李香串,呂鼎豪,李震宇,曲繼旭,張豆豆,董曉麗,張文靜
(1.山西省醫(yī)藥與生命科學研究院,山西太原030006;2.山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中心,山西太原030006;3.山西省藥品檢查中心,山西太原030006)
2020年版《中國藥典》(一部)規(guī)定柴胡為傘形 科植物柴胡(BupleurumchinenseDC.)或狹葉柴胡(BupleurumscorzonerifoliumWilld.)的干燥根[1]。柴胡性苦味平,具有透表泄熱、疏肝解郁、升陽舉陷的作用,為治療少陽證的要藥[2]。柴胡是大宗藥材,野生資源已經(jīng)不能滿足市場的需求,栽培柴胡日漸成為主流的商品藥材。
栽培柴胡多以種子繁殖為主,田間播種后2個月左右出苗,生產(chǎn)中普遍存在出苗不齊、成苗率低、苗期雜草危害嚴重等問題,影響了藥材的產(chǎn)量與質(zhì)量。柴胡套種栽培是當前一種常見的生態(tài)種植模式,其優(yōu)點是高桿作物能為苗期柴胡提供適當遮蔭,同時能起到改善光熱資源的合理分配,抑制雜草生長,增加土壤環(huán)境多樣性,減少病蟲害的發(fā)生和除草劑的使用,有利于增產(chǎn)增收。田間試驗結(jié)果表明,當遮陰度為80%,有效光照為6 000~8 500 lx時,適合柴胡幼苗生長發(fā)育,柴胡出苗率最高。山西氣候干旱,地形多以高原、山地為主,玉米、谷子是山西的主要糧食作物,從南到北均有分布種植。經(jīng)檢測玉米、谷子地的平均遮陰度分別為78%和85%,滿足柴胡生長發(fā)育特點和環(huán)境條件的要求,適合與柴胡套種。目前玉米/柴胡、谷子/柴胡套種作為代表性的糧藥套作生態(tài)種植模式已在山西省范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。
基于UPLC-MS的代謝組學技術(shù)利用高通量的檢測手段結(jié)合多元統(tǒng)計對植物提取物進行全面分析,具有整體觀的研究思路,適合對中藥材等復(fù)雜體系進行分析[3]。目前,已經(jīng)用于多種藥用植物的化學差異比較,如黃芩葉[4]、牡丹皮[5]、款冬花[6]等。本研究采用基于UPLC-MS的代謝組學技術(shù),對“谷子/柴胡套種”和“玉米/柴胡套種”兩種套種模式下北柴胡的化學成分進行比較,從化學組成角度闡明兩種套種模式下北柴胡的化學差異,為北柴胡的生態(tài)種植模式研究提供參考。
ExionLC?AD-超高效液相色譜儀(美國ABSci?ex公司);Triple TOF 5600+-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);Agilent 1260-液相色譜儀(美國Agilent公司);KQ-300型-超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BSA124S-分析天平(德國Sar?torius公司);超純水;甲酸、乙腈(色譜純,美國Ther?mo公司);甲醇(分析純,天津市大茂化學試劑廠)。對照品柴胡皂苷A(批號:17050105,質(zhì)量分數(shù)≥98%),柴胡皂苷D(批號:17050106,質(zhì)量分數(shù)≥98%)購于成都曼思特生物科技有限公司。
谷子/柴胡套種柴胡藥材(G1、G2、G3),玉米/柴胡套種的柴胡藥材(Y1、Y2、Y3)(生長年限3年)采收于山西省靈石縣,經(jīng)山西大學秦雪梅教授鑒定為柴胡為傘形科植物柴胡(B.chinenseDC.)的干燥根。
備樣方法和色譜條件參照2020版《中國藥典》柴胡項下柴胡皂苷A、柴胡皂苷D的含量測定方法[1]。色譜柱:Diamonsil II C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色譜柱;流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;進樣量為20μL。
1.4.1 供試品溶液的制備
取北柴胡藥材粉碎(過四號篩),稱取細粉2.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇10 mL,密塞,稱定重量,超聲(功率200 W,頻率40 kHz)處理30 min,放冷,搖勻,用甲醇補足失重,搖勻,濾過,過0.22μm微孔濾膜過濾,得供試品溶液。
1.4.2 色譜和質(zhì)譜條件
色譜柱采用Waters Acquity UHPLCHSST3 col?umn(2.1 mm×100 mm,1.8μm);流動相:0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B);梯度洗脫:0~15 min,10%~40%B;15~28 min,40%~75%B;28~33 min,75%~95%B;33~35 min,95%~95%B;35~37 min,95%~10%B。柱溫35℃,流速0.3 mL/min,進樣量3μL。
質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)分別采用正負離子模式分別掃描,離子源參數(shù)如下:噴霧電壓-4 500 V(負離子),5 500 V(正離子),離子源溫度550°C,噴霧氣(Gas 1)55 psi,加熱氣(Gas 2)55 psi,氣簾氣(CUR)30 psi,去簇電壓(DP)60 V。掃描模式采用TOF MS-IDA-Production scan,一個循環(huán)由一個TOF MSscan(累計時間0.25 s)和最多10個IDAProduct ion scan(累計時間0.09 s)組成。TOF MS掃描范圍為m/z100~1 500,Product ion scan掃描范圍為m/z50~1 250,二級碰撞能量(CE)為(40±20)eV。
通過查閱文獻,建立柴胡化學成分數(shù)據(jù)庫,采用Sciex OS軟件進行峰提取、峰匹配分析處理,與文獻報道的柴胡化學成分的精確分子量,同位素峰進行匹配,進一步結(jié)合文獻報道的質(zhì)譜裂解規(guī)律以及對照比對二級質(zhì)譜碎片進行鑒定。將超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(Ultra?high performance liquid chromatography?triple time of flight mass spectrometry)鑒定的各個化合物的峰面積所得到的數(shù)據(jù)矩陣,導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件中進行主成分分析(Principal component analysis,PCA),判斷各樣品的聚集情況;然后用正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)分析組間差異代謝物,并通過S-plot、變量重要性投影值(Variable importance on projection,VIP)值和t檢驗篩選確定。
將兩組北柴胡樣本的UHPLC-Triple TOF MS原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為“mzXML”格式后分組上傳至GNPS在線平臺(https://gnps.ucsd.edu)[3]。設(shè)定參數(shù)“Mini?mumcosinescore”、“Minimummatchedfragment ions”、“NetworkTopK”,建立分子網(wǎng)絡(luò),同一集群中的化合物均屬于同類化學成分。通過“View Spectra Families”功能可將分子網(wǎng)絡(luò)可視化,一個節(jié)點表示一個化合物,節(jié)點的顏色代表化合物所屬組別,藍色外圈的節(jié)點為與GNPS數(shù)據(jù)庫匹配的化合物。
根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的方法,分別對2種套種模式的北柴胡中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D進行含量測定(表1)。谷子/柴胡套種的北柴胡藥材中,柴胡皂苷A的含量范圍為0.12%~0.13%,柴胡皂苷D為0.18%~0.19%,總含量為0.30%~0.32%;玉米/柴胡套種的北柴胡藥材中,柴胡皂苷A的含量范圍為0.15%~0.16%,柴胡皂苷D為0.22%~0.23%,總含量為0.37%~0.39%,均達到《中國藥典》要求。
表1 不同套種模式下北柴胡中柴胡皂苷A、D的含量Table 1 Contents of saponins A and Din B.chinense under different intercropping patterns
對兩種套種模式的北柴胡進行t檢驗分析。由圖1可見,玉米/柴胡套種的北柴胡藥材中的柴胡皂苷A和柴胡皂苷D的含量顯著高于谷子/柴胡套種(P<0.01)。
圖1 柴胡皂苷在不同套種模式下的含量比較Fig.1 Comparison of content of saikosaponins in different interbreeding modes
采用UHPLC-Triple TOFMS對北柴胡中的化學成分進行定性分析,分別獲得正負離子模式下的一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),總離子流圖如圖2所示。對于有對照品的化合物,通過比對色譜保留時間,一級和二級質(zhì)譜信息進行確證,并分析其裂解規(guī)律。根據(jù)文獻報道[7-11]的柴胡化學成分分子式、質(zhì)譜裂解規(guī)律進行分析,共鑒定42種化合物,主要包括18個皂苷類成分,6個多炔類成分,4個黃酮類成分,9個有機酸類成分及5個其他類成分(表2)。其中谷子/柴胡套種的北柴胡藥材中共鑒定42個化合物,玉米/柴胡套種的北柴胡藥材中共鑒定41個化合物。兩種北柴胡含有的化學成分種類接近,但仍有不同之處。如黃酮類成分Kaempferol-7-O-rhamnoside僅在谷子/柴胡套種的北柴胡藥材中檢測到。
圖2 北柴胡的甲醇提取物在正(A)、負離子(B)模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion current diagram of methanol extract of B.chinense in positive(A)and negative(B)modes
表2 不同套種模式下北柴胡中化學成分Table 2 Chemical constituents of B.chinense under different interbreeding modes
續(xù)表
續(xù)表
進一步對不同套種模式下的北柴胡藥材進行多元統(tǒng)計分析。首先進行主成分分析,由第一主成分(PC1=0.534)和第二主成分(PC2=0.257)構(gòu)建的散點圖(圖3A)可見,不同套種模式下的北柴胡可明顯分離。為了進一步確定兩種套種模式下的北柴胡的差異化學成分,采用有監(jiān)督的模式識別OPLSDA模型對數(shù)據(jù)進一步分析(圖3B)。PLS-DA模型驗證排列實驗中,左端任何一次隨機排列產(chǎn)生的R2、Q2均低于右端,證明模型有效[12]。OPLS-DA模型CV-ANOVA驗證的P值(P=0.049 9)小于0.05,證明兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義。
兩組北柴胡的差異成分通過S-plot圖(圖3D)和VIP值(VIP>1)相結(jié)合分析確定13個差異成分,包括:異綠原酸A、6″-O-乙?;窈碥誂、綠原酸、Isorhamnetin、Linoelaidic acid、Oleic acid、(2Z,8Z,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-yl acetate、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、Ribitol、Rutin和Scoparon。
圖3 北柴胡樣本化學成分PCA散點圖(A),排列實驗?zāi)P万炞C(B),OPLS-DA散點圖(C),S-plot圖(D)Fig.3 PCA(A),Experimental model validation(B),OPLS-DA(C),S-plot(D)of the chemical composition of B.chinense samples
進一步對兩組間的13個差異成分進行t檢驗,如圖4所示,與谷子/柴胡套種的北柴胡藥材相比,玉米/柴胡套種模式下的柴胡樣本中,6″-O-乙?;窈碥誂、綠原酸、Linoelaidic acid、(2Z,8Z,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-yl ace?tate、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol和Scoparon含量較高,而異綠原酸A、Isorhamnetin、oleic acid、Ribitol和Rutin含量較低,其中11個成分的差異具有統(tǒng)計學差異。
圖4 柴胡差異代謝物在不同套種模式下的峰面積比較(n=3)Fig.4 Comparison of peak area of different metabolitesof B.chinense under different interplanting modes(n=3)
柴胡皂苷是柴胡的特征化學成分,采用兩組北柴胡樣本的UHPLC-Triple TOFMS負離子模式數(shù)據(jù)構(gòu)建皂苷類化合物GNPS分子網(wǎng)絡(luò)分子網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。該網(wǎng)絡(luò)圖共有91個節(jié)點,代表91個皂苷類化合物,其中有8個皂苷類成分只存在于谷子/柴胡套種的北柴胡樣本中,8個皂苷類成分只存在于“玉米/柴胡套種”的北柴胡中,其余成分在均存在于兩組北柴胡樣本中。
圖5 北柴胡樣本皂苷類化合物的分子網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Molecular network diagram of saponins in B.chinense samples
本研究采用柴胡皂苷含量測定,結(jié)合基于UH?PLC-Triple TOFMS的代謝組學技術(shù)、以及GNPS分子網(wǎng)絡(luò)比較分析了谷子/柴胡套種和玉米/柴胡套種兩種種植模式下北柴胡的化學差異。結(jié)果顯示,玉米/柴胡套種的北柴胡藥材中的柴胡皂苷A和柴胡
皂苷D的含量均高于谷子/柴胡套種。采用UH?PLC-Triple TOF MS共鑒定42種化學成分,其中谷子/柴胡套種的北柴胡藥材中共鑒定42個化合物,玉米/柴胡套種的北柴胡藥材中共鑒定41個化合物。通過代謝組學技術(shù)進一步篩選出13個差異化學成分,其中6″-O-乙?;窈碥誂、綠原酸、Linoelaidic acid、Scoparon,以及多炔(2Z,8Z,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-yl ace?tate、(2E,8E,10E)-Pentadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol、(2E,8E,10E)-Heptadeca-2,8,10-trien-4,6-diyn-1-ol在玉米/柴胡套種模式下的北柴胡藥材中含量較高,而異綠原酸A、Isorhamnetin、Oleic acid、Ribitol和Rutin在谷子/柴胡套種模式下北柴胡藥材中含量較高。GNPS分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示,兩種套種模式下皂苷類成分的種類接近,但仍有明顯差異。綜上,不同套種模式的北柴胡藥材雖然皂苷類指標成分均符合《中國藥典》的規(guī)定,但不同的農(nóng)作物套種模式會對北柴胡藥材的化學組成產(chǎn)生一定影響,這種差異產(chǎn)生的機制還需要進一步深入研究。