朱 蘭，孫利民，袁躍云，洪瓊花，馬興躍*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.云南省畜牧總站，昆明 650224）

蘭坪長毛山羊，又名蓑衣山羊，屬肉用山羊品種，分布在云南省蘭坪縣境內(nèi)海拔2 500～3 000 m范圍的山區(qū)及半山區(qū)，四肢粗壯結(jié)實，耐寒，有較強(qiáng)的適應(yīng)性，耐粗飼，合群性好，多于夏秋二季發(fā)情，雙羔率30%左右，屠宰率約為42.5%。蘭坪長毛山羊在本地有悠久的飼養(yǎng)歷史，當(dāng)?shù)厝罕娤灿醚蚱ぶ谱餮蚱す幼?，有御寒和勞保作用。但長久以來該品種未被重視，沒有經(jīng)過選種選育和提純復(fù)壯，飼養(yǎng)數(shù)量較少，將會面臨品種資源流失的威脅。

微衛(wèi)星DNA廣泛存在于基因組中，單元長度2～6 bp，串聯(lián)成簇，被稱為短串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星具有多態(tài)信息豐富、特異性良好、保守性強(qiáng)、檢測方法簡便快速等特點，利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，在進(jìn)行遺傳多樣性評價，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，群體遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析等研究中有著廣泛的應(yīng)用，是一種可靠的分子標(biāo)記[1]。Sollero[2]等人用微衛(wèi)星研究了巴西豬的遺傳多樣性，Jawasreh[3]研究不同綿羊群體的遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)，呂曉陽[4]、汪志國[5]等人用微衛(wèi)星研究了不同山羊的遺傳關(guān)系，為山羊遺傳育種提供了重要依據(jù)，但蘭坪長毛山羊的遺傳多樣性研究未見報道。

本研究從分子水平上利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)檢測蘭坪長毛山羊的遺傳多樣性，分析該品種與10個云南本地山羊群體及波爾山羊群體的遺傳關(guān)系，由此對蘭坪長毛山羊的遺傳背景進(jìn)行科學(xué)的評價，為該品種進(jìn)一步提高選育水平和開發(fā)利用提供分子水平的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

本試驗共采集蘭坪長毛山羊（CP）血液樣品25份。其余11個山羊群體血液樣品637份，其中威信白山羊（B）52只，彌勒紅骨山羊（HG）62只，龍陵黃山羊（LH）59只，馬關(guān)無角山羊（MG）60只，圭山山羊（GS）62只，云嶺山羊（YL）59只，寧蒗黑頭山羊（NL）59只，師宗黑山羊（SZ）60只，昭通山羊（Z）51只，羅平黃山羊（LP）60只，波爾山羊（BE）52只。血液樣品采集使用5 mL EDTA-K2真空抗凝采血管，每只實驗羊采集3～4 mL，標(biāo)注編號后保存于-20℃冰箱備用。

1.2 實驗試劑

DNA血液提取試劑盒Blood DNA Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司，Taq酶、dNTP、10×Buffer購自大連寶生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 微衛(wèi)星引物

本實驗引物參考山羊微衛(wèi)星相關(guān)研究文獻(xiàn)[6-9]，通過預(yù)實驗篩選擴(kuò)增效果好的14對微衛(wèi)星引物。引物由上海生物工程有限公司合成，上游引物的5’端用熒光修飾標(biāo)記（HEX），引物名稱、引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度如表1所示。

表1 微衛(wèi)星引物信息

1.4 DNA提取與檢測

根據(jù)Omega blood DNA kit操作程序從樣本血液中提取DNA，獲得的DNA溶液保存于-20℃冰箱中。

1.5 PCR擴(kuò)增及檢測

PCR反應(yīng)體系總量20μL，體系內(nèi)試劑及其含量如下：10×buffer(Mg2+)2μL，dNTPMixture（2.5 mmoL/L）1.6μL，上、下游引物（1 pmoL/L）各1μL，DNA溶液（10～20 ng/μL）2μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2μL，dH2O 12.2μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，退火30 s（具體退火溫度見表1），72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠初步檢測合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010軟件整理蘭坪長毛山羊等群體微衛(wèi)星等位基因數(shù)據(jù)，通過GeneAlex6.01軟件[10]計算等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei氏遺傳距離、基因流（Nm）、遺傳變異系數(shù)（Fst）、哈迪-溫伯格平衡等數(shù)據(jù)，用CERVUS 3.0軟件計算多態(tài)信息含量（PIC），用MEGA 7.0[11]構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)聚類圖，用Structrue軟件[12]構(gòu)建遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘭坪長毛山羊微衛(wèi)星位點檢測分型

蘭坪長毛山羊25個樣本14個微衛(wèi)星位點毛細(xì)管熒光電泳檢測共獲得350個檢測結(jié)果，顯示所有檢測結(jié)果片段大小符合預(yù)期，具有可靠性（見圖1）。

圖1 BM3033位點毛細(xì)管峰電泳分型結(jié)果圖

2.2 蘭坪長毛山羊等位基因多樣性

通過對蘭坪長毛山羊14個微衛(wèi)星位點分析，共檢測出85個等位基因，平均每個位點6.071個，片段大小在125 bp～265 bp之間，基因頻率在0.02～0.82之間（見表2）。

蘭坪長毛山羊群體中，14個微衛(wèi)星位點的有效等位基因數(shù)（Na）在3～9之間，最大的位點是OARFCB304和BM6526，最小是BM28。Ne在1.462～6.313之間，最高的位點為OARFCB304，最低為OARRHH55。Ho在0.120～0.760之間，最高位點為MAF65，最低位點為OARRHH55；He為0.316～0.842，最高位點為OARFCB304，最低位點為OARRHH55。I在0.662～1.964之間，最高位點為BM3033，最低位點為BMS574。PIC在0.300～0.822之間，最高位點為OARFCB304，最低位點為OARRHH55，其中位點BM28和OARRHH55PIC值大于0.25小于0.05，其余位點PIC值均大于0.05（見表3）。

14個微衛(wèi)星位點經(jīng)哈迪-溫伯格平衡檢驗后發(fā)現(xiàn)，BM1329、BM1818、BM6526、BMS1678、BM28、OARAE129、BMS574、MAF65等8個位點偏離不顯著，OARFCB304、OARRHH55、BM30333個位點偏離哈-溫平衡極顯著（P＜0.001），F(xiàn)CB48、BM6404 2個位點偏離非常顯著（P＜0.01），MAF0070位點偏離顯著（P＜0.05）。

表2 蘭坪長毛山羊14個微衛(wèi)星位點的等位基因片段大小及頻率

表3 蘭坪長毛山羊14個微衛(wèi)星位點的遺傳變異參數(shù)

2.3 群體遺傳多樣性分析

蘭坪長毛山羊與云南10個地方山羊群體以及參考群波爾山羊的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析，由表2可知，12個山羊群體Na值在5.857～8.643之間，最小的為威信白山羊群體，最大為師宗黑山羊群體，蘭坪長毛山羊群體的Na值為6.071；Ne值在3.16～3.791之間，最小的為威信白山羊群體，最大的為師宗黑山羊群體，蘭坪長毛山羊群體值為3.323；Ho值在0.543～0.709之間，最小的為蘭坪長毛山羊群體，最大的為寧蒗黑頭山羊群體；He值在0.629～0.714之間，最小的為威信白山羊群體，最大的為寧蒗黑頭山羊群體，蘭坪長毛山羊群體為0.658；PIC值在0.581～0.677之間，最小的為威信白山羊群體，最大的為師宗黑山羊群體，蘭坪長毛山羊群體為0.618；I值在1.250～1.546之間，最小的威信白山羊群體，最大的為師宗黑山羊群體，蘭坪長毛山羊值為1.356（見表4）。

表4 蘭坪長毛山羊群體與11個山羊群體遺傳多樣性比較

續(xù)表

2.4 群體間遺傳分析

蘭坪長毛山羊與波爾山羊群體遺傳距離最大，與寧蒗黑頭山羊群體距離最小；與寧蒗黑頭山羊群體遺傳一致度最高，與波爾山羊遺傳一致度最低；與寧蒗黑頭山羊群體的基因流一致度最高，與波爾山羊間的基因流一致度最低；與波爾山羊間的Fst值一致度最高，與寧蒗黑頭山羊群體間的Fst值一致度最低（見表5）。

表5 蘭坪長毛山羊與11個山羊群體間的遺傳關(guān)系分析

根據(jù)聚類圖（圖2）所示，蘭坪長毛山羊群體與其它云南省山羊群體距離較遠(yuǎn)，單獨(dú)為1支，云南省其它地方群體為一只。波爾山羊單獨(dú)聚為一支。

圖2 12個山羊群體遺傳距離UPGMA聚類圖

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)

應(yīng)用STRCTURE軟件，通過貝葉斯聚類方法，分析云南省12個地方山羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)。根據(jù)下列公式：

計算ΔK值，并繪制K值對應(yīng)的ΔK值的變化趨勢曲線圖，結(jié)果可知，當(dāng)K值為7時，ΔK達(dá)到最大（圖3），因此推測本研究的所有山羊個體最優(yōu)分組為7個理論群體（圖4）。

圖3 基于不同K值假設(shè)的LnP（D）值和ΔK值計算結(jié)果

圖4 在K=7假設(shè)下云南省12個山羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)圖

3 討論

等位基因（Na）是衡量微衛(wèi)星位點多態(tài)性的重要參數(shù)，本研究選擇的14個微衛(wèi)星位點，除BM28外，蘭坪長毛山羊在各微衛(wèi)星位點的Na值均在4個以上，平均Na值為6.071，說明所選微衛(wèi)星位點可用于遺傳多樣性評估。本實驗中Na與Ne的絕對值在0.92～4.024之間，等位基因在該群體中的分布并不均勻，這是由于蘭坪長毛山羊受到了地理隔離或者人工選擇的影響。哈迪-溫伯格定律是指在理想狀態(tài)下，各等位基因的頻率在遺傳中保持基因平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)在蘭坪長毛山羊群體中有部分位點不處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)，可能是在人工選擇的過程中造成部分雜合子缺失，一些遺傳信息被淘汰而造成哈迪-溫伯格平衡偏離的現(xiàn)象。

多態(tài)信息含量（PIC）是衡量基因遺傳變異程度的重要指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時，該位點為高度多態(tài)性，0.5 >PIC>0.25時為中度多態(tài)性，PIC<0.25時為低度多態(tài)性[13]。本次研究中選擇的14個微衛(wèi)星位點中，除BM28和OARRHH55屬于中度多態(tài)位點，其余位點均為高度多態(tài)位點。其中OARFCB304的PIC值最高（0.822），提供的遺傳信息最多。雜合度的高低與其相關(guān)多態(tài)信息含量值呈正比，本實驗所選擇的微衛(wèi)星位點的平均Ho和He值均大于0.5，群體具有一定的遺傳多樣性。Fis值反映的是群體內(nèi)的基因異質(zhì)化程度，即近交程度。Fis為正值時，表面群體內(nèi)存在近交；反之，F(xiàn)is為負(fù)值時，群體存在遠(yuǎn)交[14]。根據(jù)研究結(jié)果，蘭坪長毛山羊的平均Ho值小于He值，F(xiàn)is為正值，群體存在雜合體缺失，近交和人工選擇對群體的遺傳多樣性有一定影響。

Shannon指數(shù)值可以反映群體的遺傳變異程度[15]，本次研究的14個位點除BM28外，其余位點I值都大于1，群體總的I值也大于1，說明蘭坪長毛山羊雖具有較為豐富的遺傳多樣性，但該群體可能受人工育種的影響較云南省其余山羊群體更大。

通過與云南省其它山羊群體的遺傳多樣性比較發(fā)現(xiàn)，蘭坪長毛山羊的Na、Ne、He、I、PIC值僅高于威信白山羊，低于其余11個群體，Ho值甚至低于威信白山羊，說明該品種的遺傳多樣性在云南省的地方山羊群體中并不高。本實驗的群體遺傳多樣性參數(shù)與國內(nèi)其它研究結(jié)果略有差異。張愛玲[16]等人利用微衛(wèi)星分析6個山羊品種的遺傳多樣性，平均PIC值在0.6859～0.7083之間；張娜娜[17，18]利用微衛(wèi)星分析伏牛白山羊的遺傳多樣性，平均PIC值為0.789，太行山黑山羊的平均PIC值為0.781。本實驗中12個山羊群體的平均PIC值在0.581～0.677之間，均大于0.5，群體具有較強(qiáng)的遺傳多樣性，與上述學(xué)者研究結(jié)果相比多態(tài)信息含量略低，但比呂曉陽（2016）等人的對2個山羊品種的遺傳多樣性研究結(jié)果略高（平均PIC值0.3110～0.4115），與趙艷紅[19]等人對中國6個山羊群體的遺傳多樣性研究結(jié)果接近（平均PIC值0.533～0.639）。本實驗中云嶺黑山羊的平均PIC值為0.613，低于賈小姣[20]、蘭蓉[21]、武志娟（2013）等人的研究結(jié)果（PIC值0.6856～0.865）；參考群體波爾山羊PIC值為0.644，比凌英會[22]、李國紅[23]等人的研究結(jié)果也略低（PIC值0.671～0.766）。這一方面與所采集樣本的群體不同有關(guān)，另一方可能是本次實驗選用的微衛(wèi)星位點與其他研究不同造成的。

Fst值用于衡量群體間的遺傳分化程度。根據(jù)Wright[24]的研究結(jié)果，F(xiàn)st值在0.15～0.25之間的時候，群體間為高度分化。蘭坪長毛山羊與云南省其它山羊群體間的Fst值均超過0.15，群體高度分化，具有明顯獨(dú)立的品種特征。Wright認(rèn)為，群體間的Nm數(shù)值大于1時，能夠抑制遺傳漂變引起的群體間遺傳分化；反之，當(dāng)Nm數(shù)值＜1時，表明基因交流較小，群體有可能受遺傳漂變影響從而走向分化。蘭坪長毛山羊與其它群體的基因流均大于1，這其中與寧蒗黑頭山羊的基因交流一致度最大，這與兩個山羊群體所在的地理位置相對靠近的實際情況相符合。Nei氏遺傳距離和遺傳一致度的計算結(jié)果也顯示出，蘭坪長毛山羊與寧蒗黑頭山羊之間具有更為接近的遺傳距離和更高的一致度。根據(jù)聚類圖分析，蘭坪長毛山羊與波爾山羊群體分化明顯，說明本次試驗以波爾山羊作為參照群所取得的數(shù)據(jù)較為可靠，符合生產(chǎn)育種背景。蘭坪長毛山羊與云南省其它山羊群體分為獨(dú)立的兩個分支，表明其與云南省地方山羊群體的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，有相對獨(dú)立的遺傳背景。通過STRUCTURE軟件分析所有山羊群體，發(fā)現(xiàn)云南省13個山羊群體劃分為7個理論群，其中蘭坪長毛山羊、波爾山羊兩個品種顏色相對獨(dú)立，威信白山羊、龍陵黃山羊、羅平黃山羊、寧蒗黑頭山羊、師宗黑山羊、云嶺山羊、昭通山羊的群體相互之間有顏色交叉的情況，圭山山羊、彌勒紅骨山羊、馬關(guān)無角山羊三個群體的遺傳背景基本相近，這與聚類分析的結(jié)果類似。

4 結(jié) 論

本研究選取的14個微衛(wèi)星位點可用于蘭坪長毛山羊的遺傳多樣性評估，結(jié)果表明，蘭坪長毛山羊具有一定的遺傳多樣性和相對獨(dú)立的品種特征、地理隔離和人工選擇對群體遺傳結(jié)構(gòu)豐富程度有一定負(fù)面影響，因此，需加強(qiáng)蘭坪長毛山羊品種保護(hù)，適當(dāng)擴(kuò)大群體結(jié)構(gòu)，以豐富品種內(nèi)的遺傳結(jié)構(gòu)，提高種群的內(nèi)在活力。研究結(jié)果為正確評估蘭坪長毛山羊的品種價值，以及今后制定合理可行的保種方案提供分子水平的遺傳學(xué)依據(jù)。