、K147／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱K147，基因登錄號(hào)：MT591570）、K200／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱K200，基因登錄號(hào)：MT591571）、K216／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱K216，基因登錄號(hào)：MT591572）、E118／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱E118，基因登錄號(hào)：MT591573）、E140／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱E140，基因登錄號(hào)：MT591574）、E176／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱E176，基因登錄號(hào)：MT591575）和E194／YN／CHN／2019（簡(jiǎn)稱E194，基因登錄號(hào)：MT591576）。

2.2完整V P1序列分析 通過(guò)測(cè)序、序列拼接及與參考毒株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，8株CV-A4云南分離株完整VP1序列由915個(gè)核苷酸構(gòu)成，編碼305個(gè)氨基酸。8株CV-A4云南分離株與CVA4／High Point／USA／1949／AF081295（簡(jiǎn)稱原型株）的核苷酸一致性和氨基酸同源性分別為83.4%~84.6%和97.0%~98.0%。與其他國(guó)內(nèi)CV-A4參考株相比，核苷酸一致性和氨基酸同源性分別為87.7%~97.0%和97.7%~99.3%。8株CV-A4云南分離株相互比對(duì)，核苷酸一致性和氨基酸同源性分別為91.0%~99.9%和97.7%~100.0%。其中K38與E194的氨基酸同源性高達(dá)100%，表明這兩株分離株親緣性較近。見(jiàn)表2。

表2 8株CV-A4云南分離株之間及其與其他CV-A4參考株之間的核苷酸一致性和氨基酸同源性對(duì)比分析（%）Tab.2 Comparative analysis of homologies of nucleotides and amino acids between eight CV-A4 Yunnan isolates and other CV-A4 reference strains（%）

2.3氨基酸變異位點(diǎn)分析 與原型株及部分國(guó)外CV-A4參考株VP1氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，8株CVA4云南分離株和大部分中國(guó)參考株氨基酸序列S102A、I262V和Y285H較為保守。本研究的分離株與原型株相比，K38、K200、E140和E194存在6個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)，K147、K216、E118存在8個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)，E176存在9個(gè)氨基酸位點(diǎn)。根據(jù)VP1氨基酸位點(diǎn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，T28V、A34T、S102A、A200T、I262V、Y285H和R303H具有較高的突變頻率。見(jiàn)圖1。2.4V P1序列遺傳進(jìn)化分析 將8株云南分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中279株CV-A4參考株基于完整VP1序列（915 nt）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將CV-A4毒株分為A、B、C、D4個(gè)基因型，其中C組基因型可分為C1~C5 5個(gè)基因亞型：C3亞型由2006年中國(guó)四川和2014年俄羅斯報(bào)道的分離株構(gòu)成；C5亞型由2013年俄羅斯和2016年中國(guó)天津報(bào)道的分離株構(gòu)成；C4亞型主要由印度2011年報(bào)道的分離株構(gòu)成；C1亞型主要由1996—2006年中國(guó)各地區(qū)報(bào)道的分離株構(gòu)成；C2亞型主要由2006—2019年中國(guó)分離株構(gòu)成，C2基因亞型又可以分為分支1、2和3。A組基因進(jìn)化分支由1948年美國(guó)北卡羅來(lái)納州生活污水中分離得到High Point（CV-A4原型株）構(gòu)成，B組基因進(jìn)化分支由1999年非洲東部肯尼亞國(guó)家分離得到的11023.1株構(gòu)成，D組基因進(jìn)化分支由1株日本分離株JR構(gòu)成。本研究中8株云南分離株均屬于C2基因亞型的分支1，見(jiàn)圖2。

圖1 8株云南CV-A4分離株與其他CV-A4參考株VP1氨基酸序列差異分析Fig.1 Difference in amino acid sequences between CV-A4 Yunnan isolates and other CV-A4 reference strains

圖2 CV-A4 VP1基因核苷酸序列的種系進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on CV-A4 VP1 nucleotide sequence

3 討論

腸道病毒屬于小RNA病毒，病毒復(fù)制的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP）缺乏校對(duì)及錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，因此腸道病毒經(jīng)常發(fā)生變異［9-11］。腸道病毒VP1序列具有與病毒血清型對(duì)應(yīng)的遺傳多樣性，通常作為腸道病毒分型及進(jìn)化樹(shù)圖分組的依據(jù)［8］。但由于不同研究選取參考株VP1序列的長(zhǎng)度、數(shù)量、分離年份及地域的不同，導(dǎo)致構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)圖拓?fù)浣Y(jié)果存在差異［12］。史曉燕等［13］選取于2009—2015年報(bào)道的67株CV-A4毒株，將其分為A、B和C 3個(gè)基因進(jìn)化分支，C型基因進(jìn)化分支進(jìn)一步分為C1和C2，C2分為C2a和C2b，中國(guó)分離株主要位于C2b的分支2。本研究參考JI等［9］對(duì)于全球CV-A4毒株的進(jìn)化分支分型標(biāo)準(zhǔn)，選取6個(gè)國(guó)家多個(gè)地區(qū)于1949—2019年分離報(bào)道的279株CV-A4毒株作為參考株，基于完整VP1序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)圖。根據(jù)進(jìn)化樹(shù)圖提示，C1和C3基因亞型主要由1998—2007年中國(guó)報(bào)道的CV-A4毒株構(gòu)成；C2基因亞型主要由2007—2019年中國(guó)報(bào)道的毒株構(gòu)成；C4和C5基因亞型主要由印度和俄羅斯于2011年以后報(bào)道的毒株構(gòu)成的。提示中國(guó)大陸的CV-A4原始株可能為C1和C3基因亞型。2007年后，中國(guó)大陸CV-A4優(yōu)勢(shì)毒株被C2基因亞型的毒株取代，C2亞型進(jìn)一步分化為3個(gè)分支，分支1由2006—2019年中國(guó)多個(gè)地區(qū)報(bào)道的CV-A4分離株構(gòu)成，是我國(guó)CV-A4優(yōu)勢(shì)毒株。本次分離得到的CV-A4毒株屬于C2基因亞型的分支1。本研究更加清晰地展示了全球CV-A4毒株隨時(shí)間和地域遷移產(chǎn)生的差異。

腸道病毒VP1蛋白是重要的中和抗原因子［14-16］。將CV-A4的VP1氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，所有中國(guó)分離株S102A、I262V和Y285H較為保守，產(chǎn)生較為穩(wěn)定的位點(diǎn)突變，提示中國(guó)CV-A4分離株形成了比較穩(wěn)定的地域進(jìn)化特征；中國(guó)CV-A4分離株VP1氨基酸序列同源性高于97.7%，提示其中和抗原位點(diǎn)相對(duì)保守，有利于我國(guó)CV-A4疫苗的研究。

此外，本研究利用RD、KMB-17和Vero細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)3次盲傳，僅RD細(xì)胞出現(xiàn)CPE，提示CV-A4對(duì)于不同細(xì)胞的敏感性存在差異。是否因不同細(xì)胞表面的受體不同，進(jìn)而影響CV-A4在除了RD細(xì)胞外其他細(xì)胞株上的增殖，尚需進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)于CV-A4完整VP1序列進(jìn)行分析，有利于動(dòng)態(tài)了解該地區(qū)CV-A4毒株基因變化情況，擴(kuò)展了CV-A4基因庫(kù)，對(duì)加強(qiáng)CV-A4的監(jiān)測(cè)力度、了解CV-A4在我國(guó)引起的相關(guān)疾病并掌握其遺傳進(jìn)化趨勢(shì)提供了實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。