高珺珊，吳清平，梁燕惠，雍天喬，李貽靜，張菊梅，薛亮

（廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

食源性諾如病毒（Norovirus，NoV）是全球引起貝類、漿果、沙拉等多類食品安全事件的重要微生物污染物。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)（2007～2015），諾如病毒在全球引發(fā)食源性疾病的各類病原中列首位（占總病例數(shù)20.7%）[1]，尤易引起群體性食品安全事件的暴發(fā)，社會(huì)與經(jīng)濟(jì)損失巨大[2,3]。我國是諾如病毒流行和導(dǎo)致食品安全事件的重要地區(qū)之一，在大多數(shù)省市被證實(shí)是引發(fā)食源性疫情的主要病原，對(duì)廣大民眾的健康造成了極大危害[4-7]，已成為當(dāng)今食品安全研究中的最薄弱環(huán)節(jié)之一。

抗體是食源性諾如病毒檢測(cè)和控制技術(shù)的重要基礎(chǔ)。在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，諾如病毒抗體被廣泛用于開發(fā)新型的免疫檢測(cè)技術(shù)。例如，Alhadrami等[8]利用金納米標(biāo)記諾如病毒特異性抗體開發(fā)了一種棉簽可視化納米檢測(cè)方法，可用于多種食品樣品（黃瓜、生菜和雞肉）中諾如病毒的檢測(cè)。Baek等[9]使用特異性多肽作為識(shí)別元件，開發(fā)了一種高靈敏度的電化學(xué)生物傳感器，可用于牡蠣中諾如病毒的檢測(cè)，最低檢測(cè)限為1.7 copies/mL。其中單克隆抗體（mAb）在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)Ω腥拘约膊〉脑\斷和治療都發(fā)揮了重要作用[10]。由于諾如病毒變異快且缺乏穩(wěn)定的體外細(xì)胞培養(yǎng)體系及小動(dòng)物感染模型，使其特異性抗病毒治療的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他食源性病毒病原體[11]。但研究者建立了一種受體阻斷試驗(yàn)，通過檢測(cè)抗體是否具有阻斷諾如病毒樣顆粒VLP與組織血型抗原HBGAs結(jié)合的能力，從而確定是否為中和抗體，該方法已被證明是體外中和試驗(yàn)的一種有效的替代方法[12-14]。因此諾如病毒抗體的研究對(duì)抗體改造具有重要作用。

每個(gè)抗體分子由兩條相同的重鏈和輕鏈組成，包括三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)抗原結(jié)合域（Fabs）決定高親和力地結(jié)合特定的分子靶標(biāo)，而可結(jié)晶區(qū)域（Fc）則與細(xì)胞受體結(jié)合來激發(fā)生物功能。Fab上的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），為抗原結(jié)合域的高變序列，決定抗體可以特異性針對(duì)靶抗原。單鏈抗體（ScFv）就是由VH、VL和鏈間二硫鍵組成。在結(jié)構(gòu)上，其具有一定的彈性及蛋白酶抗性，存在抗原結(jié)合位點(diǎn)，利用重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)抗體低成本快速生產(chǎn)[15,16]。

本團(tuán)隊(duì)前期在對(duì)我國食源性諾如病毒遺傳多樣性研究的基礎(chǔ)上，成功制備了針對(duì)GII.4、GII.17等主要流行基因型的高效單克隆抗體[17,18]。然而單克隆抗體基因的克隆是人工設(shè)計(jì)和制備改造抗體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此在本研究中，以食源性諾如病毒GII.17型1E3高效單克隆抗體為對(duì)象，克隆并系統(tǒng)分析了其重鏈和輕鏈可變區(qū)基因序列和結(jié)構(gòu)特征，以期為制備可應(yīng)用于食品安全檢測(cè)和控制領(lǐng)域基因工程抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 細(xì)胞株、載體及細(xì)胞

分泌食源性諾如病毒GII.17型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1E3為本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，PMD19-T克隆載體及DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

細(xì)胞總RNA提取試劑盒及單組份TMB顯色液，北京天根生化科技有限公司；凝膠DNA小量回收試劑盒，美基生物有限公司；高糖 DMEM 及南美胎牛血清，美國Gibco公司；PBS緩沖液、PBST緩沖液、ELISA包被液及ELISA終止液，北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG抗體，北京博奧森生物有限公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase、ExtaqPolymerase、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，大連寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取出一支液氮凍存的分泌GII.17型諾如病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 1E3，37 ℃水浴使其融化，150 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞懸液鋪于96孔細(xì)胞板傳代培養(yǎng)，再將傳代的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板，每孔補(bǔ)充上述培養(yǎng)基至1 mL，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體評(píng)價(jià)

利用間接ELISA方法測(cè)定上述24孔板內(nèi)復(fù)蘇培養(yǎng)的1E3細(xì)胞上清是否正常分泌GII.17型諾如病毒單克隆抗體，首先取96孔ELISA板用1 μg/mL的GII.17 P顆粒100 μL于4 ℃包被12 h，然后用PBST洗板3次，每次5 min。再用現(xiàn)配的5%脫脂牛奶200 μL/孔于37 ℃靜置封閉2 h，PBST洗板3次，每次5 min。取孔板內(nèi)雜交瘤細(xì)胞長至 70%左右的細(xì)胞上清稀釋100倍，稀釋液以100 μL/孔加入96孔板中，同時(shí)以加入100 μL PBS緩沖液作為陰性對(duì)照孔，在37 ℃下靜置孵育1 h。用PBST洗板4次，每次5 min。加入3000倍稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠IgG抗體，在37 ℃靜置孵育30 min，然后洗板4次，每次5 min。每孔加入單組份TMB顯色液100 μL，避光條件下孵育10 min，每孔加入50 μL ELISA終止液。酶標(biāo)儀讀取光密度（OD）在450 nm處的值，以P（樣品OD450值）/N（陰性對(duì)照OD450值）≥2.1判定為陽性。

1.2.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取一瓶細(xì)胞總數(shù)大于5×106cells 300 r/min離心10 min，棄除全部培養(yǎng)基上清，并用PBS緩沖液清洗兩次，再次300 r/min離心10 min收集細(xì)胞沉淀，然后按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書操作步驟提取雜交瘤細(xì)胞總 RNA，取 5 μL總 RNA 為模板，使用PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃15 min，最終得到cDNA。

1.2.4 VH和VL基因的擴(kuò)增及克隆

取兩支PCR管，各加入1.2.1中1 μL的cDNA作為模板，取 25 μL高保真酶 PrimeSTAR Max DNA Polymerase，VH和VL的上下游組合引物由上海捷瑞公司合成（體系中包含每個(gè)引物200 nmol/L）[19]，最終體系用ddH2O補(bǔ)到50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min；72 ℃ 5 min，共30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定及膠回收。用 Extaq將回收產(chǎn)物末端加腺嘌呤后連接至PMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于加入氨芐、IPTG、X-gal的瓊脂平板，培養(yǎng)皿倒置于 37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，選取陽性菌落搖菌后送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 序列比對(duì)分析

首先利用NCBI數(shù)據(jù)庫Ig Blast對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析確定 VH和 VL基因核苷酸序列，再利用IMGT及Vbase2數(shù)據(jù)庫對(duì)VH和VL的氨基酸序列進(jìn)行分析，確定VH和VL基因所屬家族，標(biāo)識(shí)VH和VL的氨基酸序列高變區(qū)域互補(bǔ)決定區(qū)CDR、骨架區(qū)域FR及關(guān)鍵氨基酸組成。

1.2.6 VH及VL同源建模及分子對(duì)接

以諾如病毒衣殼P蛋白與本研究獲得的單克隆抗體VL及VH序列為基礎(chǔ)，選擇PDB數(shù)據(jù)庫中同源性最高的晶體結(jié)構(gòu)為模板，使用Modeller 10.2軟件[20]進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，以及ZDOCK 2.3.2軟件[21]進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果與討論

2.1 雜交瘤細(xì)胞1E3分泌諾如病毒抗體檢測(cè)

雜交瘤細(xì)胞具有不穩(wěn)定性，長期凍存后復(fù)蘇、從小孔擴(kuò)大到大孔的傳代過程以及更換新的條件培養(yǎng)，均有可能會(huì)導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞發(fā)生染色體丟失，從抗體分泌陽性變?yōu)殛幮?。因此要避免?duì)雜交瘤細(xì)胞頻繁操作，長期凍存的雜交瘤細(xì)胞需要定期復(fù)蘇篩選陽性克隆后繼續(xù)凍存，為滿足本實(shí)驗(yàn)單克隆抗體可變區(qū)擴(kuò)增需求，首先必須確定雜交瘤細(xì)胞的分泌情況。

表1 間接ELISA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞1E3細(xì)胞上清分泌抗體情況Table 1 Determination of antibody secreted in the supernatant of hybridoma cell 1E3 of by indirect ELISA method

取實(shí)驗(yàn)室凍存的雜交瘤細(xì)胞1E3進(jìn)行分泌抗體情況測(cè)定，利用間接 ELISA方法，包被抗原為 GII.17型諾如病毒單克隆抗體免疫原P蛋白，經(jīng)測(cè)定陰性對(duì)照孔OD450值為0.085，24孔板稀釋100倍的雜交瘤細(xì)胞上清與GII.17型P蛋白反應(yīng)情況如表1所示，其中41.67%（10/24）的孔檢測(cè)結(jié)果為陰性，包括A4、B2、B3、B5、B6、B7、C2、C4、C5、C8，取 OD450的值大于1的陽性孔細(xì)胞混合后擴(kuò)大培養(yǎng)，OD450的值大于1表明分泌抗體活性較好，將部分細(xì)胞凍存后，剩余細(xì)胞擴(kuò)大至單瓶 T25，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)大于 5×106cells，可用于細(xì)胞總RNA提取。

2.2 諾如病毒單克隆抗體1E3 VH和VL基因的擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的雜交瘤細(xì)胞cDNA為模板，通過PCR對(duì)單克隆抗體1E3的VH和VL片段進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到360 bp和339 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物均在300 bp左右可見一條清晰條帶。單克隆抗體Ig分子重鏈和輕鏈可變區(qū)為近N端氨基酸變化較大的區(qū)域，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域長度從100個(gè)氨基酸殘基到120個(gè)氨基酸殘基不等，故表明擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期相符，VH和 VL片段均擴(kuò)增成功。

2.3 諾如病毒單克隆抗體1E3 VH和VL基因的克隆及鑒定

將目的基因回收后，連接至 PMD-19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后過夜培養(yǎng)，從LB抗性平板中挑選陽性克隆進(jìn)行重組質(zhì)粒菌落PCR鑒定。結(jié)果如圖2，菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，可見在目的片段大小有特異性條帶，各取3個(gè)陽性菌落搖菌培養(yǎng)過夜后，送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

2.4 諾如病毒單克隆抗體1E3 VH和VL的結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)測(cè)序結(jié)果的IgBlast比對(duì)，確定了VH和VL結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。VH基因全長均為360 bp，編碼120個(gè)氨基酸，屬于IGHV3-2*02家族；VL基因全長為339 bp，編碼113個(gè)氨基酸，屬于IGKV1-135*01家族。Ig輕鏈有兩型：k型與λ型，不同種屬兩型輕鏈比例不同，小鼠的兩型比例為20:1，1E3輕鏈屬于k型。Ig Blast數(shù)據(jù)庫基因進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VH基因與小鼠重鏈可變區(qū)基因同源性最高為97%，VL基因與小鼠輕鏈可變區(qū)基因同源性最高為97%，從而確定克隆得到的目標(biāo)序列為小鼠重鏈及輕鏈可變區(qū)基因序列。

單克隆抗體中負(fù)責(zé)高親和力和特異性的結(jié)合抗原的序列在VH和VL鏈上，這些序列在抗體與抗體之間差異很大。在可變區(qū)內(nèi)有6個(gè)環(huán)（VH和VL各3個(gè)），稱為CDR，它們主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原靶標(biāo)。這些CDR平均總計(jì)大約60個(gè)氨基酸殘基，長度一般從7個(gè)氨基酸殘基到25個(gè)殘基不等。利用Ig BlastIMGT及Vbase2數(shù)據(jù)庫分析1E3的VH和VL的氨基酸序列，確定了單克隆抗體1E3的CDR區(qū)域和FR框架區(qū)域，兩者均含有4個(gè)FR區(qū)和3個(gè)CDR區(qū)，表明序列結(jié)構(gòu)完整。V基因、D基因和J基因與IMGT數(shù)據(jù)庫中最相似的胚系基因如表2所示。

表2 食源性諾如病毒單克隆抗體1E3的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因序列在IMGT數(shù)據(jù)庫中的比對(duì)結(jié)果Table 2 Results for alignment of VH and VL domains of anti-foodborne mAb 1E3 in IMGT database

2.5 影響單克隆抗體功能的關(guān)鍵氨基酸組成分析

單抗分子的氨基酸序列鑒定，二硫鍵及糖基化位點(diǎn)的確認(rèn)對(duì)于抗體分子的質(zhì)量十分重要[22,23]。1E3的VH和VL的氨基酸組成如圖5所示，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是 VH中含量最豐富的氨基酸，分別占14.2%、12.5%和10.0%；絲氨酸、亮氨酸和甘氨酸是VL中含量最豐富的氨基酸，分別占12.4%、11.5%和9.7%。單抗肽鏈分子中的天冬酰胺殘基可以與糖鏈的還原端連接形成不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖基化蛋白，也就是N-糖基化修飾[24,25]。1E3的VH和VL中分別包含5個(gè)和1個(gè)天冬氨酸，這些位置可以用于設(shè)計(jì)嵌合式結(jié)構(gòu)。此外，還需要進(jìn)一步的研究來確定其他重要的翻譯后修飾位點(diǎn)，例如谷氨酸也是一種重要的翻譯后修飾的氨基酸，聚谷氨?；强贵w的可逆修飾，對(duì)抗體親和力和其他生物學(xué)特性有一定的影響[26,27]。

二硫鍵是一種共價(jià)鍵，抗體分子內(nèi)均存在鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵，輕鏈與重鏈就是由二硫鍵連接形成得四肽鏈分子，鏈內(nèi)二硫鍵折疊成得球形區(qū)域就是抗體的功能區(qū)，該區(qū)域的氨基酸具有高度的同源性。二硫鍵是穩(wěn)定蛋白空間結(jié)構(gòu)的重要因素，同時(shí)可以利用二硫鍵穩(wěn)定重組抗體來實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)[28-30]。VH 和 VL分子結(jié)構(gòu)中潛在的二硫鍵位點(diǎn)如表3所示，這些殘基可以參與天然分子內(nèi)和分子外二硫鍵的形成，并可用于構(gòu)建含有重、輕鏈可變區(qū)的重組載體。

表3 食源性諾如病毒單克隆抗體1E3的重鏈可變區(qū)分子中的二硫鍵Table 3 Disulfide bonds inanti-foodborne NoV mAb 1E3 VH

2.6 諾如病毒衣殼P蛋白與VH和VL分子對(duì)接

根據(jù)數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果，GII.17型P蛋白、1E3的VL鏈和VH鏈分別采用6EWB[31]的D、L和H鏈為模板，P蛋白與抗體VH和VL分子對(duì)接結(jié)果如圖6所示，可見GII.17 P蛋白抗原結(jié)合在VH和VL形成的腔體內(nèi)。分子對(duì)接分析表明抗原-抗體作用能為-885.0 kcal/mol，其中范德華相互作用能為-20.6 kcal/mol，靜電相互作用能為-864.5 kcal/mol。抗體重鏈位點(diǎn)D108通過氫鍵與病毒衣殼P蛋白上N195結(jié)合固定了抗原與抗體的結(jié)合構(gòu)像，為抗體識(shí)別P蛋白抗原的關(guān)鍵氨基酸殘基。

3 結(jié)論

3.1 食源性諾如病毒是全世界非細(xì)菌性胃腸炎和食源性疾病的重要病因，貝類、漿果、生菜、水產(chǎn)品都是其傳播媒介。但目前無論是減緩病毒在人群中的傳播，還是預(yù)防或治療免疫缺陷者的感染，都沒有有效的抗病毒療法。此外，目前還沒有進(jìn)行正式的抗諾如病毒藥物臨床試驗(yàn)。人工改造抗體藥物是目前的研究熱點(diǎn)，其中以柔性接頭連接單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的 ScFv可以實(shí)現(xiàn)在體外穩(wěn)定高效的表達(dá)，因此抗體的測(cè)序分析至關(guān)重要。本研究以分泌食源性諾如病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1E3為基礎(chǔ)，成功擴(kuò)增并克隆了1E3的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)序列。通過Ig blast中IMGT數(shù)據(jù)庫比對(duì)測(cè)序結(jié)果，證明擴(kuò)增的VH和VL序列為小鼠抗體可變區(qū)序列，其中VH基因全長均為360 bp，編碼120個(gè)氨基酸；VL基因全長為339 bp，編碼113個(gè)氨基酸。進(jìn)一步確定了VH和VL基因具有完整的CDR和FR區(qū)域，兩者均有含有4個(gè)FR區(qū)和3個(gè)CDR區(qū)，其中VH屬于IGHV3-2*02家族，VL屬于IGKV1-135*01家族。

3.2 通過關(guān)鍵氨基酸組成分析，確定蘇氨酸和酪氨酸是VH中含量最豐富的氨基酸，分別占14.2%、12.5%和10.0%；絲氨酸、亮氨酸和甘氨酸是VL中含量最豐富的氨基酸，分別占12.4%、11.5%和9.7%。適合設(shè)計(jì)嵌合式結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵位點(diǎn)天冬氨酸，1E3的VH和VL中分別包含5個(gè)和1個(gè)。VH和VL分子結(jié)構(gòu)中各還有一個(gè)潛在的二硫鍵位點(diǎn)，并可用于構(gòu)建含有重、輕鏈可變區(qū)的重組載體。GII.17型P蛋白與1E3抗體可變區(qū)分子對(duì)接結(jié)果表明抗體重鏈上位點(diǎn)D108通過氫鍵與病毒衣殼P蛋白上N195結(jié)合，為抗體識(shí)別P蛋白抗原的關(guān)鍵氨基酸殘基。綜上所述，食源性諾如病毒單克隆抗體VH和VL片段基因序列的分析對(duì)食源性諾如病毒單鏈抗體的克隆表達(dá)及抗體的精準(zhǔn)改造具有重要意義。