藍祝晶，王繼龍，王玨，易麒麟，王維，黃柯豫，金宗睿，吳國林，朱海，徐邦浩，郭雅，文張

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西南寧530021）

原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥和第三大癌癥相關(guān)死亡原因。 其中， 肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌最常見病理類型（占75%～85%）。世界癌癥最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新增HCC 病例約724 800 例，死亡約664 000 例[1]。而我國HCC 的發(fā)病率和病死率仍居世界首位，是第二大癌癥相關(guān)死亡原因[2]。盡管HCC 患者的早期發(fā)現(xiàn)率已有很大提高，但5年生存率仍然不到35%[3]。HCC 是一種異質(zhì)性很強的疾病，遺傳變異和細胞微環(huán)境對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有一定影響[4]。目前，獲得普遍認可的HCC 早期診斷的方法包括甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）檢測、B 超和CT 等影像檢查，但存在一定的誤診率[5-6]。因此，深入探討HCC 的發(fā)生發(fā)展機制，尋找敏感度高的分子標志物，對HCC早期診斷、臨床治療和預(yù)后預(yù)測有著重要的意義。

驅(qū)動蛋白超家族蛋白（kinesin superfamily proteins，KIFs） 分為14 個亞家族[7]，是以微管（MT）為基礎(chǔ)的馬達蛋白，含有一個保守的運動催化結(jié)構(gòu)域，與ATP 結(jié)合并水解ATP，產(chǎn)生能量，從而參與各種細胞質(zhì)成分的運輸和MT 穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)[8]。驅(qū)動蛋白超家族成員在細胞分裂中起著關(guān)鍵作用，特別是在有絲分裂不同階段，參與調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的形成、取向和伸長，以及有絲分裂中染色體的分離[9]。KIF4A 是KIFs 中的一員，也是重要的染色體相關(guān)分子馬達，定位于人類基因組中的Xq13.1，編碼1 個由1 232 個氨基酸組成的分子量為140 kDa 的蛋白質(zhì)[10]。KIF4A 參與了多種重要的細胞過程，特別是有絲分裂過程中染色體凝聚和分離的調(diào)控[11]，KIF4A 的異常表達被認為與紡錘體異常分離和子細胞的非整倍體有關(guān)[12]，從而進一步導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的異常分布。既往研究發(fā)現(xiàn)，KIF4A 在腎細胞癌組織中表達上調(diào)，且KIF4A高表達與腎細胞癌患者的腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后顯著相關(guān)，可作為腎細胞癌的潛在治療靶點[13]。在食管癌中的研究表明，KIF4A 可通過調(diào)控Hippo信號促進腫瘤細胞增殖、遷移并提示食管鱗狀細胞癌患者的不良預(yù)后[14]。而在肺腺癌、膽管癌、乳腺癌、膀胱癌中的研究顯示，KIF4A 與上述腫瘤的進展密切相關(guān)，并具有一定的預(yù)后預(yù)測價值[15-18]。目前，KIF4A 在HCC 中的研究報道相對較少，因此，本研究擬采用生物信息學方法結(jié)合免疫組織化學染色分析KIF4A 基因在HCC 中的表達水平及預(yù)后價值，并探討其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA 數(shù)據(jù)庫門戶網(wǎng)站（https://portal.gdc.cancer.gov） 下 載HCC 的mRNA 表達數(shù)據(jù)，包含有374 例肝腫瘤組織和50 例正常肝組織，并同時下載相關(guān)臨床病理資料的數(shù)據(jù)集，臨床病理資料包括年齡、性別、腫瘤臨床分期、腫瘤組織學分級、TMN 分級和生存時間等。

1.2 KIF4A在正常肝組織和HCC組織中的表達驗證

利用從TCGA 下載的基因表達數(shù)據(jù)，通過R 軟件（4.0.4）中“Limma”包工具分析KIF4A 在正常肝組織和HCC 組織中的表達水平。

1.3 列線圖的構(gòu)建

將相關(guān)臨床病理因素納入預(yù)測模型，使用R軟件（4.0.4） 中“Hmisc”、“l(fā)attice”、“Formula”、“ggplot2”、“foreign”和“rms”包工具構(gòu)建預(yù)測HCC 患者預(yù)后的列線圖。

1.4 患者組織樣本和倫理聲明

回顧性收集2020年1月—2020年3月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行肝腫瘤切除術(shù)的20 例HCC 患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織標本（切片厚度4 μm），10%中性福爾馬林室溫固定16 h，石蠟包埋。入選標準如下：⑴性別不限，年齡＞18 歲；⑵肝腫瘤根治性切除；⑶病理診斷為HCC。排除標準包括：⑴合并其他腫瘤；⑵術(shù)前接受放療或化療；⑶拒絕簽署知情同意書。本研究是根據(jù)“赫爾辛基宣言”進行的，在研究之前，所有患者都簽署了知情同意書，并獲得了倫理委員會批準。

1.5 免疫組化染色

對石蠟包埋的組織樣本切片后進行脫蠟并水化。用檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L）高壓12 min 進行抗原修復(fù)，冷卻5 min，然后PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次。再用3%過氧化氫溶液處理，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。用山羊血清白蛋白（BSA）封閉，后加入稀釋的一抗，在4 ℃下孵育過夜。次日加二抗，室溫敷育20 min，PBS 緩沖液洗滌3 min×3 次。DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、0.25%的鹽酸乙醇中浸沒后洗滌，室溫晾干后封片。

1.6 基因集富集分析（GSEA）

為了分析KIF4A 潛在調(diào)控的分子信號通路，我們使用從TCGA 獲得的標準化RNA-Seq 數(shù)據(jù)進行基因集富集分析。以75%的臨界值為基礎(chǔ)，在轉(zhuǎn)錄組水平上分析KIF4A 高表達和低表達之間的代謝途徑和生物學過程。采用GSEA 軟件（v4.1.0） 對KIF4A 高表達和低表達之間的差異代謝途徑和生物過程進行分析。GESA 參數(shù)設(shè)置選擇c2KEGG 基因集（c2.cp.kegg，V6.2.symbol s.gmt），基因集排列數(shù)量設(shè)定為1 000 個，標準化的P＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率＜0.25 的富集結(jié)果被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 KIF4A基因在HCC組織中高表達

利用從TCGA 下載的HCC 基因表達數(shù)據(jù)，使用R 軟件（4.0.4） 中“Limma”包工具分析KIF4A 在正常肝組織和HCC 組織中的表達水平。如圖1 所示，KIF4A 在HCC 組織中的表達水平顯著高于正常肝組織（P＜0.001）。

2.2 KIF4A表達與臨床病理特征的關(guān)系

進一步分析KIF4A 表達水平與HCC 患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，KIF4A 表達水平與組織學 分 級（P＜0.001）（圖2A）、臨床分期（P＜0.001）（圖2B）明顯有關(guān)。與KIF4A 低表達患者相比，KIF4A 高表達HCC 患者組織學分級和臨床分期往往更高。

2.3 KIF4A表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)KIF4A 表達量的中位值將HCC 患者分為KIF4A 高表達組和低表達組。采用Kaplan-Meier 生存分析方法分析KIF4A 高表達組和低表達組患者的生存狀況。如圖3A 所示，KIF4A 高表達組患者總體生存時間（overall survival，OS）明顯短于低表達組患者（P=0.002）。采用隨時間變化的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估KIF4A 在TCGA 數(shù)據(jù)集中預(yù)測HCC 預(yù)后的敏感度和特異度。結(jié)果顯示ROC 曲線1、3、5年OS 的曲線下面積（area under curve，AUC） 分別為0.783、0.662、0.574 （圖3B），提示KIF4A 預(yù)測HCC 患者預(yù)后的敏感度和特異度較高。上述數(shù)據(jù)表明KIF4A高表達提示HCC 患者預(yù)后差，是一個潛在的HCC預(yù)后預(yù)測分子標志物。

采用Cox 回歸單、多因素分析探討影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。單因素Cox 回歸分析結(jié)果表明，HCC 患者的臨床分期（HR=2.084，95%CI=1.590～2.733，P＜0.001）、T 分期（HR=1.980，95%CI=1.541～2.543，P＜0.001）和KIF4A表達水平（HR=1.113，95%CI=1.062～1.167，P＜0.001）與OS明顯有關(guān)；多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，KIF4A 高表達（HR=1.089，95%CI=1.034～1.147，P=0.001）是影 響HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素（表1）。

表1 Cox回歸分析HCC患者預(yù)后的獨立危險因素Table 1 Cox regression analysis of independent risk factors affecting the prognosis of patients with HCC

2.4 列線圖預(yù)測HCC患者預(yù)后

綜合分析包括KIF4A 表達水平在內(nèi)的各臨床病理因素與HCC 患者預(yù)后的關(guān)系，并利用R 軟件繪制列線圖，以便更直觀地了解各臨床病理因素對HCC 患者預(yù)后的預(yù)測能力。將不同的臨床病理因素賦予相應(yīng)的分值，通過相加得到總分值，最后根據(jù)總分值評估每位HCC 患者的1、3、5年生存率。列線圖上的總分值越高，提示預(yù)后越差。從圖4 可以看出，KIF4A 表達水平對總分值有顯著影響，而其他臨床病理因素對總評分的影響相對較小。

2.5 免疫組化法證實KIF4A 在HCC 組織中高表達

應(yīng)用免疫組織化學方法檢測HCC 組織和相應(yīng)癌旁肝組織中KIF4A 蛋白的表達和亞細胞定位。KIF4A 蛋白的免疫染色主要定位于HCC 細胞的胞漿和胞核中。KIF4A 在HCC 組織中呈陽性表達，而在癌旁肝組織中呈弱陽性或陰性表達。與相應(yīng)癌旁組織相比，HCC 組織中KIF4A 蛋白的表達水平顯著升高（圖5）。

2.6 KIF4A基因功能富集分析

通過GSEA 富集分析，探討KIF4A 潛在的生物學功能。結(jié)果顯示，與KIF4A 高表達相關(guān)的基因集參與調(diào)控堿基切除修復(fù)、細胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、mTOR 信號通路、核酸切除修復(fù)、P53 信號通路、癌癥通路、磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)等9 條信號通路（圖6）。

3 討 論

HCC 是最常見腫瘤之一，近年來其患病率持續(xù)上升[19]。肝切除、肝移植和局部消融術(shù)仍然是目前最有效根治手段，但HCC 患者5年生存率依然較低[20-21]。很多HCC 患者在確診時就已經(jīng)處于中晚期且常合并有嚴重的肝硬化，這些患者不適合行手術(shù)切除或肝移植治療[22]。因此，尋找到新的敏感度高的分子標志物和治療靶點對改善HCC 患者預(yù)后至關(guān)重要。

KIFs 共有一個保守的運動區(qū)，并且有一類微管依賴的分子馬達蛋白被證明參與多種細胞活動，包括有絲分裂、細胞器和囊泡運輸?shù)取IF4A 是一種屬于Kinesin 4 亞家族的N 型Kinesin，含有ATP酶/運動結(jié)構(gòu)域，可以與微管結(jié)合，提供動力，在有絲分裂紡錘體形成和染色體分離過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。以往研究發(fā)現(xiàn)，KIF4A 在一些惡性腫瘤中高表達與患者的不良預(yù)后有關(guān)。如Song 等[15]基于生物信息學分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 作為樞紐基因，促進肺腺癌的進展，與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，并可能成為肺腺癌治療的潛在治療靶點。Yang 等[24]綜合生物信息學分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 是與卵巢癌患者預(yù)后密切相關(guān)的關(guān)鍵基因，可作為卵巢癌潛在的預(yù)后生物標志物。此外，Huang 等[25]基于Oncomine 數(shù)據(jù)庫的Meta 分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 基因在HCC 中表達上調(diào)，并通過激活A(yù)kt 信號促進細胞增殖并預(yù)測HCC的不良預(yù)后。也有文獻[26]報道上調(diào)KIF4A 的表達可促進FOXM1 介導(dǎo)的HCC 細胞增殖和腫瘤生長，提示FOXM1-KIF4A 軸可能成為HCC 治療的潛在靶點。Matsushita 等[27]利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的DNA 甲基化數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 啟動子附近的CpGis 低甲基化，并與HCC 的預(yù)后密切相關(guān)。本研究使用TCGA 肝癌數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 在HCC 組織中的表達顯著高于正常肝組織，還通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的癌旁組織相比，HCC 組織中KIF4A 蛋白的表達水平顯著升高，進一步驗證了KIF4A 基因在HCC 組織中可能發(fā)揮致癌作用。 臨床病理因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 表達與HCC 患者的組織學分級、臨床分期顯著相關(guān)。Li 等[28]基于UALCAN 在線數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 上調(diào)與HCC 患者的腫瘤分期和病理分級密切相關(guān)，這與本研究結(jié)果一致。本研究分析KIF4A 高表達和低表達患者的生存預(yù)后，結(jié)果顯示KIF4A 高表達組患者總體生存時間短于低表達組患者。此外，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)構(gòu)建了預(yù)測HCC 患者預(yù)后的列線圖，有助于更加直觀地了解KIF4A 表達水平在HCC 預(yù)后預(yù)測方面的重要性。Cox 回歸單因素分析顯示HCC 患者的臨床分期、T 分期和KIF4A 表達水平與OS 顯著相關(guān)；Cox 回歸多因素分析發(fā)現(xiàn)KIF4A 高表達是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。上述研究結(jié)果顯示，KIF4A 高表達提示HCC 患者預(yù)后差，有可能成為HCC 患者預(yù)后預(yù)測的潛在分子標志物。

為了探討KIF4A 在HCC 進展中的潛在分子機制，本研究使用從TCGA 獲得的標準化RNA-Seq 數(shù)據(jù)進行GSEA 富集分析。結(jié)果提示KIF4A 基因高表達組HCC 樣本主要富集于堿基切除修復(fù)、細胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、mTOR 信號通路、核酸切除修復(fù)、P53 信號通路、癌癥通路、磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)通路等生物學過程。以往研究表明，KIF4A 參與細胞周期調(diào)控并在DNA 修復(fù)、DNA 復(fù)制、紡錘體組織和胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用[29-30]。Wang 等[31]報道KIF4A 可通過細胞周期相關(guān)途徑促進食管鱗狀細胞癌的細胞增殖和遷移。最近研究[32]表明KIF4A 可加快乳腺癌的進展，并參與調(diào)控錯配修復(fù)、P53 信號通路。在HCC 中，Chen 等[33]研究發(fā)現(xiàn)KIF4A 可通過調(diào)控細胞周期促進腫瘤進展，并與HCC 患者預(yù)后顯著相關(guān)。Hou 等[34]研究顯示KIF4A 通過影響細胞周期、有絲分裂相關(guān)通路和P53 信號通路促進HCC 細胞增殖和遷移。此外，Li等[28]也報道了KIF4A 參與HCC 細胞的細胞周期調(diào)控，并與HCC 的不良預(yù)后有關(guān)。與上述研究結(jié)果一致，本研究GSEA 富集分析結(jié)果也表明KIF4A 高表達可能通過細胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、P53 信號通路促進HCC 的進展，從而導(dǎo)致HCC患者預(yù)后不良。此外，本研究中GSEA 富集分析結(jié)果提示KIF4A 影響HCC 預(yù)后的潛在機制可能還涉及堿基切除修復(fù)、mTOR 信號通路、核酸切除修復(fù)、癌癥通路、磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)通路等途徑，此發(fā)現(xiàn)進一步拓寬了對KIF4A 在HCC 發(fā)生發(fā)展過程中作用的認識。然而，這些機制尚需在后續(xù)研究中使用體內(nèi)和體外實驗進一步驗證。

綜上所述，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，結(jié)合免疫組織化學驗證，發(fā)現(xiàn)KIF4A 在HCC 組織中高表達，且提示HCC 患者預(yù)后差，KIF4A 表達水平是影響HCC 患者預(yù)后的獨立危險因素，提示KIF4A 有可能成為HCC 患者預(yù)后預(yù)測的潛在分子標志物。GSEA 富集分析進一步顯示堿基切除修復(fù)、細胞周期調(diào)控、DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、mTOR 信號通路、核酸切除修復(fù)、P53 信號通路、癌癥通路、磷脂酰肌醇信號傳導(dǎo)通路等可能在KIF4A 促進HCC 進展中發(fā)揮重要作用，這為以后進一步闡明KIF4A 在HCC 發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。