張秀娟 吳偉 陳欣 房芷純 葉金香 歐曉艷

南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330006

牙周炎（periodontitis）是一種復(fù)雜的慢性炎癥感染性疾病[1]。牙菌斑生物膜被認(rèn)為是牙周炎發(fā)病的始動(dòng)因子，主要毒力因子為牙齦卟啉單胞菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[2]。在牙周炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，牙菌斑首先導(dǎo)致牙齦的炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子介導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)在牙周組織的破壞和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。其最具代表性的促炎細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子（tumor necro‐sis factor，TNF）-α、白介素（interleukin，IL）-1β及IL-6。而IL-4、IL-10為強(qiáng)有力的抗炎細(xì)胞因子。在眾多的抗炎細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β和IL-10是控制免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[4]。

葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyani‐dins，GSPs）是從葡萄籽中提取，屬于多酚類(lèi)物質(zhì)，具有很強(qiáng)的生物活性，能清除自由基，是天然的抗氧化劑，同時(shí)還具有較低的毒性[5-6]。GSPs廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。在預(yù)防或減緩疾病發(fā)生的同時(shí)，還能提高機(jī)體免疫力，預(yù)防心血管疾病，在糖尿病[7-8]和全身炎癥性疾病等領(lǐng)域的應(yīng)用已有報(bào)道[9-10]。

本課題組前期通過(guò)檢測(cè)GSPs對(duì)牙齦卟啉單胞菌的最低抑菌濃度并采用鱟試驗(yàn)測(cè)定GSPs對(duì)牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生LPS及生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)GSPs對(duì)牙周致病菌分泌的內(nèi)毒素有抑制作用，同時(shí)對(duì)生物膜有破壞作用[11-12]；后期采用結(jié)扎大鼠第一磨牙并給予LPS刺激建立牙周炎模型，通過(guò)機(jī)械治療聯(lián)合GSPs的對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)GSPs有助于改善牙周組織炎癥及牙槽骨吸收程度、促進(jìn)牙槽骨改建[13]。本研究假設(shè)GSPs對(duì)牙齦上皮細(xì)胞炎癥有預(yù)防作用并從促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10及TGF-β入手，研究GSPs對(duì)炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子表達(dá)的影響以進(jìn)一步揭示GSPs預(yù)防牙周炎的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑

人牙齦上皮細(xì)胞（human gingival epithelial cells，HGECs）（上海佰曄生物科技中心），GSPs（天津尖峰天然產(chǎn)物有限公司），LPS（Sigma公司，美國(guó)），DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶－乙二胺四乙酸（ethylene di‐amine tetraacetic acid，EDTA）消化液（蘇州新賽美生物科技有限公司），胎牛血清、PBS（CellMax公司，澳大利亞），CCK-8試劑（APExBIO公司，美國(guó)），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（北京索萊寶科技有限公司），引物序列（深圳華大基因科技有限公司），TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（北京四正柏科技有限公司），SYBR Green試劑盒、FastKing cDNA、TRNzol試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 主要儀器

電子精密天平（Mettler Toledo公司，瑞士），倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本），臺(tái)式低溫冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)），超凈工作臺(tái)（ESCO公司，美國(guó)），逆轉(zhuǎn)錄儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），ABIStepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（ABI公司，美國(guó)），CO2培養(yǎng)箱、NanoDrop超微量紫外線分光光度計(jì)（Thermo Fisher公司，美國(guó)），多功能酶標(biāo)儀（Tecan公司，瑞士）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HGECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。每天更換1次培養(yǎng)基，每2～3 d傳代1次，取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 HGECs以5×103·mL-1的密度接種至96孔板12 h后吸出培養(yǎng)液，PBS清洗2次后加入含有不同濃度GSPs（0、1、5、10、20、40、60、80、100μg·mL-1）的細(xì)胞培養(yǎng)液，作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)空白組（不含細(xì)胞），每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)6、12、24、48 h后，棄液，PBS清洗2次，每孔加100μL DMEM培養(yǎng)基和10μL CCK-8的無(wú)血清試劑混合液，培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm處的吸光度（OD值），計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。

1.3.3 ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β水平 HGECs以2×104·mL-1的密度接種于6孔板中，每孔1 mL。待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)組：以不同濃度GSPs（10、20、40μg·mL-1）處理細(xì)胞24 h后加入1.0μg·mL-1LPS，同時(shí)設(shè)對(duì)照組（Control組，僅采用培養(yǎng)基培養(yǎng)不做任何處理）、LPS組（GSPs濃度為0μg·mL-1，培養(yǎng)基中加入1.0μg·mL-1LPS），孵育24 h后收集上清。具體操作按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度OD450nm值。樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β含量，根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，QRT-PCR）法 檢 測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β的mRNA表達(dá)水平 預(yù)處理及分組同1.3.3，孵育24 h后棄液，PBS清洗2次。Trizol提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGFβ引物（表1）。使用ABI Stepone Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBRGreen試劑檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)水平。cD‐NA樣品反應(yīng)條件為95℃、30 s，95℃15 min，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)，循環(huán)延伸末端收集熒光信號(hào)。QRT-PCR數(shù)值的分析計(jì)算用2ΔΔCt分析。

表1 QRT-PCR所采用的引物Tab 1 Primers used QRT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析比較各組炎癥因子表達(dá)的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度GSPs對(duì)HGECs增殖的活性影響

不同濃度GSPs對(duì)HGECs增殖的活性影響結(jié)果見(jiàn)圖1。GSPs濃度為0～40μg·mL-1時(shí)細(xì)胞增殖無(wú)明顯差異，且細(xì)胞增殖活性在24 h時(shí)最高。本研究選擇10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1GSPs預(yù)處理細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度GSPs對(duì)HGECs增殖活性影響Fig 1 The effect of GSPs on the proliferation activity of HGECs

2.2 GSPs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β水平的影響

ELISA法檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組相比，LPS組TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β表達(dá)升高（P<0.05），IL-4表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）。與LPS組相比，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)降低（P<0.05），IL-4、IL-10和TGF-β表達(dá)升高（P<0.05）。

圖2 不同濃度GSPs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β水平的影響Fig 2 The effect of pretreatment with different concentrations of GSPs on LPS-induced HGECs inflammatory factors TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10 and TGF-βexpression levels

2.3 GSPs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)水平的影響

QRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，與LPS組相比，實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)降低（P<0.05），且隨著GSPs濃度的增加依次遞減；IL-4、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)升高（P<0.05），且隨著GSPs濃度的增加依次遞增。這表明，GSPs能明顯抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)。

圖3 不同濃度GSPs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-βmRNA表達(dá)水平的影響Fig 3 The effect of pretreatment with different concentrations of GSPs on LPS-induced HGECs inflammatory factors TNF-α，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10 and TGF-βmRNA expression levels

3 討論

牙周炎作為一種慢性炎癥性疾病，與全身健康密切相關(guān)，是心腦血管疾病、糖尿病、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病的重要危險(xiǎn)因素[14]。牙齦上皮細(xì)胞位于牙周組織表面，是宿主抵御外來(lái)病原微生物的第一道防線。除了充當(dāng)物理屏障外，還能分泌多種細(xì)胞炎性因子，參與先天免疫[15]。因此，預(yù)防牙齦上皮細(xì)胞的炎癥對(duì)于預(yù)防牙周炎至關(guān)重要。當(dāng)牙周組織局部侵襲與宿主免疫反應(yīng)失衡時(shí)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生[16]。炎癥反應(yīng)中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是錯(cuò)綜復(fù)雜的，例如，LPS可以直接誘導(dǎo)牙周細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1和IL-6[17]。IL-1β和TNF-α作為促炎細(xì)胞因子還可以誘導(dǎo)繼發(fā)性介質(zhì)，例如趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和前列腺素E2，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)擴(kuò)展、結(jié)締組織破壞和骨吸收[18-19]。LPS誘導(dǎo)的TNF-α可誘導(dǎo)IL-4和IL-10的合成[20]。IL-10是一種較全面地抑制人體免疫細(xì)胞合成和釋放的細(xì)胞因子，可抑制促炎性細(xì)胞因子（如IL-1，IL-6和TNF-α）從單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等中產(chǎn)生[21]。研究[22]發(fā)現(xiàn)，齦溝液中IL-4在治療前較低而經(jīng)基礎(chǔ)治療后明顯上升。TGF-β對(duì)所有淋巴細(xì)胞的增殖有直接的抑制作用，同時(shí)對(duì)其他炎癥細(xì)胞因子及所有的免疫密切相關(guān)細(xì)胞的功能有拮抗作用[23]。因此從細(xì)胞因子的角度預(yù)防炎癥可能成為牙周炎預(yù)防的有效手段。

近年來(lái)關(guān)于GSPs的研究報(bào)道較多，很多學(xué)者將其應(yīng)用于一些全身性疾病的預(yù)防研究，例如肺癌[24]、藥物引起的肝臟毒性[9]、骨關(guān)炎[25]等的預(yù)防研究，由此可見(jiàn)GSPs對(duì)炎癥有一定的預(yù)防作用。研究[10]發(fā)現(xiàn)，GSPs對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO、IL-1β、IL-10、IL-6、TNF-α的炎癥分子的mRNA表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，顯示出其抗炎性和免疫調(diào)節(jié)特性。Bashir等[26]研究GSPs在鎘誘導(dǎo)的大鼠胰腺細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用發(fā)現(xiàn)，GSPs可通過(guò)Nrf-2/HO-1信號(hào)傳導(dǎo)減弱氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防鎘誘導(dǎo)的大鼠氧化性胰腺炎；研究還發(fā)現(xiàn)鎘中毒時(shí)促炎細(xì)胞因子（TNF-α，IL-1β和IFN-γ）水平升高，而GSPs治療能夠降低促炎細(xì)胞因子水平。Liu等[27]探討了GSPs提取物在高脂飲食誘導(dǎo)肥胖中的作用發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充GSPs提取物可以顯著降低血漿中炎性因子（如TNF-α，IL-6和MCP-1）的水平，由此可見(jiàn)GSPs能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)水平。

本課題作為牙周炎天然藥物預(yù)防研究的前期基礎(chǔ)，研究結(jié)果顯示GSPs濃度在0～40μg·mL-1時(shí)對(duì)HGECs增殖活性無(wú)明顯影響，其低毒、安全性為后期實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。對(duì)于炎癥的預(yù)防研究發(fā)現(xiàn)，GSPs能夠抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平，同時(shí)提升抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TGF-β的表達(dá)水平。因此，GSPs對(duì)炎性細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)HGECs炎癥具有一定的預(yù)防作用。但本研究?jī)H對(duì)HGECs炎癥中促炎及抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究，今后尚需對(duì)炎癥因子的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。