李 季， 張 苑， 王玉玉

(陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

糖尿病是一種由胰島素分泌不足而引起的葡萄糖代謝疾病.據(jù)統(tǒng)計，截至2000年全球糖尿病患者約為1.71億人，預(yù)計2030年將達到3.66億人[1].因此，開發(fā)快速、靈敏、選擇性和可靠的葡萄糖監(jiān)測方法在臨床診斷、食品工業(yè)和生物技術(shù)中具有重要意義[2].目前有各類傳感器檢測葡萄糖，如電化學(xué)生物傳感器[3]、表面增強拉曼散射[4]、化學(xué)發(fā)光[5]、電化學(xué)晶體管生物傳感器[6]、電位測量傳感器[7]、電化學(xué)發(fā)光生物傳感器[8]和熒光生物傳感器[9]等.其中，熒光生物傳感器以其簡單、快速、靈敏、成本低、便攜等優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用.熒光傳感器可分為兩類：酶基和非酶基葡萄糖生物傳感器[10].但酶基生物傳感器由于成本高、操作條件高等缺點限制了其應(yīng)用.為了克服這些問題，需開發(fā)一種無酶、耐受性強的低成本葡萄糖生物傳感器.

硼酸鹽可與碳水化合物、維生素、輔酶和核糖核酸形成穩(wěn)定的配合物[11].由于硼酸配體對鄰二醇類化合物具有高選擇性親和力，因此，常用于對糖類和糖基化的有效識別[12].Ouyang等[13]制備了一種形貌可控的硼酸衍生物聚苯胺仿生納米結(jié)構(gòu)，可逆捕獲和釋放循環(huán)腫瘤細胞，實現(xiàn)對早期癌癥的診斷和治療.最近，一些研究人員[14，15]利用硼酸功能化熒光材料作為葡萄糖測定的無酶傳感平臺.同時，硼酸基熒光生物傳感器已被證實是酶基葡萄糖熒光生物傳感器的有效替代品.然而，許多基于硼酸的葡萄糖熒光生物傳感器具有低量子產(chǎn)率、潛在毒性、制備和修飾過程復(fù)雜等特點.

碳量子點是一種新型熒光材料，具有毒性低、生物相容性好、光學(xué)性能優(yōu)良、制備簡便等優(yōu)點[16，17].可廣泛應(yīng)用于光電器件[18]、光催化[19]、生物醫(yī)學(xué)[20]、光學(xué)成像[21]等方面，特別是作為傳感器應(yīng)用于分析化學(xué)[22].Chowdhury等[23]設(shè)計了一種多巴胺修飾的N摻雜碳量子點用于檢測Fe3+.該傳感器具有良好的選擇性，線性范圍寬(20 nM～20μM)，檢測限低至7.6 nM.Tang等[24]開發(fā)了一種實時檢測堿性磷酸酶活性的新型生物傳感器.測定熒光淬滅與對硝基苯酚磷酸二鈉鹽的相關(guān)性，對堿性磷酸酶活性進行定量評價.然而，常見碳量子點的制備和修飾過程都比較復(fù)雜.因此，一步水熱法是制備高靈敏度、功能化碳量子點傳感器的理想方法.

本文結(jié)合硼酸配體對糖類特殊的相互作用及碳點優(yōu)異的發(fā)光性能，通過檸檬酸和3-氨基苯硼酸一步熱解制備出硼酸功能化的碳量子點(BA-CQDs).分別在酸性和堿性條件下，進行葡萄糖檢測.

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

檸檬酸(CA)、3-氨基苯硼酸一水合物(mAPBA)、苯胺、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、乙酸、乙酸鈉、乙二胺來自國藥集團化工試劑有限公司，均為分析純.葡萄糖(Glucose，Glu)、半乳糖(Galactose，Gal)、維生素C(Ascorbic Acid，AA)、尿酸(Uric Acid，UA)、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)、甘氨酸(Glycine，Gly)、半胱氨酸(Cysteine，Cys)、苯基丙氨酸(Phenylalanine，Phe)等來自阿拉丁生化科技股份有限公司.實驗中用水都均為自制去離子水.

1.1.2 主要儀器

Cary 5000紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司)；愛丁堡FS5熒光光譜儀(英國愛丁堡)；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電子顯微鏡(美國PEI公司)；Agilent 5100AFM原子力顯微鏡(美國Agilent公司)；DXRxi激光顯微拉曼成像光譜儀(美國THEM)；Vertex70紅外光譜儀(德國布魯克公司)；AXIS SUPRA X射線光電子能譜儀(英國).

1.2 BA-CQDs的合成

采用熱解檸檬酸法制備BA-CQDs[25].將2.10 g檸檬酸和mAPBA一水合物溶于50 mL水中.在含有聚四氟乙烯的不銹鋼高壓釜中200 ℃加熱4小時.冷卻到室溫后，得到棕色的BA-CQDs溶液.采用NaOH溶液中和，使用3 000 Da透析袋透析2天.經(jīng)冷凍干燥后，得到BA-CQDs.

1.3 DFT

使用DFT計算研究了量子點之間的電子轉(zhuǎn)移.所有的計算均采用Materials Studio 7.0軟件DMol3模塊.利用廣義梯度近似(GGA)下的Perdew-Burke-Ernzerhof泛函來描述電子交換相關(guān)效應(yīng)[26].選擇Grimme方法來處理弱范德華相互作用的色散校正[27].選擇雙數(shù)值原子軌道基極化函數(shù)(DNP)為基組.自洽場收斂值為1.0×10-6Ha.軌道熱占用范圍0.005 Ha(1 Ha=27.21 eV).

1.4 葡萄糖的測定

將500μL 0.1 mg/mL的量子點溶液與10μL葡萄糖溶液在室溫下混合，靜置10 min后采用熒光光譜儀在350 nm的激發(fā)光下測定混合溶液的熒光.通過測定不同濃度葡萄糖溶液的熒光強度，建立了無酶熒光分析方法，得到葡萄糖濃度與熒光強度標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌分析

采用透射電子顯微鏡與原子力顯微鏡對BA-CQDs進行形貌分析.圖1為BA-CQDs的TEM和AFM圖.由圖1(a)可知，所制備的BA-CQDs呈類球狀結(jié)構(gòu)，其粒徑分布均勻，平均粒徑為20.5 nm.在圖1(b)中可看到明顯晶格條紋，晶面間距為0.21 nm，為石墨結(jié)構(gòu)的(100)面.這些結(jié)果表明，所制備的BA-CQDs具有多層二維石墨結(jié)構(gòu).圖1(c)為原子力顯微鏡對BA-CQDs高度分布分析.由圖1(c)可知， BA-CQDs的高度主要分布在0.40～75 nm之間，平均值為0.5 nm.

(a)BA-CQDs的TEM

(b)BA-CQDs的HRTEM

(c)BA-CQDs的AFM圖1 BA-CQDs的TEM、HRTEM和AFM圖.

研究采用FT-IR對BA-CQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)進行了表征.由圖2(a)可知，m-APBA分別在3 472 cm-1、3 200 cm-1、1 400～1 600 cm-1和1 364 cm-1處有特征峰，分別為N-H、O-H、苯基和B-O的伸縮振動[28，29].而BA-CQDs在1 705 cm-1處的峰值向1 657 cm-1處轉(zhuǎn)移，這是由于在高溫下，m-APBA的氨基與檸檬酸的羧基發(fā)生反應(yīng)，形成酰胺基.此外，BA-CQDs在1 364 cm-1處出現(xiàn)了一個峰，這與B-O的拉伸相對應(yīng).結(jié)果表明，成功制備出BA-CQDs.同時，XPS結(jié)果與FT-IR結(jié)果相符.圖2(b)為所制備BA-CQDs的XPS譜.其在281 eV和529 eV處出現(xiàn)了尖銳的峰，這些峰分別屬于C 1s和O 1s.結(jié)果表明，制備的BA-CQDs主要由碳和氧組成.在193 eV出現(xiàn)B 1s峰.圖2(c)為BA-CQDs的高分辨B 1s譜，在192.8 eV出峰，其主要為B-O.FT-IR及XPS分析結(jié)果表明，成功制備出硼酸功能化碳量子點.

(a)BA-CQDs的FT-IR

(b)BA-CQDs的XPS譜

(c)BA-CQDs的高分辨B 1s譜圖2 BA-CQDs的紅外光譜圖、XPS能譜圖及高分辨B 1s譜.

2.2 碳量子點的光學(xué)特性

通過紫外吸收光譜和熒光光譜對BA-CQDs的光學(xué)性質(zhì)進行表征.由圖3(a)可知，BA-CQDs溶液在自然光下呈淡黃色.在360 nm紫外光照下呈現(xiàn)明亮的藍色.其紫外吸收光譜在298 nm和340 nm處有兩個明顯吸收帶，這與Tetsuka等[30]報道的水熱氧化石墨烯還原法制備碳量子點的方法相似.通常，298 nm處的吸收峰為芳香族化合物sp2的π-π*躍遷和C=O的n-π*躍遷[31].340 nm處的吸收峰是由表面態(tài)捕獲激發(fā)態(tài)能量造成的[32].另外，研究中分別以298 nm和340 nm的紫外光為激發(fā)源，測量了BA-CQDs的熒光發(fā)射光譜，研究發(fā)現(xiàn)BA-CQDs的發(fā)射波長具有激發(fā)相關(guān)性.當(dāng)激發(fā)波長為298 nm或340 nm時，最大發(fā)射波長為374 nm或435 nm.為了進一步研究所制備的BA-CQDs的光學(xué)性能，研究中測量了激發(fā)波長由270 nm增加到400 nm對應(yīng)的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果如圖3(b)所示.隨著激發(fā)波長的增加，374 nm處的熒光發(fā)射峰強度先增加后減小，435 nm處的熒光發(fā)射峰強度單調(diào)減小，其發(fā)射峰位置沒有偏移.這與其他已報道的碳量子點不一致[33-35].此外，BA-CQDs的量子產(chǎn)率采用文獻報道的方法進行測試[36].通過計算BA-CQDs量子產(chǎn)率為50.6%，高于所報道的同類型的量子點[37,38]，這可能是由于N，B原子的引入的結(jié)果.

2.3 pH對BA-CQDs響應(yīng)的影響

為了建立一種高靈敏度和選擇性的葡萄糖測定方法，本研究首先探討了溶液pH、離子類型和葡萄糖濃度等環(huán)境因素對識別性能的影響.圖4(a)展示了不同的pH值下BA-CQDs的熒光強度關(guān)系(激發(fā)和發(fā)射波長分別為298 nm和374 nm).由此可以看出，BA-CQDs具有pH依賴性.當(dāng)pH介于4～9之間，BA-CQDs展現(xiàn)出強烈的熒光，而在pH<2或pH>10條件下，熒光幾乎完全淬滅.這一現(xiàn)象與之前的報道一致[39].此外，葡萄糖淬滅BA-CQDs的熒光強度也與pH有關(guān).在低pH值下，葡萄糖的加入能夠增強BA-CQDs的熒光.然而，在高pH值下，其熒光被淬滅.因此，所制備的BA-CQDs具有兩種對葡萄糖的響應(yīng)模式.

(b)不同pH下BA-CQDs的Zeta電位圖4 pH對量子點的熒光強度及Zeta電位的影響

為了進一步研究量子點在不同pH下對葡萄糖的響應(yīng)機理，研究中對BA-CQDs的表面電荷進行測試.由圖4(b)可知，BA-CQDs的Zeta電位隨著pH的增加而降低.pH為1.0～3.0時，BA-CQDs表面酰胺基團和吡啶衍生物質(zhì)子化產(chǎn)生大量正電荷[40].當(dāng)pH大于3.0時，BA-CQDs的Zeta電位為負，可能是由于BA-CQDs表面羧基去質(zhì)子化.當(dāng)pH大于8.0時，硼酸基團減少，BA-CQDs的Zeta電位進一步降低.這是由于隨著pH的升高，硼酸基團在水中逐漸以非離子三角錐形向具有帶負電的四面體硼酸鹽形式轉(zhuǎn)化而造成[41].因此，單硼酸鹽可以與水溶液中的多醇化合物形成顯著穩(wěn)定的共價鍵[42].

針對BA-CQDs對葡萄糖的雙響應(yīng)模式，通過DFT計算對碳量子點的表面的靜電勢進行了分析，從而研究不同pH值下BA-CQDs與葡萄糖之間的電子轉(zhuǎn)移情況.研究中碳量子點的分子模型采用了典型單層氧化石墨烯結(jié)構(gòu)，邊緣含有大量的-OH和-COOH.圖5(a)～(c)為不同pH下BA-CQDs最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu).圖5(d)～(i)為BA-CQDs結(jié)合葡萄糖之前和之后的靜電勢等值面.正電性和負電性在等值面上分別用藍色和紅色表示.同時，藍色等值面代表結(jié)構(gòu)中的缺電子區(qū)域(紅色代表富電子區(qū)域).此外，顏色越深也表明靜電勢越高.

由圖5(d)～(f)可知，BA-CQDs在不同pH下的靜電勢等值面差異較大.隨著pH的增加，靜電勢等值面的顏色由藍色變?yōu)榧t色.如表1所示，對應(yīng)的平均靜電勢分別為2.40 eV、-0.50 eV和-1.90 eV.靜電勢的變化趨勢與Zeta電位試驗結(jié)果一致.結(jié)果表明，BA-CQDs的電子含量逐漸豐富.

同時，由圖5(g)～(i)可知，BA-CQDs結(jié)合葡萄糖后在不同pH下靜電勢等值面也有較大的差異.如表1所示，對應(yīng)的平均靜電勢分別為2.28 eV、-0.46 eV、-1.82 eV.

(a)pH<3時BA-CQDs的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)

(b)3

(c)pH>8時BA-CQDs的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)

(d)pH<3的BA-CQDs

(e)3

(f)pH>8的BA-CQDs

(g)pH<3時BA-CQDs+Glu

(h)3

(i)pH>8時BA-CQDs+Glu圖5 不同pH下，BA-CQDs的可能結(jié)構(gòu)式及BA-CQDs與BA-CQDs+Glu靜電勢等位面

表1 不同pH下，BA-CQDs和BA-CQDs+葡萄糖平均靜電勢

此外，在相同pH條件下，BA-CQDs結(jié)合葡萄糖后靜電勢等值面的顏色較BA-CQDs淺，表明BA-CQDs與葡萄糖之間有較為明顯的電荷轉(zhuǎn)移作用.pH<3時，平均靜電勢的差值為-0.12 eV.這意味著量子點周圍的電子云密度增加，導(dǎo)致熒光強度增加.在高pH下，平均靜電勢之差分別為0.04(38)eV.由于量子點的電子云密度高，量子點間的電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光強度降低.由此可能導(dǎo)致BA-CQDs對葡萄糖具有兩種響應(yīng)模式.

2.4 BA-CQDs對葡萄糖的選擇性

通常，選擇性是評估化學(xué)傳感器性能的一個非常重要的參數(shù)，特別是對于在生物醫(yī)學(xué)樣本中具有潛在應(yīng)用的生物傳感器[43].本文研究了在酸性和堿性環(huán)境下，BA-CQDs對葡萄糖的選擇性.圖6(a)為pH 2.0下，不同金屬離子、陰離子及氨基酸等對BA-CQDs熒光強度的淬滅比率(F0-F)/F0，其中F和F0分別為葡萄糖存在和不存在下BA-CQDs的熒光強度.選擇上述物種是由于這些物質(zhì)通常與人類血清中的葡萄糖共存[44].研究表明，幾乎所有的金屬離子對熒光強度都表現(xiàn)出嚴重淬滅效果，特別是Al3+和部分過渡金屬離子(Hg2+、Ag+、Ni2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+)的淬滅效應(yīng).主要由于這些離子與BA-CQDs之間產(chǎn)生強配位作用，從而導(dǎo)致發(fā)色團的電子密度降低.同時，由圖6(a)插圖可知，100μM的EDTA可以作為掩蔽劑消除金屬離子對葡萄糖檢測的干擾.

考慮到BA-CQDs對葡萄糖的雙重響應(yīng)模式，在pH 8.5的條件下也進行了選擇性評價.與酸性條件下選擇性研究不同，在較高的pH下，大多數(shù)重金屬離子水解沉淀，這對識別更加有利.圖6(b)顯示了不同干擾物對BA-CQDs的淬滅效果，其中包括各種氨基酸及離子.結(jié)果表明僅有葡萄糖對熒光強度的淬滅作用最為顯著，這可能是由于BA-CQDs中的硼酸基團對碳水化合物的鄰二羥基具有較高的親和力.此外，在含有葡萄糖和其他干擾物的混合物中測試了BA-CQDs的選擇性和識別效率.添加各種干擾物質(zhì)不影響葡萄糖對熒光強度的淬滅作用.因此，BA-CQDs具有較高的選擇性，可以在高pH條件下有效地檢測混合物中的葡萄糖.

(a)酸性條件

(b)堿性條件圖6 BA-CQDs對相同濃度離子的選擇

2.5 檢測靈敏度分析

基于以上結(jié)果，研究了BA-CQDs在酸性和堿性環(huán)境下對葡萄糖的檢測靈敏度.在BA-CQDs溶液中加入0～500μM不同濃度的葡萄糖后，BA-CQDs溶液的熒光強度變化如圖7所示.由圖7(a)可知，在pH 9.0時，BA-CQDs的熒光強度隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸降低.(F0-F)/F0與葡萄糖濃度的關(guān)系如圖7(b)所示.(F0-F)/F0在葡萄糖的低濃度范圍內(nèi)快速增加，當(dāng)葡萄糖濃度高于100μM時，(F0-F)/F0變化趨于穩(wěn)定.在5 ～100μM范圍內(nèi)，(F0-F)/F0與葡萄糖濃度呈良好的線性關(guān)系.線性方程為(F0-F)/F0=821.53CGlu+914.815，相關(guān)系數(shù)為0.998(n=5).檢測限為0.31μM.表2列出了BA-CQDs與一些非酶葡萄糖生物傳感器的比較.結(jié)果表明，BA-CQDs具有良好的靈敏度和選擇性，在葡萄糖的檢測中具有很好的應(yīng)用前景.

(a)pH 9.0下BA-CQDs/Glu的熒光光譜

(b)pH 9.0下(F0-F)/F0與葡萄糖濃度的關(guān)系

(c)pH 4.0下BA-CQDs/Glu的熒光光譜

(d)pH 4.0下(F0-F)/F0與葡萄糖濃度的關(guān)系圖7 BA-CQDs對不同濃度葡萄糖的響應(yīng)

圖7(c)為pH為4.0時，BA-CQDs在不同濃度葡萄糖溶液中的熒光光譜.熒光強度隨著葡萄糖濃度的增加而略有增加.由圖7(d)可知，當(dāng)葡萄糖濃度0～300μM時，(F0-F)/F0隨葡萄糖濃度的增大出現(xiàn)顯著下降，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.線性方程為：(F0-F)/F0=2 272.308-76.098CGlu，相關(guān)系數(shù)為0.982(n=5).由于線性關(guān)系較差，可能會影響葡萄糖分析的準(zhǔn)確性.檢測限為10.7μM，遠高于表2中總結(jié)的數(shù)據(jù).結(jié)合選擇性結(jié)果，表明酸性條件不適用BA-CQDs對葡萄糖的檢測.

表2 不同傳感器的葡萄糖含量分析對比

3 結(jié)論

本文通過一步水熱法熱解檸檬酸和mAPBA，成功制備了一種新型硼酸功能生物傳感器BA-CQDs.在374 nm處具有較強的熒光、高穩(wěn)定性和高量子產(chǎn)率.同時，BA-CQDs在酸性和堿性條件下對葡萄糖具有雙重響應(yīng).通過DFT確定了BA-CQDs和葡萄糖之間的電子轉(zhuǎn)移機制.此外，BA-CQDs在高pH條件下，對葡萄糖具有高靈敏度和高選擇性，其熒光強度與葡萄糖濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.在傳感、生物醫(yī)學(xué)診斷和環(huán)境監(jiān)控等應(yīng)用具有潛在的應(yīng)用價值.