宋娜娜，李響明*，周永妍，張睿智，丁艷譜，楊 琴，孫勝斌，3，姜國(guó)志，3

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.河北省中藥注射液工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430)

冠心寧注射液為黃棕色至棕紅色的澄明液體，為供臨床靜脈滴注的濃溶液，由丹參、川芎水提精制而成的滅菌水溶液[1]。具有活血化瘀、通脈養(yǎng)心的功效，用于冠心病心絞痛的治療?，F(xiàn)代藥理研究表明，冠心寧注射液具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)冠脈側(cè)支循環(huán)，增加冠脈血流量，降低心肌耗氧量，耐缺氧，增加心肌收縮力，減慢心率，改善心臟功能，改善心肌缺血，改善微循環(huán)、抑制血液凝固、促進(jìn)纖溶、改善血流變的作用[2-3]，臨床應(yīng)用越來越廣泛。

中藥制劑化學(xué)成分復(fù)雜，含有一定量的金屬離子，在金屬離子的催化作用下可發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，從而影響制劑的穩(wěn)定性。因此，在冠心寧注射液生產(chǎn)中常添加金屬絡(luò)合劑依地酸二鈉，以減緩金屬離子的影響，維持制劑的穩(wěn)定。冠心寧注射液的使用方式為靜脈滴注，臨床風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大，因此對(duì)添加的輔料要求較高。目前未見針對(duì)冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道。為全面真實(shí)地反映生產(chǎn)企業(yè)輔料的用量，探索貯存期內(nèi)輔料的變化規(guī)律，切實(shí)保障廣大患者的用藥安全，有必要研究開發(fā)一種適用于冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的測(cè)定方法。

中國(guó)藥典測(cè)定硫代硫酸鈉含量的方法有碘量法[4]、滴定法[5]，滴定液的配制和標(biāo)定要求嚴(yán)格，且耗時(shí)較長(zhǎng)。而中藥注射液自身顏色較重，對(duì)以顏色變化判斷滴定終點(diǎn)的方法有干擾；再者中藥注射劑中除已知成分和輔料外，還有很多未知成分，增加了準(zhǔn)確測(cè)定的難度。因此，本研究建立了測(cè)定冠心寧注射液中依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于冠心寧注射液中輔料的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，QuatPump泵，DAD檢測(cè)器，全自動(dòng)進(jìn)樣器，Agilent OpenLAB 2.3色譜工作站。

1.2 試劑及試藥

二水合乙二胺四乙酸二鈉(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn))；40%四丁基氫氧化銨溶液(薩恩化學(xué)試劑股份有公司)；三氯化鐵(分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司生產(chǎn))；甲酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；水為純化水。冠心寧注射液由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

XB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Serial No.6042312(Shimadzu，Inc.)；C18保護(hù)柱(5 μm，10 mm×4.6 mm，Alltech)。流動(dòng)相含3.0%甲醇和0.1%甲酸的水溶液(用40%四丁基氫氧化銨溶液調(diào)pH=3.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：40 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取二水合乙二胺四乙酸二鈉對(duì)照品27.54 mg置25 mL棕色容量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密吸取冠心寧注射液4 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入10 mg/mL三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方制備缺依地酸二鈉陰性制劑，按“2.3”項(xiàng)下的方法制備，即得。

2.5 專屬性

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果顯示陰性對(duì)照無干擾，說明該方法專屬性較強(qiáng)。見圖1。

圖1 陰性樣品溶液與供試品溶液色譜

2.6 線性

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.4、0.6、1.0、1.6、1.8、2.0 mL置2 mL棕色量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，制成20.00、30.00、50.00、80.00、90.00、100.00 μg/mL的對(duì)照品溶液，以各對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=24.405x-71.264，r=0.999 9。表明依地酸二鈉在20.00～100.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 依地酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 穩(wěn)定性考察

分別取對(duì)照品溶液和冠心寧注射液(180715A2)按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)連續(xù)測(cè)定，結(jié)果表明對(duì)照品溶液與供試品溶液各峰峰面積的RSD分別為0.53%、1.05%，均<2%，說明對(duì)照品與供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 精密度試驗(yàn)

2.8.1 進(jìn)樣精密度 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，依法測(cè)定，計(jì)算對(duì)照品峰面積的RSD為0.54%，<2.0%。

2.8.2 重復(fù)性試驗(yàn) 平行取批號(hào)為180715A2的冠心寧注射劑6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液，每份進(jìn)樣1次，連續(xù)測(cè)定，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算得依地酸二鈉平均含量為0.129 1 mg/mL，RSD為2.57%，說明該方法重復(fù)性良好。見表1。

表1 依地酸二鈉含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)

2.8.3 中間精密度 由另一名分析人員在不同日期按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下方法重新配制6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，共12份樣品的測(cè)定結(jié)果表明，兩組12次測(cè)定結(jié)果RSD均<5.0%，說明該方法精密度良好。見表2。

表2 依地酸二鈉含量測(cè)定中間精密度試驗(yàn)

2.9 加樣回收試驗(yàn)

精密量取冠心寧注射液2.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加入0.099 5 mg/mL的乙二胺四乙酸二鈉對(duì)照品溶液2.6 mL，再加入10 mg/mL的三氯化鐵溶液0.3 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min濾過，共平行操作6份。根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算總含量，再減去注射液樣品中依地酸二鈉含量，其差值除以加入的相應(yīng)對(duì)照品含量，得回收率。計(jì)算所得的平均回收率(%)及RSD(%)見表3。

表3 依地酸二鈉含量測(cè)定加樣回收試驗(yàn)

2.10 檢測(cè)限與定量限

選擇適宜濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣，使得信噪比為3∶1，計(jì)算對(duì)照品的進(jìn)樣量，即得檢測(cè)限；信噪比為10∶1時(shí)，計(jì)算對(duì)照品的進(jìn)樣量，即得定量限。依地酸二鈉的檢測(cè)限為0.54 ng，定量限為1.6 ng。

2.11 耐用性

分別考察不同色譜柱(XB-C18、Kromasil C18、Phenomenex Gemini-C18)、不同柱溫(20、25、30 ℃)、不同流速(0.8、0.9、1.0 mL·min-1)、不同pH值(3.0、3.5、4.0)以及不同濃度甲酸溶液(0.1%、0.13%、0.15%)的流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨上述色譜條件的改變，各色譜峰的分離度變化不大，說明該方法的耐用性較好。

2.12 注射液中依地酸二鈉的含量測(cè)定

精密量取每批冠心寧注射液4.0 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行2次，根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算依地酸二鈉含量。見表4。

表4 10批注射液中依地酸二鈉的含量測(cè)定

3 討論

目前測(cè)定依地酸二鈉含量的研究或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中多采用滴定法和比色法。但這兩種方法很難分辨依地酸二鈉螯合物和其他物質(zhì)形成的螯合物，專屬性相對(duì)較差，對(duì)測(cè)定結(jié)果有干擾，故本研究考慮采用專屬性較高的HPLC法[6-8]。HPLC法測(cè)定含量是通過檢測(cè)依地酸二鈉的金屬螯合物來實(shí)現(xiàn)定量的。

依地酸二鈉可與色譜柱的不銹鋼表面發(fā)生作用，致使依地酸二鈉的響應(yīng)值低，且峰形嚴(yán)重拖尾，依地酸二鈉易與金屬離子螯合形成穩(wěn)定的水溶性螯合物。綜上，本研究首選使其與金屬離子形成螯合物再測(cè)定含量，不僅成功避免了依地酸二鈉對(duì)色譜柱的損害，還提高了檢測(cè)靈敏度，改善了峰形。有研究指出依地酸二鈉與三價(jià)鐵離子形成的螯合物穩(wěn)定系數(shù)較高[7]，故本研究采用硫酸鐵溶液、三氯化鐵溶液與依地酸二鈉和鐵離子形成穩(wěn)定的螯合物，且該螯合物具有穩(wěn)定的紫外吸收，在258 nm處有最大吸收。目前采用高效液相色譜法測(cè)定注射劑中依地酸二鈉含量的研究，多為化藥制劑[9-11]，關(guān)于中藥注射液產(chǎn)品中該輔料的報(bào)道不多。本研究所用方法可以準(zhǔn)確測(cè)定冠心寧注射液中依地酸二鈉的含量，可作為評(píng)價(jià)該輔料投料準(zhǔn)確性的一種技術(shù)手段，也為進(jìn)一步探索該輔料在有效期內(nèi)的變化規(guī)律提供了參考依據(jù)，為該產(chǎn)品的輔料控制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究通過全面的方法學(xué)驗(yàn)證，建立了可靠、高效、專屬性強(qiáng)的測(cè)定冠心寧注射液中輔料依地酸二鈉含量的高效液相色譜法，為冠心寧注射液的全面質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)，同時(shí)也為其他含依地酸二鈉制劑的質(zhì)量控制研究提供了思路。