李若焓 黃穎昭 廖乃麟 吳沉洲 李一

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科，成都610041

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白合成的重要細(xì)胞器，參與蛋白的生產(chǎn)、折疊、修飾、成熟、質(zhì)量控制和降解[1-2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與蛋白質(zhì)穩(wěn)定的維持密切相關(guān)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被各種干擾破壞時，就會觸發(fā)一種稱為“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）”的細(xì)胞狀態(tài)。

為了克服應(yīng)激并恢復(fù)蛋白質(zhì)穩(wěn)定，ERS會激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）[3]。UPR可以減少蛋白質(zhì)合成，增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊能力，降解錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)[4]。如果UPR不能協(xié)助細(xì)胞擺脫應(yīng)激，那么UPR信號會從促生存轉(zhuǎn)為促死亡[5-8]。普遍認(rèn)為癌癥可導(dǎo)致ERS及UPR信號通路的激活[9-11]。ERS對癌癥的發(fā)生、發(fā)展有雙向調(diào)控作用：如能及時解決ERS，UPR將有利于癌細(xì)胞的生存、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥性的提高；如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)大量積累，超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自我調(diào)節(jié)能力，將激活ERS下游凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。

ERS除了直接影響癌細(xì)胞外，還參與細(xì)胞之間的交流。2011年，Mahadevan等[13]首次報道了前列腺癌細(xì)胞在ERS狀態(tài)下會釋放某些“可溶性的因子”，誘導(dǎo)骨髓來源的髓系細(xì)胞也出現(xiàn)ERS，這種細(xì)胞間的ERS傳遞現(xiàn)象稱為傳遞性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng) 激（transmissible endoplasmic reticulum stress，TERS）。

研究[14-16]發(fā)現(xiàn)，ERS狀態(tài)的胰島β細(xì)胞會引發(fā)多種反應(yīng)，這些反應(yīng)包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞功能受損、胰島素分泌障礙等。目前許多研究認(rèn)為，口腔癌對患者身體的損害不僅僅是由于癌癥對進(jìn)食器官的毀損，還由于包括胰島功能下降等在內(nèi)的諸多代謝紊亂，這些破壞對口腔癌患者的生活質(zhì)量和預(yù)后造成了較大的負(fù)面影響。本研究的目的是為探究口腔癌細(xì)胞是否通過TERS影響了胰島β細(xì)胞的功能。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人口腔鱗癌細(xì)胞系CAL-27、SCC-25，小鼠胰島素瘤6細(xì)胞系的MIN6細(xì)胞（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室提供），達(dá)爾伯克改良伊格爾（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基，DMEM/F-12培養(yǎng)基，洛斯維·帕克紀(jì)念研究所-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640，RPMI-1640）培養(yǎng)基，胎牛血清（fetal bovine se‐rum，F(xiàn)BS），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（武漢賽維爾生物科技有限公司），衣霉素（tunicamycin，TM）（北京市華中海威基因科技有限公司），RNA提取試劑（Trizol試劑）（TAKARA公司，日本），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Sci‐entific公司，美國），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）擴(kuò)增試劑盒（Bimake公司，美國），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate de‐hydrogenase，GAPDH）、β-肌動蛋白（β-actin）、結(jié)合免疫球蛋白（binding immunoglobulin protein，BiP）、剪切型X-盒結(jié)合蛋白1（spliced form of Xbox binding protein 1，XBP1S）、CAAT區(qū)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（C/EBP-Homologous Protein，CHOP）、胰島素（insulin，INS）-1、INS-2的qP‐CR引物（上海市生工生物工程股份有限公司），兔抗BiP抗體，兔抗微管蛋白（tubulin，TUB）抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司），鼠抗INS單克隆抗體（Sigma-Aidrich公司，美國），抗兔二抗、抗鼠二抗（SAB公司，美國），脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)記（TdTmediated dUTPnick-end labeling，TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），小鼠INS酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒，小鼠C肽ELISA試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CAL-27細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，SCC-25細(xì)胞用含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，MIN6細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，用相應(yīng)的培養(yǎng)基終止消化并離心，重懸后接種于培養(yǎng)瓶中。

1.3 誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞ERS

1.3.1 誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞CAL-27產(chǎn)生ERS用TM（2μg·mL-1）作為ERS應(yīng)激劑，持續(xù)刺激組使用TM持續(xù)處理3、6、17、24 h后收樣；間歇刺激組加入TM處理2 h，PBS清洗3次確保無TM殘留后，換成正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、4、15、22 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收樣。

1.3.2 誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞SCC-25產(chǎn)生ERS 用TM（2μg·mL-1）作為ERS應(yīng)激劑，持續(xù)刺激組使用TM持續(xù)處理3、6、24 h后收樣，間歇刺激組加入TM處理2 h，PBS清洗3次確保無TM殘留后，換成正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1、4、22 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收樣。

1.4 誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞ERS

用TM（2μg·mL-1）作為ERS應(yīng)激劑，MIN6細(xì)胞使用TM持續(xù)處理3、6、17、24 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收樣。

1.5 制作條件培養(yǎng)基

加入0.2%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）或2μg·mL-1TM處理口腔癌細(xì)胞2 h后，PBS清洗3次確保無DMSO或TM殘留后，換成正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集上清液，離心（1 000 r·min-1，5 min）、過濾（0.22μm孔徑），去除雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。收集的條件培養(yǎng)基分別稱為對照條件培養(yǎng)基（control conditional medium，CCM）、介導(dǎo)TERS效應(yīng)的條件培養(yǎng)基（TERSconditional medium，TCM）。SCC-25細(xì)胞的CCM、TCM稱為CCM25、TCM25，CAL-27細(xì)胞的CCM、TCM稱為CCM27，TCM27。

1.6 TERS實驗

MIN6細(xì)胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM25、TCM25、CCM27、TCM27處理MIN6細(xì)胞24 h、48 h后，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收樣。

1.7 qPCR檢測

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，溶于無酶水中，用紫外分光光度計進(jìn)行濃度和純度的檢測。取10μL總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），用qPCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。使用GAPDH作為CAL-27、SCC-25細(xì)胞的內(nèi)參，使用β-actin作為MIN6細(xì)胞的內(nèi)參。反應(yīng)體系為10μL：5μL qPCR預(yù)混液，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，4μL cDNA。設(shè)置3個復(fù)孔，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃3 min，95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。用2-ΔΔCT統(tǒng)計學(xué)方法計算目的基因相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.8 WB檢測

用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，在蛋白液中加入蛋白上樣緩沖液，99℃、1 400 r·min-1、5 min進(jìn)行變性。樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉30 min，洗滌緩沖液清洗。孵育一抗：抗TUB（1∶5 000），抗BiP（1∶1 000），抗INS（1∶500），4℃過夜。洗滌緩沖液洗滌3次，每次為20 min。室溫孵育二抗1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯影，并進(jìn)行灰度分析，“目的蛋白/內(nèi)參蛋白”表示。

1.9 MIN6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡實驗

MIN6細(xì)胞以2萬/孔密度鋪于96孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細(xì)胞24 h。PBS洗滌一次，加入免疫染色固定液固定細(xì)胞30 min。PBS洗滌一次，加入免疫染色強(qiáng)力通透液，室溫孵育5 min。PBS洗滌2次，加入TUNEL檢測液染凋亡細(xì)胞，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，加入4’,6-聯(lián)脒-2’-苯基吲哚（4’,6-di‐amidino-2’-phenylindole，DAPI）染色液染所有細(xì)胞的細(xì)胞核，室溫孵育5 min。PBS洗滌3次，加入抗熒光淬滅封片液，在熒光顯微鏡下觀察。于200倍倒置熒光顯微鏡下，計數(shù)6個視野中凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，取均值，計算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.10 MIN6細(xì)胞的克隆形成實驗

MIN6細(xì)胞以500個/孔密度鋪于12孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM25、TCM25、CCM27、TCM27處理MIN6細(xì)胞24 h后，使用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d后吸棄上清，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，再加入結(jié)晶紫染色，10 min后用PBS洗滌2次，拍照記錄實驗結(jié)果并計算每孔中的細(xì)胞群落數(shù)，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.11 MIN6細(xì)胞的分泌功能實驗

1.11.1 葡萄糖刺激胰島素分泌（glucose-stimulat‐ed insulin secretion，GSIS）實驗 MIN6細(xì)胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細(xì)胞24 h后，用克雷布斯林格緩沖液（Krebs-Ringer Buffer，KRB）洗滌2次，并在KRB緩沖液中培養(yǎng)1 h后，一組換液成含3.3 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基，另一組換液成含16.7 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集細(xì)胞及上清液，用小鼠INSELISA試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)及上清液中的INS含量，MIN6細(xì)胞的INS分泌量采用“上清液INS濃度/細(xì)胞內(nèi)INS濃度”表示。

1.11.2 葡萄糖刺激C肽分泌實驗 MIN6細(xì)胞以60萬/孔密度鋪于6孔板中。使用DMSO（0.2%，陰性對照）、TM（2μg·mL-1，陽性對照）、CCM27、TCM27處理MIN6細(xì)胞24 h后，用KRB緩沖液洗滌2次，并在KRB緩沖液中培養(yǎng)1 h后，一組換液成含3.3 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基，另一組換液成含16.7 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，收集細(xì)胞及上清液，用BCA試劑盒檢測細(xì)胞總蛋白含量，用小鼠C肽ELISA試劑盒檢測上清液中的C肽含量，MIN6細(xì)胞的C肽分泌量采用“上清液C肽濃度/總蛋白”表示。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graphpad Prism 8軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組之間比較使用t檢驗，多組之間比較使用方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞ERS實驗結(jié)果

在CAL-27細(xì)胞中，ERS標(biāo)志物BiP在持續(xù)刺激組和間歇刺激組中4個時間點的mRNA相對表達(dá)量及蛋白表達(dá)量均高于0 h（圖1 A、D、E），ERS標(biāo)志物XBP1S、CHOP的mRNA相對表達(dá)量在持續(xù)刺激組的3 h和間歇刺激組的3 h+均高于0 h（圖1B、C），BiP、XBP1S、CHOP的mRNA相對表達(dá)量及BiP的蛋白表達(dá)量在持續(xù)刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 CAL-27細(xì)胞的ERS標(biāo)志物表達(dá)Fig 1 Expression of ERSmarkers in CAL-27 cells

在SCC-25細(xì)胞中，BiP、XBP1S、CHOP在持續(xù)刺激組和間歇刺激組中3個時間點的mRNA相對表達(dá)量均高于0 h，持續(xù)刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

圖2 SCC-25細(xì)胞的ERS標(biāo)志物表達(dá)Fig 2 Expression of ERSmarkers in SCC-25 cells

2.2 誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞ERS實驗結(jié)果

3、6、17 、24 h的BiP、XBP1S、CHOP的mRNA相對表達(dá)量高于0 h（圖3A～C），3、6、17、24 h的BiP的蛋白表達(dá)量高于0 h（圖3D、E）。

圖3 MIN6細(xì)胞的ERS標(biāo)志物表達(dá)Fig 3 Expression of ERSmarkers in MIN6 cells

2.3 MIN6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果

TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，鏡下見MIN6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比例增加（圖4），細(xì)胞凋亡率增加（圖5）。

圖4 MIN6細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果 倒置熒光顯微鏡 ×200Fig 4 TUNEL staining of MIN6 cells inverted fluorescence microscope ×200

圖5 MIN6細(xì)胞凋亡率Fig 5 Apoptosis rateof MIN6 cells

2.4 MIN6細(xì)胞的克隆形成實驗結(jié)果

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，MIN6細(xì)胞克隆形成的群落數(shù)減少，克隆形成率降低（圖6）。

圖6 MIN6細(xì)胞的克隆形成能力Fig 6 Colony formation ability of MIN6 cells

2.5 TERS實驗結(jié)果

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，BiP、XBP1S的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)（圖7A～D），BiP的蛋白表達(dá)量上調(diào)（圖7E～H）。

圖7 MIN6細(xì)胞的ERS標(biāo)志物表達(dá)Fig 7 Expression of ERSmarkersin MIN6 cells

TM組相較0組、TCM25組相較CCM25組、TCM27組相較CCM27組，INS的蛋白表達(dá)量下調(diào)（圖8A～D），INS的mRNA相對表達(dá)量上調(diào)（圖8 E～H）。

圖8 MIN6細(xì)胞的INS表達(dá)Fig 8 Expression of INSin MIN6 cells

2.6 MIN6細(xì)胞的分泌功能實驗結(jié)果

2.6.1 GSIS實驗結(jié)果 在3.3、16.7 mmol·L-1兩種濃度的葡萄糖刺激下，TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，INS分泌量降低（圖9）。

圖9 MIN6細(xì)胞的INS分泌量Fig 9 INSSecretion in MIN6 cells

2.6.2 葡萄糖刺激C肽分泌的實驗結(jié)果 在3.3、16.7 mmol·L-1兩種濃度的葡萄糖刺激下，TM組相較0組、TCM27組相較CCM27組，C肽分泌量降低（圖10）。

圖10 MIN6細(xì)胞的C肽分泌量Fig 10 C-peptide Secretion in MIN6 cells

3 討論

TM可以阻斷N-連接糖基化，從而影響真核細(xì)胞糖蛋白的折疊，產(chǎn)生ERS，激活UPR，是ERS常用應(yīng)激劑之一。UPR的激活是因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)競爭性地與BiP結(jié)合，3種ERS感受器（蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇需要酶1、激活轉(zhuǎn)錄因子6）與BiP解離并激活[17-18]，啟動下游3個主要信號通路（蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶/真核起始因子2α、肌醇需要酶1/x-盒結(jié)合蛋白1、激活轉(zhuǎn)錄因子6）[19]。通過查閱文獻(xiàn)[20]確定TM處理細(xì)胞的濃度范圍，進(jìn)行預(yù)實驗。預(yù)實驗中，不同濃度的TM分別處理CAL-27、SCC-25、MIN6細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，并通過qPCR檢測ERS標(biāo)志物的表達(dá)。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)TM濃度在2μg·mL-1時，鏡下細(xì)胞未有大面積漂浮現(xiàn)象，并通過qPCR檢測ERS標(biāo)志物明顯上調(diào)，確定了本研究TM濃度為2μg·mL-1。

在誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞ERS實驗中，發(fā)現(xiàn)ERS標(biāo)志物的表達(dá)在持續(xù)刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明對CAL-27細(xì)胞施加TM刺激2 h后撤除TM，與持續(xù)施加TM刺激，兩種刺激方式的ERS效應(yīng)無明顯差別。在誘導(dǎo)SCC-25細(xì)胞ERS實驗中，選擇與誘導(dǎo)CAL-27細(xì)胞ERS實驗相同的TM刺激時長2 h，發(fā)現(xiàn)ERS標(biāo)志物的表達(dá)在持續(xù)刺激組和間歇刺激組組間同時間點比較的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可得出與CAL-27細(xì)胞相同的結(jié)論，意味著可收集TM刺激2 h后不含TM的口腔癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基供后續(xù)實驗。誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞ERS實驗發(fā)現(xiàn)，MIN6細(xì)胞可以產(chǎn)生ERS現(xiàn)象。

TERS實驗發(fā)現(xiàn)，ERS的口腔癌細(xì)胞可將ERS傳遞給MIN6細(xì)胞，TERS導(dǎo)致MIN6細(xì)胞的胰島素合成減少，在翻譯水平抑制胰島素的合成。MIN6細(xì)胞的細(xì)胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，TERS的MIN6細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加。MIN6細(xì)胞的克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)，TERS的MIN6細(xì)胞增殖能力下降，這可能意味著TERS的胰島β細(xì)胞存活能力下降。MIN6細(xì)胞的分泌功能實驗發(fā)現(xiàn)，MIN6細(xì)胞的分泌功能下降。

在TERS實驗和MIN6細(xì)胞的分泌功能實驗中，MIN6細(xì)胞的胰島素合成在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，在翻譯水平下調(diào)，胰島素分泌下調(diào)，這三者結(jié)果出現(xiàn)矛盾。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是加工分泌性蛋白質(zhì)的主要場所，ERS引起了蛋白質(zhì)分泌的變化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體偶聯(lián)密切，是具有翻譯功能的機(jī)器，ERS抑制了蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胰島素的減少；轉(zhuǎn)錄水平胰島素上調(diào)的現(xiàn)象，可能原因是ERS狀態(tài)下的胰島β細(xì)胞嘗試自我修復(fù)，加強(qiáng)負(fù)荷，代償性地在轉(zhuǎn)錄水平合成更多胰島素，具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

有研究表明，癌癥惡病質(zhì)能降低參與胰島素分泌的相關(guān)胰島蛋白的表達(dá)。Violato等[21]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，在皮下接種實體艾氏腫瘤細(xì)胞的小鼠中，參與胰島素分泌不同通路的關(guān)鍵蛋白在胰腺中表達(dá)明顯減少。也有研究[22]表明，惡性腫瘤能抑制胰島素的分泌，與對照組相比，Walker 256荷瘤大鼠的胰島在受到葡萄糖刺激時，胰島素分泌減少。ERS可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞衰竭，表現(xiàn)為胰島素分泌的喪失和因凋亡導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞數(shù)量下降[23-24]。

關(guān)于是何種介質(zhì)導(dǎo)致TERS現(xiàn)象的發(fā)生，有研究表明產(chǎn)生TERS現(xiàn)象的介質(zhì)可能與外泌體有關(guān)。Javeed等[14]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌將富含腎上腺髓質(zhì)素的外泌體釋放到血液中，胰島β細(xì)胞攝入此類外泌體后會出現(xiàn)ERS，導(dǎo)致胰島素分泌障礙、胰島功能受損。本實驗初步探究了口腔癌細(xì)胞通過TERS對胰島β細(xì)胞功能的影響，為TERS的機(jī)制研究打下基礎(chǔ)，有一定臨床研究價值，在為口腔癌患者提供有效的治療策略以提高患者預(yù)后方面有一定的臨床意義。

本實驗存在一定的局限性。首先由于沒有公認(rèn)的小鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系和人的胰島β細(xì)胞系的限制，本實驗使用了人的口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的CAL-27、SCC-25細(xì)胞和小鼠胰島素瘤6細(xì)胞系的MIN6細(xì)胞。MIN6細(xì)胞與胰島β細(xì)胞有共同的形態(tài)生理特征，當(dāng)受到刺激時，它們會分泌胰島素并表達(dá)特定的UPR標(biāo)志物，因此被廣泛用于研究[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)，ERS的CAL-27、SCC-25細(xì)胞分別與相應(yīng)同種細(xì)胞培養(yǎng)，后者能產(chǎn)生ERS；本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ERS的CAL-27、SCC-25細(xì)胞上清加入MIN6細(xì)胞，后者也能產(chǎn)生ERS，這在一定程度上體現(xiàn)了TERS現(xiàn)象物種的保守性。其次，本實驗研究均為體外實驗，未進(jìn)行體內(nèi)實驗，實驗結(jié)果證據(jù)較弱，未來可通過對小鼠定期注射TM、TCM、CCM，記錄小鼠的體重、血糖、血清胰島素變化，以及用免疫組化法檢測ERS標(biāo)志物和胰島素表達(dá)情況等實驗方法，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)了口腔癌細(xì)胞可通過TERS引起胰島β細(xì)胞應(yīng)激，導(dǎo)致其凋亡增加，存活能力下降，合成及分泌胰島素能力下降，在研究口腔癌癥惡病質(zhì)對胰島β細(xì)胞功能障礙中有一定的意義。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。