向丹 王文濤 張益

(1荊門市中醫(yī)醫(yī)院呼吸內(nèi)科，湖北 荊門 448000；2湖北民族大學附屬民大醫(yī)院手術(shù)室)

非小細胞肺癌(NSCLC)具有發(fā)病率高、死亡率高和預后差的特點，其發(fā)生發(fā)展過程復雜；深入研究NSCLC發(fā)病機制可有助于篩選NSCLC診療的新靶點〔1〕。CCNE2作為調(diào)控細胞周期的因子，一直是腫瘤相關(guān)研究的熱點，有報道稱CCNE2信號通路的紊亂會導致腫瘤的發(fā)生，如miR-664b-5p〔2〕、miR-26a和miR-30b〔3〕可調(diào)控CCNE2的表達從而促進乳腺癌細胞的凋亡，并抑制細胞遷移和侵襲。且CCNE2在NSCLC組織和細胞中高表達，可促進NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移，在NSCLC治療和研究中發(fā)揮著重要作用〔4〕。關(guān)于miR-32在腫瘤中的研究早有報道，如miR-32靶向FBXW7促進乳腺癌細的增殖和遷移，抑制細胞凋亡〔5〕和靶向KLF4調(diào)控胃癌細胞的增殖和遷移〔6〕。而miR-32在NSCLC細胞的功能也已有研究，其在NSCLC組織和細胞中表達顯著降低〔7〕。也有研究發(fā)現(xiàn)MiR-32可通過靶向調(diào)控TWIST1〔8〕和SOX9〔9〕抑制NSCLC細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。本實驗通過生物信息學分析預測發(fā)現(xiàn)CCNE2可能是miR-32的靶基因，但miR-32是否可靶向調(diào)控CCNE2表達而影響NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲過程仍不清楚。因此，本研究旨在研究miR-32對NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲的影響及其分子調(diào)控機制是否與CCNE2有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、 DMEM培養(yǎng)基購自北京華邁科生物技術(shù)有限責任公司；CCK-8試劑購自上海益啟生物科技有限公司；胰蛋白酶購自上海恒渡生物科技有限公司；miRNeasy Mini試劑盒購自上海科敏生物科技有限公司；Totol RNA提取試劑盒和miRNA實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)SYBR?試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；miR-NC、miR-32 mimics、miR-32 inhibitor購自上海吉瑪生物。CCNE2干擾RNA(si-CCNE2)和對照干擾RNA(si-NC)均由上海生物工程有限公司合成構(gòu)建。電化學(ECL)發(fā)光試劑盒購自上海經(jīng)科化學科技有限公司；GAPDH抗體、CCNE2抗體、辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗均購自上海恒斐生物科技有限公司；pcDNA3.1空載體、CCNE2過表達載體pcDNA3.1-CCNE2均購自賽默飛公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京博邁斯科技發(fā)展有限公司。Transwell小室購于Millipore。清潔級雄性BALB/c小鼠(體重18～23 g，8～10周齡)，由上海斯萊克實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(滬)2012-0002。所有動物至少適應相應的飼養(yǎng)環(huán)境1 w。所有的動物實驗按照有關(guān)法律法規(guī)指導方法進行，并獲得醫(yī)學實驗動物倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1肺癌組織標本 收集荊門市中醫(yī)醫(yī)院2016年1月至2019年1月手術(shù)切除并經(jīng)病理切片確診為NSCLC的石蠟標本30例。30例患者術(shù)后病理切片確診為NSCLC，患者經(jīng)手術(shù)切除癌組織，距離癌組織邊緣2～5 cm處切除的為癌旁組織。所有患者術(shù)前未接受過放化療。所有患者簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2.2細胞培養(yǎng) 正常支氣管上皮細胞株16-HBE和NSCLC細胞株H460、A549和H1299購自美國ATCC。將以上細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，然后將其放在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-32和CCNE2表達 提取16-HBE、H460、A549和H1299細胞的總RNA和miRNA，合成cDNA，按qPCR試劑盒進行操作。MiR-32和U6引物來源于MicroRNA Real-time PCR試劑盒。miR-32引物正義鏈：5′-GCGGCGTATTGCACATTACT-3′，反義鏈：5′-TCGTATCCAGTGCAGGGTC-3′；U6引物正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反義鏈：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；CCNE2引物正義鏈：5′-ATTTGGCTATGCTGGAGGAA-3′,反義鏈：5′-GTGCTCTTCG GTGGTGTCAT-3′。GAPDH引物正義鏈：5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反義鏈：5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。

1.2.4細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期A549和H1299細胞，以1×105個/孔密度接種于6孔板中，隨機分為8組：NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-32組(轉(zhuǎn)染miR-32 mimics)、NC inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-32-NC)、miR-32 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-32 inhibitor)、si-NC組(轉(zhuǎn)染對照干擾RNA)、si-CCNE2組(轉(zhuǎn)染CCNE2干擾RNA)、miR-32+vector組(共轉(zhuǎn)染miR-32 mimics和pcDNA3.1)、miR-32+CCNE2組(共轉(zhuǎn)染miR-32 mimics和pcDNA3.1-CCNE2)，具體步驟按照LipofectamineTM2000使用說明進行。 48 h后，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，qRT-PCR和Western印跡分別檢測CCNE2 mRNA和蛋白表達水平；采用CCK-8法和Transwell法檢測細胞增殖、遷移、侵襲能力。

1.2.5CCK-8法檢測細胞增殖 將1.2.4中各組細胞，分別于培養(yǎng)12、24、48和72 h時，每孔加入20 μl的CCK-8溶液，然后于酶標儀上檢測490 nm波長下的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.6Transwell小室檢測細胞遷移與侵襲能力 取1.2.4中各組細胞，遷移實驗：Transwell上室接種3×104個/孔細胞，侵襲實驗：有基質(zhì)膠的Transwell上室接種105個/孔細胞，兩者下室中均加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，用PBS漂洗，再分別用甲醇和0.5%結(jié)晶紫固定、染色。倒置顯微鏡觀察并隨機選5個視野的遷移和侵襲細胞數(shù)的平均值。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測miR-32與CCNE2基因的靶向關(guān)系 生物信息學分析庫預測顯示miR-32與CCNE2 3′-UTR有結(jié)合位點。將構(gòu)建好的野生型CCNE2-WT和突變型CCNE2-MUT的熒光素酶報告質(zhì)粒分別與miR-NC、miR-32 mimics轉(zhuǎn)染至A549和H1299細胞中，轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組細胞熒光素酶活性，實驗重復3次。

1.2.8Western印跡檢測 提取A549和H1299細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)進行蛋白定量度。變性后取20 μg蛋白樣品進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉液封閉后加入1∶2 000倍稀釋的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜，加入1∶10 000稀釋的二抗，37℃下孵育1 h。加化學發(fā)光劑顯影成像，Image J分析條帶的灰度值，以目的條帶與GAPDH的比值表示目的蛋白的表達情況。

1.2.9異種移植瘤實驗 將2.5×106的對照細胞(H1299)或穩(wěn)定表達miR-32的細胞懸浮于200 μl無血清DMEM中，皮下注射到每只小鼠的1只(每組10只雄性BALB/C 小鼠，且經(jīng)病理切片確診為NSCLC)30 d。30 d后處死小鼠，測定各項參數(shù)。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-32在NSCLC組織和細胞中低表達 癌組織中miR-32表達水平(0.35±0.04)顯著低于癌旁組織(1.14±0.13，P=0.000)；A549組(0.36±0.04)、H1299組(0.26±0.03)和H460(0.49±0.05)中miR-32表達水平顯著低于16-HBE組(1.12±0.13，均P<0.05)。

2.2過表達 miR-32抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲能力 與NC組相比，miR-32組在A549和H1299細胞中miR-32表達顯著升高(均P=0.000)；與NC組相比，miR-32組細胞活力、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P=0.000)。表明miR-32可顯著降低A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力。見圖1，表1，表2。

圖1 過表達miR-32對細胞A549遷移、侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.3沉默CCNE2抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲能力 與si-NC組相比，si-CCNE2組A549和H1299細胞CCNE2、miR-32、遷移和侵襲細胞數(shù)及細胞活性均顯著下調(diào)(均P=0.000)。見表3、表4。表明沉默CCNE2可顯著降低A549和H1299細胞的遷移和侵襲能力。

2.4CCNE2是miR-32的靶基因 生物信息學預測發(fā)現(xiàn)miR-32與CCNE2 3′UTR存在結(jié)合位點見圖2；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-32能顯著降低CCNE2-3′UTR-WT的熒光素酶活性(P<0.01)，而不影響CCNE2-3′UTR-MUT的熒光素酶活性(P>0.05)，見表5；miR-32組A549和H1299細胞CCNE2蛋白表達顯著低于miR-NC組(P<0.01)；miR-32 inhibitor組A549和H1299細胞CC-NE2蛋白表達顯著高于NC inhibitor組(P<0.01)，見表6、圖3。

圖2 miR-32與CCNE2 3′UTR綜合位點

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 miR-32調(diào)控CCNE2的表達

圖3 miR-32靶向、調(diào)控CCNE2

2.5miR-32負調(diào)控CCNE2抑制NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲能力 與miR-32+vector組相比，miR-32+CCNE2組CCNE2蛋白水平、細胞活力、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)均顯著升高(均P<0.05)。見圖4，表7，表8。

圖4 CCNE2蛋白的表達

2.6miR-32在體內(nèi)抑制異種移植瘤生長 與NC組相比，miR-32組10 d腫瘤體積顯著變小(均P<0.01)；30 d后，對處死小鼠的腫瘤重量進行測量，miR-32組腫瘤重量顯著降低(P<0.01)，miR-32組腫瘤細胞中miR-32表達上調(diào)，CCNE2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見表9，圖5。

圖5 CCNE2蛋白的表達

3 討 論

研究表明miR-32在多種腫瘤中能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，它在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌Wilm瘤中的表達水平顯著下調(diào)〔10〕。如 Zhao等〔6〕發(fā)現(xiàn)miR-32通過KLF4蛋白調(diào)控胃癌細胞增殖和遷移；Wu等〔11〕發(fā)現(xiàn)，miR-32通過調(diào)控PTEN蛋白調(diào)控腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。但miR-32在乳腺癌中的表達顯著上調(diào)，如Wei等〔5〕發(fā)現(xiàn)miR-32能靶向調(diào)控FBXW7的表達促進乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和抑制細胞凋亡。miR-32在NSCLC細胞的功能也已有研究，它在NSCLC組織和細胞中表達顯著下調(diào)〔7〕。有研究發(fā)現(xiàn)miR-32可通過負調(diào)控TWIST1〔8〕和SOX9〔9〕抑制NSCLC細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。miR-32可靶向AURKA基因從而抑制NSCLC細胞活力〔12〕。本研究發(fā)現(xiàn)miR-32在NSCLC組織、A549、H460和H1299細胞中顯著下調(diào)，表明，過表達miR-32可顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲；miR-32在體內(nèi)可明顯抑制異種移植瘤的生長，提示miR-32在NSCLC中能夠發(fā)揮抑癌作用。

腫瘤的一個重要生物學特征是有無限生長的潛能，癌基因的活化及抑癌基因通路的改變是腫瘤發(fā)生的重要因素〔13〕。細胞增殖受到細胞周期素、細胞周期依賴性激酶〔14〕及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的嚴格調(diào)控。CCNE2與CCNE1〔15〕同屬于細胞周期素E家族〔16〕，有研究報道CCNE2在非轉(zhuǎn)化的細胞中難以檢測到，但是在腫瘤性細胞中卻顯著升高〔17〕。目前國內(nèi)外學者已經(jīng)證明CCNE2在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌、胃癌〔13〕、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌〔19〕、腦癌等。如miR-664b-5p〔2〕、miR-26a和miR-30b〔3〕可調(diào)控CCNE2的表達從而促進乳腺癌細胞的凋亡，并抑制細胞遷移和侵襲。研究顯示CCNE2在NSCLC組織和細胞中高表達，可促進NSCLC細胞增殖、侵襲和遷移，提示CCNE2在NSCLC治療和研究中可能發(fā)揮重要作用〔4〕。本研究推測CCNE2可能是miR-32的潛在靶基因，進一步的雙熒光素報告基因?qū)嶒炞C實了CCNE2是miR-32的靶基因，且miR-32過表達可負調(diào)控CCNE2表達，沉默miR-32可使細胞中CCNE2的表達上調(diào)，與過表達miR-32結(jié)果一致。本實驗結(jié)果表明miR-32可顯著下調(diào)腫瘤細胞中CCNE2蛋白表達，提示CCNE2在NSCLC細胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲過程中有重要作用，miR-32可負調(diào)控CCNE2表達參與其中。

miR-32在NSCLC中的作用已有報道〔7〕，miR-32調(diào)控NSCLC的機制十分復雜，本研究發(fā)現(xiàn)miR-32下調(diào)CCNE2抑制NSCLC細胞A549和H1299的增殖、遷移和侵襲，這一結(jié)果為NSCLC的治療和診斷提供了新的理論依據(jù)。