范彩紅 楊磊 楊瀾 穆紅

1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院（天津300192）；2天津市第一中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（天津300192）

宮頸癌是導(dǎo)致全球女性癌癥死亡的第二大原因，每年有50 多萬(wàn)新發(fā)病例，嚴(yán)重?fù)p害著女性的健康，傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療方法效果不盡如人意，因此亟待研究發(fā)展出新的治療方法應(yīng)用于臨床［1］。近些年，隨著對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝的深入探究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的葡萄糖代謝途徑與正常細(xì)胞有顯著差異，基于此提出了“饑餓療法”的概念［2］。營(yíng)養(yǎng)剝奪成為治療腫瘤的一種手段，但研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖缺乏等應(yīng)激條件下，癌細(xì)胞可以利用靈活的代謝程序維持生存能力［3］，這使得營(yíng)養(yǎng)剝奪治療腫瘤的療效不理想，因此探索其耐受機(jī)制，強(qiáng)化腫瘤治療效果極為重要。

自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)容物，回收并利用的機(jī)制［4-5］。一方面，自噬通常被看作是饑餓等應(yīng)激條件下細(xì)胞的一種重要存活機(jī)制，在一定適當(dāng)?shù)乃酱龠M(jìn)細(xì)胞生存［6］；然而另一方面，自噬是細(xì)胞死亡的一個(gè)閾值，強(qiáng)制過(guò)度激活超過(guò)自噬閾值會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］，例如凋亡相關(guān)因子Par-4 誘導(dǎo)人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡［8］。自噬性細(xì)胞死亡（autophagic cell death，ACD）是一種由自噬介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式，具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征，主要表現(xiàn)為自噬體和自溶體在細(xì)胞質(zhì)中的積累。細(xì)胞死亡沒(méi)有表現(xiàn)出凋亡或壞死樣細(xì)胞死亡的特征，可以通過(guò)測(cè)量質(zhì)膜通透性來(lái)評(píng)估，并且可通過(guò)自噬抑制劑或自噬相關(guān)蛋白基因敲除加以抑制［9］。因此，在營(yíng)養(yǎng)缺乏刺激下，促進(jìn)過(guò)度自噬并激活A(yù)CD 似乎是一種新的癌癥治療策略。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22～25 個(gè)核苷酸的小RNA，它們與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］，并且也是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)信號(hào)通路的重要因子［11］。目前，生酮飲食聯(lián)合化療治療腫瘤，能顯著增加化療藥物藥效并減少副作用［12］，但仍存在選擇性差、易產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題，然而基于miRNA的治療靶向性強(qiáng)、精準(zhǔn)度高，能夠更加有效治療腫瘤［13］。但目前關(guān)于miR-130b-3p與饑餓療法的聯(lián)合應(yīng)用以及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)糖饑餓可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生自噬，miR-130b-3p 在防止細(xì)胞發(fā)生過(guò)度自噬過(guò)程發(fā)揮重要作用。本研究新發(fā)現(xiàn)為全面闡明miRNA 調(diào)控腺苷單磷酸激活激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）相關(guān)自噬的分子機(jī)制提供了有用的線索，也為探索miRNA輔助饑餓療法下宮頸癌的治療提供了一些新的見(jiàn)解。

1 材料與方法

1.1 材料宮頸癌Siha、Hela 細(xì)胞（美國(guó)ATCC 公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BDSciences 公司）；凝膠成像分析儀（美國(guó)Alpha Innotech 公司）；LipofectamineTM3000（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；GFP-LC3B 質(zhì)粒（湖南科愛(ài)醫(yī)療器械有限公司）；雷帕霉素、SBI-0206965（美國(guó)默克公司）；p-ULK1 抗體（美國(guó)Abcam 有限公司）；兔抗人腺苷單磷酸激活激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、LC3 抗體（美國(guó)CST 公司）；β-actin、HRP 標(biāo)記羊抗兔抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；PI 檢測(cè)試劑盒（天津三箭生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞在含有8%～10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的MEM 細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。取指數(shù)期細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照所需密度種于孔板中，待細(xì)胞貼壁后，利用LipofectaminTM3000 將miR-130b-3p模擬物、NC、miR-130b-3p抑制物、抑制物NC、pcDNA3.1：：AMPK、pcDNA3.1、pcDNA3.1：：AMPK-wtUTR 和pcDNA3.1：：AMPK-mutUTR、GFPLC3B 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組根據(jù)處理?xiàng)l件，以及轉(zhuǎn)染物質(zhì)的不同分為以下幾組：正常糖含量組與低糖組、低糖+DMSO 組與低糖+雷帕霉素組、NC 組與模擬物組、抑制物NC 組與抑制物組、pEGFP：：wtUTR組和pEGFP：：mutUTR 組、抑制物NC+SBI 組與抑制物+SBI 組、pcDNA3.1 組與pcDNA3.1：：AMPK 組、pcDNA3.1+SBI 組與pcDNA3.1：：AMPK+SBI 組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）用TB Green 進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)miR-130b-3p、內(nèi)參U6、AMPK mRNA、內(nèi)參β-actin mRNA 表達(dá)水平，按公式：Folds=2-ΔΔCt，△△Ct=（Ct1-Ct2）-（Ct3-Ct4），計(jì)算出每組細(xì)胞中基因的相對(duì)表達(dá)水平。miR-130b-3p引物序列U：5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'，D：5'-TGCAATGATGAAAGGGCAT-3'；U6 引物序列F：5'-CGCTTCGGCAGCACAT-3'，R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'；ampk 引物序列F：5'-GCGACAAGCCCACCTGAT-3'，R：5'-ATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'；β-actin 引物序列F：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'，R：5'-TGTCACCTTCACCGTTCCAGT-3'。

1.2.4 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建按照商品使用說(shuō)明（TaKaRa，日本），使用AMPK-RT，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成AMPK mRNA 編碼區(qū)的cDNA，再依次使用兩對(duì)引物akF1、akR1 和akF2、akR2 通過(guò)PCR 擴(kuò)增含有Kozak 序列和AMPK 基因編碼序列的DNA 片段，純化后酶切DNA 片段，連接到pcDNA3.1 載體的KpnI-XhoI 克隆位點(diǎn)，使用T4 DNA 連接酶構(gòu)建pcDNA3.1：：AMPK載體。AMPK-RT：5'-AACAAAGAGGGAGGGAT-3'；AMPK F1：5'-CCGCCACGATGCGCAGACTCAGTTC-3'；R1：5'-TTGCATGGCGCTTTCTGTTTATTGTGCAAG-3'；AMPK F2：5'-CGGAATTCGCCGCCACGATGCG-3'；AMPK R2：5'-CCGCTCGAGGCATGGCGCTTTCTGT-3'

1.2.5 Western blotPBS 清洗6 孔板中細(xì)胞后，加入150 μL RIPA 裂解液，靜置30 min 后，用刮板刮取細(xì)胞蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取總蛋白30 μg 上樣，配制10 %的SDS-PAGE 凝膠分離，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，隨后分別加入一抗，4 ℃過(guò)夜后，TBST 清洗4 次，之后加入二抗室溫孵育1 h，TBST 清洗4 次，最后化學(xué)顯色液顯色，Image J 分析灰度值。

1.2.6 細(xì)胞死亡率檢測(cè)消化收集各組細(xì)胞，加入600 μL 固定液清洗細(xì)胞，100 μL 固定液重懸細(xì)胞，加入PI 染液5 μL，避光孵育5 min，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 GFP-LC3B實(shí)驗(yàn)細(xì)胞（1×105/孔）接種在爬片上并在12 孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，使用LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染GFP-LC3B 質(zhì)粒6 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基48 h 后刺激，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS沖洗3 次。使用熒光顯微鏡拍攝圖像。為了定量，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下至少計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞中GFPLC3B 斑點(diǎn)，并使用Image J 中的共定位工具對(duì)綠色和紅色熒光共定位進(jìn)行定量。

1.2.8 熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)TargetScan、miRDB、PicTar、DIANA 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到miR-130b-3p 與AMPK mRNA3'-UTR 存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，將AMPK mRNA3'-UTR 模擬物及突變體，分別構(gòu)建嵌入到熒光報(bào)告載體pEGFP 下游BamHI-XhoI克隆位點(diǎn)上，該模擬物合成由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。將構(gòu)建好的重組載體質(zhì)粒分別與miR-130b-3p 模擬物及NC 共轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞，48 h后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用GraphPadPrism 8.0 軟件分析并繪圖。在對(duì)照組中獲得的數(shù)據(jù)的平均值被定義為1 或100%，以使不同試驗(yàn)組中表達(dá)的靶基因的水平標(biāo)準(zhǔn)化。用SPSS 16.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布進(jìn)行了驗(yàn)證。不成對(duì)t檢驗(yàn)用于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低糖誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞自噬和耐受與正常糖含量組相比，低糖組細(xì)胞死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，圖1A）；低糖顯著誘導(dǎo)GFP-LC3B斑點(diǎn)的形成（均P＜0.001，圖1B）；與正常糖含量組相比，低糖組LC3 蛋白水平均顯著性增加、p-ULK1（Ser757）蛋白水平顯著降低（均P＜0.001，圖1C）。

圖1 低糖條件下對(duì)宮頸癌細(xì)胞死亡、自噬水平的影響Fig.1 Effects of low glucose on death and autophagy of cervical cancer cells

2.2 過(guò)度自噬誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞死亡與低糖+DMSO組相比，低糖+雷帕霉素組宮頸癌細(xì)胞死亡水平率顯著升高（均P＜0.001，圖2）。

圖2 過(guò)度自噬誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞死亡Fig.2 Excessive autophagy induces death of cervical cancer cells

2.3 低糖條件下miR-130b-3p 和AMPK 變化情況低糖條件下，AMPK 蛋白水平呈現(xiàn)顯著性降低趨勢(shì)（均P＜0.01，圖3A）；RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常糖含量組相比，低糖組AMPK mRNA 顯著性下降；miR-130b-3p 表達(dá)水平顯著性升高（均P＜0.05，圖3B-C）。

圖3 低糖條件下miR-130b-3p、AMPK mRNA 和蛋白水平變化Fig.3 Changes of miR-130b-3p，AMPK mRNA and protein levels under low glucose conditions

2.4 miR-130b-3p 直接靶定AMPK 基因Target-Scan、miRDB、Pic Tar、DIANA 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，miR-130b-3p 與AMPK mRNA 3'-UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，提示AMPK可能是miR-130b-3p的靶基因。與NC 組相比，模擬物組AMPK mRNA水平以及蛋白水平顯著降低（均P＜0.05，圖4B）；而轉(zhuǎn)染抑制物后則趨勢(shì)相反（均P＜0.05）。熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-130b-3p 模擬物可顯著抑制pEGFP：：wtUTR組的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），而對(duì)于pEGFP：：mutUTR 的熒光強(qiáng)度無(wú)顯著影響（P＞0.05，圖4C）。

2.5 miR-130b-3p抑制物誘導(dǎo)ACD與抑制物NC組相比（圖5A），抑制物組死亡率顯著高于對(duì)照組（均P＜0.001）；抑制物NC+SBI 組與抑制物+SBI 組細(xì)胞死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。轉(zhuǎn)染miR-130b-3p抑制物顯著增加GFP-LC3B斑點(diǎn)細(xì)胞的形成（P＜0.01，圖5B）；與抑制物NC組相比，抑制物組LC3蛋白水平顯著升高（均P＜0.05，圖5C）；p-ULK1（Ser757）蛋白水平呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（均P＜0.05）。

圖5 miR-130b-3p 抑制物對(duì)細(xì)胞自噬和死亡的影響Fig.5 Effects of miR-130b-3p inhibitor on autophagy andcell death

2.6 AMPK 誘導(dǎo)ACD與pcDNA3.1 組相比（圖6A），pcDNA3.1：：AMPK 組的死亡率顯著增加（均P＜0.01）；pcDNA3.1+SBI 組與pcDNA3.1：：AMPK+SBI 組細(xì)胞死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。過(guò)表達(dá)AMPK 顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3B斑點(diǎn)的形成（P＜0.01，圖6B）；與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1：：AMPK 組LC3 蛋白顯著升高（均P＜0.01，圖6C）；p-ULK1（Ser757）顯著性降低（P＜0.01）。

圖6 過(guò)表達(dá)AMPK 對(duì)細(xì)胞自噬和死亡的影響Fig.6 Effects of overexpression of AMPK on cell autophagy and death

3 討論

研究表明不同類型腫瘤細(xì)胞的低糖耐受能力是不同的，低糖條件雖然可以加速腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡［14］，但并不會(huì)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生死亡［15］，為了檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞是否存在低糖耐受現(xiàn)象，本研究采用低糖刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌Siha 和Hela 細(xì)胞死亡率無(wú)差異，這證明其也存在低糖耐受現(xiàn)象。有研究報(bào)道［16］稱在葡萄糖缺乏的應(yīng)激過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)抑制mTOR 表達(dá)從而激活自噬。低糖條件下，在宮頸癌細(xì)胞中，本研究也發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3、GFP-LC3B 斑點(diǎn)顯著增加，這些結(jié)果表明，葡萄糖饑餓同樣會(huì)引起宮頸癌細(xì)胞的自噬。然而，眾所周知自噬是把“雙刃劍”，適當(dāng)程度的自噬，有助于細(xì)胞生存，但過(guò)度的自噬就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，即ACD 的發(fā)生。在多骨髓瘤細(xì)胞中，高水平的自噬可導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶非依賴性自噬細(xì)胞死亡［17］。為進(jìn)一步驗(yàn)證過(guò)度自噬是否同樣誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞ACD，本研究采用饑餓與雷帕霉素聯(lián)合刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞LC3 蛋白、GFP-LC3B 斑點(diǎn)顯著增加，細(xì)胞死亡率也顯著增加，這也說(shuō)明了過(guò)度自噬同樣可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞ACD 的發(fā)生。

葡萄糖缺乏等應(yīng)激條件下，會(huì)激活多種上游信號(hào)通路參與自噬調(diào)節(jié)，包括AMPK/mTOR。AMPK是真核細(xì)胞中最重要的分子能量傳感器之一，其在維持能量穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用［18］，一方面，AMPK磷酸化激活位點(diǎn)Thr172 活化后，通過(guò)抑制ULK1 抑制性磷酸化位點(diǎn)Ser757 的活化促進(jìn)自噬誘導(dǎo)；另一方面，AMPK 負(fù)性調(diào)節(jié)mTOR 誘導(dǎo)自噬，然而AMPK 的持續(xù)激活導(dǎo)致糖酵解和葡萄糖氧化的解偶聯(lián)，增加胞漿蛋白水平和酸中毒，并引起過(guò)度自噬至有害水平，誘導(dǎo)ACD 的發(fā)生［19］。本研究中，低糖條件下，AMPK mRNA 以及蛋白表達(dá)量水平降低表明AMPK 可能參與到糖饑餓下自噬性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)，為更直觀地證明關(guān)于AMPK 作用猜想，筆者過(guò)表達(dá)AMPK 發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)低糖下細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且這種死亡可以被自噬抑制劑SBI-0206965 所逆轉(zhuǎn)，因此AMPK 的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞過(guò)度自噬進(jìn)而導(dǎo)致ACD，低表達(dá)水平的AMPK 抑制了宮頸癌細(xì)胞ACD。

miRNAs 通過(guò)靶向不同信號(hào)通路中的基因，與ACD 調(diào)節(jié)過(guò)程密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-20b抑制劑后，抑制METTL3 的表達(dá)，從而誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞的ACD［20］，miR-22-3p 的過(guò)度表達(dá)抑制凋亡蛋白IAP 的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬細(xì)胞引起的死亡［21］。本研究中，低糖條件下，miR-130b-3p 水平升高，這表明miR-130b-3p 可能也參與到糖饑餓下自噬性細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)。因此轉(zhuǎn)染miR-130b-3p 抑制物后，降低miR-130b-3p 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞自噬顯著升高，細(xì)胞死亡率顯著增加，并且這種死亡可以被自噬抑制劑SBI-0206965 所逆轉(zhuǎn)，因此抑制miR-130b-3p 的表達(dá)可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞過(guò)度自噬促進(jìn)細(xì)胞ACD 的發(fā)生。此外，miRNAs 通過(guò)與靶基因3'UTR 區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)水平。有趣的是，在本研究中利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)到AMPK 3'UTR 中miR-130b-3p 的假定靶定位點(diǎn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證二者靶定關(guān)系，分別轉(zhuǎn)染了miR-130b-3p 模擬物和抑制物，miR-130b-3p 模擬物降低AMPK mRNA 和蛋白水平，miR-130b-3p 抑制物則趨勢(shì)相反，這些結(jié)果說(shuō)明二者有靶定關(guān)系。miR-130b-3p 模擬物導(dǎo)致編碼野生型3'UTR 的DNA 序列的報(bào)告基因表達(dá)水平下降，但沒(méi)有3'UTR 序列或編碼突變型3'UTR 的序列的報(bào)告基因水平?jīng)]有明顯下降，這進(jìn)一步說(shuō)明了miR-130b-3p 與AMPK具有直接靶定關(guān)系。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p 下調(diào)AMPK 的表達(dá)，抑制過(guò)度自噬誘導(dǎo)的ACD，實(shí)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞低糖下的生存。本研究強(qiáng)調(diào)了miRNA 在宮頸癌治療中的重要作用，為輔助饑餓療法治療宮頸癌提供新的參考。目前，饑餓療法還未廣泛應(yīng)用臨床治療，miRNA 作為治療靶點(diǎn)治療腫瘤仍僅限于少數(shù)癌癥種類，故miRNA 輔助饑餓療法仍有很長(zhǎng)的路要走。