仇曉飛，林漢亮，羅 金，馬力克·艾則孜，康逢義，倪 軍，羅 毅，劉文閣，馬 站，任巧云，曹潤來，譚陽春，張高峰，刁沛文，王奇林，劉佩雯，關(guān)貴全，羅建勛，殷 宏,5，徐庚全，劉光遠(yuǎn)*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，甘肅蘭州 730046；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830011；4.蘭州市經(jīng)濟作物試驗推廣站，甘肅蘭州 730083；5.揚州大學(xué)江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

蜱(tick)是一種專性吸血的外寄生蟲，以括兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類(包括人)的脊椎動物為宿主，可傳播諸如病毒、立克次體、螺旋體、埃立克體、巴爾通體、巴貝斯蟲、泰勒蟲等多種病原體，作為多種人獸共患病病原的傳播媒介，對人類健康及畜牧業(yè)的發(fā)展造成了重大影響[1-2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，僅蜱傳性血液原蟲病給全球畜牧業(yè)造成的經(jīng)濟損失，每年高達(dá)70億美元。梨形蟲是一種寄生于紅細(xì)胞中的原生動物，形狀類似梨籽，故稱為梨形蟲[3]。梨形蟲通常包括泰勒蟲和巴貝斯蟲。截止目前，我國報道的泰勒蟲主要包括環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulate)、東方泰勒蟲(T.orientalis)、馬泰勒蟲(T.equi)、中華泰勒蟲(T.sinensis)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)、尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)和泰勒蟲未定種(Theileriasp.)等；我國報道的巴貝斯蟲主要包括雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、牛巴貝斯蟲(B.bovis)、卵形巴貝斯蟲(B.ovata)、大巴貝斯蟲(B.major)、東方巴貝斯蟲(B.orientalis)、粗糙巴貝斯蟲(B.crassa)、隱藏巴貝斯蟲(B.occultans)、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)、犬巴貝斯蟲(B.caniscanis)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)和巴貝斯蟲未定種(Babesiasp.)等。泰勒蟲和巴貝斯蟲能引起動物和人的泰勒蟲病及巴貝斯蟲病，統(tǒng)稱這兩種病為梨形蟲病。梨形蟲病在臨床上一般以急性多見，臨床癥狀為高熱、黃疸、貧血、血紅蛋白尿或體表淋巴結(jié)腫脹[4]。梨形蟲病在動物及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易中非常重要，能給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)報道，梨形蟲病對世界許多熱帶和亞熱帶地區(qū)的畜牧業(yè)造成了巨大影響[5]，蜱作為其傳播媒介，對梨形蟲病的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。

新疆維吾爾自治區(qū)(簡稱新疆)是我國最大的內(nèi)陸省份，占國土總面積六分之一，位于西北邊陲。截至目前，新疆報道的蜱種共有9屬45種，且主要傳播無漿體、伯氏疏螺旋體、立克次體、梨形蟲等病原[6-7]。由于新疆地理位置特殊，與蒙古、哈薩克斯坦等8個國家接壤[5]，增加了外來病原跨境傳播的風(fēng)險。作為中國五大牧區(qū)之一，新疆畜產(chǎn)品的國內(nèi)、國際貿(mào)易較為頻繁，這為蜱傳病原的跨境傳播提供了可能[1]，更有可能造成蜱傳病在新疆甚至全國蔓延。因此，有必要對新疆沿邊境廣大地域的蜱傳梨形蟲的種類及其分布特征進行系統(tǒng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱的采集 2019年本實驗室在蜱與蜱傳病活躍季節(jié)的4月份和5月份，對新疆邊境地區(qū)的喀什市、溫宿縣、阿合奇縣、阿圖什市、烏什縣、墨玉縣、皮山縣、阿克蘇市(新疆西北邊境地區(qū))，伊寧市、新源縣、鞏留縣、霍城縣、伊寧縣、尼勒克縣、察布查爾錫伯自治縣、溫泉縣(新疆北部邊境地區(qū))，和布克賽爾蒙古自治縣、塔城市、布爾津縣、富蘊縣、吉木乃縣、哈巴河縣、青河縣、巴里坤哈薩克自治縣及奇臺縣(新疆東北邊境地區(qū))25個縣(市)的蜱進行采集。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 生物安全柜(BSC-1304Ⅱ A2型)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；普通PCR儀(T100型)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；核酸電泳儀(DYY-12型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像儀(AlphaImager HP型)，美國ProteinSimple公司產(chǎn)品；4℃離心機(5417R型)，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；水浴鍋(DK-98-П A型)，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 2×EasyTaqPCR Super Mix預(yù)混酶，全式金公司產(chǎn)品；PGEMR-T Easy 載體，T4 DNA連接酶，Promega公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，TaKaRa公司產(chǎn)品；組織DNA提取試劑盒，QIAGEN公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蜱的鑒定 將采集到的蜱帶回中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 蜱DNA的提取 形態(tài)學(xué)鑒定后的蜱分別用于基因組DNA的提取。將蜱置于750 mL/L酒精中浸泡5 min，棄洗液后加入適量的PBS，渦旋15 s，重復(fù)操作3次。吸水紙吸干蜱表面殘留的液體，加入少許液氮充分研磨，參考組織DNA提取試劑盒的操作說明進行基因組DNA提取，獲得的基因組DNA置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計及PCR擴增 首先采用梨形蟲18S rRNA基因通用引物Piro1-S/Piro3-AS對所有樣品進行擴增，進一步用套式引物PIRO1-A/ PIRO-B進行目的基因的PCR擴增[8]。反應(yīng)體系為50 μL：預(yù)混酶25 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA模板2 μL，滅菌去離子水21 μL。反應(yīng)條件是：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán);最后72 ℃終延伸 5 min。產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(陽性對照所加模板為實驗室已有陽性樣品，陰性對照所加模板為滅菌去離子水)。所有檢測陽性樣品均進行體外克隆、測序。參考OMEGA公司DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物回收?；厥盏腄NA片段與T-easy載體16 ℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，將其均勻涂布在含0.1 moL/L IPTG和X-Gal的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取單克隆菌斑于LB培養(yǎng)基中進行菌液培養(yǎng)。PCR進行復(fù)檢，方法如上所述。陽性克隆送公司測序。

1.2.4 序列比對及進化分析 測序正確的梨形蟲18S rRNA核苷酸序列與GenBank中已發(fā)表的相關(guān)序列(表1)進行多序列比對。采用IQ-Tree軟件ML法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 基于梨形蟲18S rRNA相關(guān)序列信息

2 結(jié)果

2.1 蜱的鑒定及分類

本研究對采集的1 516只蜱經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定后，發(fā)現(xiàn)共有4屬9個種(新疆西北邊境地區(qū)3屬6種、新疆北部邊境地區(qū)4屬5種、新疆東北邊境地區(qū)2屬2種)，分別為革蜱屬的森林革蜱(Dermacentorsilvarum)80只、草原革蜱(D.nuttalli)301只、脛距革蜱(D.pavlovskyi)86只、邊緣革蜱(D.marginatus)48只，璃眼蜱屬的亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)450只、麻點璃眼蜱(H.rufipes)99只、小亞璃眼蜱(H.anatolicum)25只，扇頭蜱屬的血紅扇頭蜱(Rhipicephalussanguineus)377只，血蜱屬的刻點血蜱(Haemaphysalispunctate)50只(表2)。

2.2 蜱攜帶梨形蟲的種類及分布

經(jīng)套式PCR擴增與測序分析結(jié)果顯示，在采集的1 516只蜱中，梨形蟲的攜帶率為27.77%，不同邊境地區(qū)蜱的梨形蟲攜帶率不同，其中，新疆西北邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為25.70%，新疆北部邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為37.47%，新疆東北邊境地區(qū)梨形蟲的攜帶率為18.93%，且皮山縣采集的亞洲璃眼蜱梨形蟲攜帶率最高(80%)，霍城縣采集的刻點血蜱梨形蟲攜帶率次之(78%)，而在尼勒克縣、塔城市、布爾津縣、吉木乃縣和哈巴河縣等地區(qū)所采集的蜱中均未檢測到梨形蟲(表2)。

表2 新疆不同地區(qū)蜱攜帶梨形蟲的檢測結(jié)果

續(xù)表2

2.3 梨形蟲的進化特征分析

通過Blast序列比對發(fā)現(xiàn)，共檢測到9種梨形蟲，包括3種泰勒蟲和6種巴貝斯蟲，分別為綿羊泰勒蟲(T.ovis)、馬泰勒蟲(T.equi)、泰勒蟲未定種(Theileriasp.)，駑巴貝斯蟲(B.caballi)、莫氏巴貝斯蟲(B.motasi)、粗糙巴貝斯蟲 (B.crassa)、隱藏巴貝斯蟲(B.occultans)、犬巴貝斯蟲(B.caniscanis)和巴貝斯蟲未定種(Babesiasp.)。進化樹結(jié)果顯示，本研究所檢測到的蟲種均能與各自的種株聚為一支。其中，T.ovis表現(xiàn)出極高多樣性的特征，不僅新疆區(qū)域內(nèi)存在多種基因型，而且霍城株與埃及株(№KY494648.1)及意大利株(№MT242575.1)同源性為98%以上，與烏什、墨玉及伊寧等縣的同源性較低(圖1)。B.occultans富蘊縣地方株與阿圖什市地方株位于兩個不同分支，其中，富蘊縣地方株與中國新疆株(№KU723564.1)的同源性達(dá)100%，阿圖什市地方株與澳大利亞地方株的同源性(№MN726547.1)也達(dá)100%(圖2)。

圖1 新疆不同地區(qū)蜱攜帶的泰勒蟲分子進化樹

圖2 新疆不同地區(qū)蜱攜帶的巴貝斯蟲分子進化樹

3 討論

梨形蟲是一類蜱傳播性血液寄生蟲，在全國范圍廣泛流行，特別是在西部牧區(qū)對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究調(diào)查顯示，新疆邊境地區(qū)的蜱優(yōu)勢種為亞洲璃眼蜱、血紅扇頭蜱和草原革蜱，但以上蜱種的分布會伴隨氣候變化、動物遷徙等因素而發(fā)生改變，繼而蜱傳梨形蟲的種類也會相繼發(fā)生改變，給相關(guān)梨形蟲病的防控帶來了挑戰(zhàn)。之前的研究顯示，新疆蜱種主要以璃眼蜱屬和革蜱屬為主[9]，與本研究結(jié)果基本一致，但本研究發(fā)現(xiàn)血紅扇頭蜱亦是當(dāng)前新疆的優(yōu)勢蜱種之一，這可能為綿羊泰勒蟲的進一步傳播流行提供了條件。

地理位置以及生態(tài)環(huán)境對蜱的生長繁殖起著決定性作用，可造成蜱傳病原不同地區(qū)差異的特征。新疆北部邊境地區(qū)常年氣候濕潤多雨，多以草地為主，這種環(huán)境有利于蜱的生長繁殖，也為蜱傳病原的存活創(chuàng)造了有利的條件，因而也造成了蜱傳病原攜帶率高的特點。本研究證實，新疆北部邊境地區(qū)蜱主要分為4個屬的5個蜱種，其梨形蟲攜帶率高達(dá)37.47%，高于本研究中27.77%的梨形蟲平均攜帶率。新疆西北邊境地區(qū)有3個屬6個蜱種的滋生，說明這種半干旱地區(qū)的氣候也適宜蜱的寄生，但這種氣候可能導(dǎo)致蜱生長繁殖的高峰期略早于本試驗采集蜱的時間(4月份和5月份)，可能是造成該地區(qū)25.70%的梨形蟲攜帶率低于北部邊境地區(qū)37.47%的攜帶率的原因，但該攜帶率與本研究中27.77%的梨形蟲平均攜帶率相比幾乎相同，仍高于25%，依然不能否認(rèn)該地蜱梨形蟲攜帶率高的事實。新疆東北邊境地區(qū)主要包括2個蜱屬里的2個種，

該地區(qū)梨形蟲攜帶率為18.94%，低于本研究27.77%的平均攜帶率，且低于另外兩個地區(qū)，有幾地甚至未檢測到梨形蟲。該地區(qū)中幾乎所有的地方相比其他兩個地區(qū)氣候寒冷，因此蜱的生長繁殖相對略晚于另外兩個地區(qū)，這可能是造成該地區(qū)蜱梨形蟲攜帶率較低的主要原因，當(dāng)然，也不排除當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)防控措施做的較好的可能性。

本研究在新疆邊境地區(qū)蜱中共檢出了9種梨形蟲，包括3種泰勒蟲(T.ovis、T.equi、Theileriasp.)和6種巴貝斯蟲(B.caballi、B.motasi、B.crassa、B.occultans、B.caniscanis、Babesiasp.)，梨形蟲蟲種的多樣性為后期相關(guān)疾病的防控帶來了挑戰(zhàn)。本次檢測到的3種泰勒蟲，之前在新疆均有過報道，其中T.ovis致病性較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，T.ovis18S rRNA序列多樣性特征明顯，霍城株、埃及株及意大利株處于相同的分類地位，其進化程度早于烏什、墨玉及伊寧等地。新病原的輸入使得其為適應(yīng)環(huán)境變化而導(dǎo)致基因多樣性的出現(xiàn)，這也是造成相同蟲種不同基因型的主要原因之一。另一方面，畜禽貿(mào)易或動物遷徙亦造成了相同蟲株不同地域分布這一特征。此外，在中東等地區(qū)出現(xiàn)的Theileriasp.在本次檢測中也有檢出，說明Theileriasp.已在我國新疆有分布。

巴貝斯蟲作為另外一類重要的梨形蟲病原，其對家畜和人造成了嚴(yán)重危害。自1982年以來，在中國大陸已經(jīng)發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲11種[10]。其中，B.caballi呈世界性分布，在美洲、非洲、亞洲、歐洲、大洋洲均有B.caballi的相關(guān)報道[11]。本研究從森林革蜱、草原革蜱、邊緣革蜱及亞洲璃眼蜱中也檢測到了B.caballi，文獻(xiàn)報道革蜱屬、璃眼蜱屬和扇頭蜱屬是B.caballi的傳播媒介[5]，這與本研究結(jié)果一致。B.caballi在待檢地區(qū)較為普遍，這可能與當(dāng)?shù)伛R屬動物規(guī)?；B(yǎng)殖有著密切的關(guān)系。

B.occultans是一種研究尚少的巴貝斯蟲，Munir A等[12]于2014年首次在土耳其圖蘭扇頭蜱中檢測到B.occultans，Song R等[5]于2017年首次在我國新疆吉木乃縣草原革蜱中檢測到該蟲株。本試驗則分別從新疆阿圖什市采集的小亞璃眼蜱和富蘊縣采集的亞洲璃眼蜱中檢測到B.occultans，且分子進化分析表明，新疆富蘊縣地方株與中國新疆株(№KU723564.1)同源性達(dá)100%，屬于同一分類地位，而新疆阿圖什市地方株與澳大利亞地方株(№MN726547.1)屬同一分支，親緣關(guān)系更近，同源性為100%，而同為新疆區(qū)域來源的富蘊縣地方株與阿圖什市地方株同源性為99.7%，推測親緣關(guān)系較近的不同地方株可能因為環(huán)境差異而導(dǎo)致序列個別堿基的突變。該研究結(jié)果擴展了B.occultans發(fā)生地的范圍及感染蜱種的多樣性。

B.motasi不僅是一種感染羊的重要蜱傳播性梨形蟲，而且可感染人，其傳播媒介主要為刻點血蜱和囊形扇頭蜱[13]。 Hong S H等[14]于2019年從韓國1例死亡病例的人血中檢測出巴貝斯蟲病，最終鑒定該巴貝斯蟲屬于B.motasi；本研究在草原革蜱及麻點璃眼蜱中檢測到B.motasi。賈娜等[15]于2018年在中國東北地區(qū)肩突硬蜱(Ixodespersulcatus)、嗜群血蜱 (Haemaphysalisconcinn)以及蜱叮咬后患者血液中檢測到B.crassa。B.crassa是另外一種可能感染人的巴貝斯蟲，本次在脛距革蜱中檢測到了該蟲種。

值得注意的是，本研究從血紅扇頭蜱、刻點血蜱及麻點璃眼蜱中檢測到T.ovis，而之前的報道顯示，T.ovis的傳播媒介僅為囊形扇頭蜱、森林革蜱和小亞璃眼蜱等[16]。本研究還從草原革蜱中檢測到B.caniscanis，已有研究證實網(wǎng)蚊革蜱是犬巴貝斯蟲的傳播媒介[17]。這些尚未證實的媒介體內(nèi)檢測到的相關(guān)梨形蟲可能為未來新的媒介的發(fā)現(xiàn)提供一定的線索，但因本次所采集的蜱均為半飽血或飽血狀態(tài)，所以也不排除這一結(jié)果可能是蜱機械性攜帶造成的，究竟它們之間是否為實際意義上的生物學(xué)傳播媒介尚待后續(xù)研究證實。

本研究通過對新疆邊境地區(qū)蜱中攜帶梨形蟲的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜱攜帶梨形蟲的情況在當(dāng)?shù)睾芷毡?，特征明顯，攜帶率較高，且存在同時攜帶2種梨形蟲的現(xiàn)象。因環(huán)境或者人為因素造成的蜱種群的改變，可能會引發(fā)新病原的流行。新疆邊境廣大區(qū)域作為我國重要的畜牧業(yè)發(fā)展基地，因其氣候的多樣性及地理位置的特殊性，致使其蜱傳病原具有多樣性的特點。本研究結(jié)果為新疆邊境地區(qū)蜱傳梨形蟲的進一步防控以及相關(guān)措施的制定提供了依據(jù)。