胡彥波，翟麗媛，劉 揚，趙偲如，趙 珺*

（長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022）

多糖是由10 個及以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚合物[1]，多存在于動植物和微生物體內(nèi)，整體分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[2]。隨著工業(yè)的飛速發(fā)展，多糖已應(yīng)用于食品[3]、醫(yī)藥[4]和材料[5]等領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有免疫調(diào)節(jié)[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8]和降低血糖活性[9]等多種功能。

薇菜學(xué)名紫萁（Osmunda japonicaThunb.），屬于紫萁科紫萁屬分株紫萁，是長白山地區(qū)常見的一種山野菜[10]。薇菜的主要營養(yǎng)成分包括多糖、黃酮、有機酸和蛋白質(zhì)等，具有抗病毒、抗菌、驅(qū)蟲、止血和抗炎鎮(zhèn)痛等作用[11-12]。薇菜作為大宗山野菜，因其獨特的生物活性被譽為“山菜之王”，遠銷日本和韓國等多個國家。薇菜多糖是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類物質(zhì)[13]，并且膳食纖維的含量在蕨菜、魚腥草和菊苣等9 種野菜中最高[14]。研究表明薇菜多糖除了對機體的生長發(fā)育和代謝有重要作用外，還具有抗氧化、抗菌和抗腫瘤等功能[15-16]。近年來對薇菜多糖的研究有了初步進展，柯瓊?cè)A等[17]利用水提醇沉法從薇菜干中提取薇菜多糖，經(jīng)測定得到其單糖組成為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖等，經(jīng)體外抗氧化反應(yīng)測定薇菜多糖對2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基具有良好的清除效果。Zhang Xueting等[18]利用薇菜多糖制備復(fù)合膜，有效提高了果蔬的保鮮效果，進一步證明薇菜多糖具有良好的抗氧化和抗菌活性。

目前對于薇菜多糖的系統(tǒng)分離純化及結(jié)構(gòu)分析研究較少，限制了薇菜多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。因此，本實驗對薇菜粗多糖進行分離純化，并對其純化后的組分進行成分分析和體外抗氧化活性的研究，以期為開發(fā)薇菜多糖功能性食品提供理論參考，同時，也為山野菜相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北薇菜購自吉林省長白山露水河鎮(zhèn)地區(qū)。

苯酚、硫酸、葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、VC、硫酸亞鐵（FeSO4） 北京化工廠有限責(zé)任公司；二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纖維素 上海源葉生物科技有限公司；氨基磺酸、半乳糖醛酸、間羥基聯(lián)苯 范德（北京）生物科技有限公司；三氯乙酸天津市光復(fù)精細化工研究所；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、氯化鈉（色譜純） 北京化工廠有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍 北京鼎國盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；溴化鉀（KBr）（光譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,1-二苯基-2-三硝基甲肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海麥克林生化科技有限公司；水楊酸天津市華東試劑廠；氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1901紫外-可見分光光度計 深圳億鑫儀器設(shè)備有限公司；Nicolet iS 5傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；3K15臺式高速離心機、BM312-B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LC-10AT高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 薇菜粗多糖的提取

采用水提醇沉法提取薇菜粗多糖。稱取新鮮薇菜4 kg，用蒸餾水在料液比1∶20、提取時間4 h的條件下提取薇菜多糖。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多糖液濃縮至原體積的1/3，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液過夜醇沉后，4 000 r/min離心20 min棄去上清液得到沉淀，在60 ℃水浴下不停地攪拌烘干，除去乙醇后，加蒸餾水（dH2O）溶解，冷凍干燥得到薇菜粗多糖（water soluble polysaccharide ofOsmunda japonica，WOJP），WOJP得率按公式（1）計算。

1.3.2 薇菜多糖的分離純化

采用DEAE-纖維素對WOJP進行分離純化。根據(jù)離子交換柱層析的原理，利用DEAE-纖維素經(jīng)dH2O和NaCl分別洗脫后，制備不帶電荷的中性糖和帶電荷的酸性糖。稱取WOJP粉末2 g，溶解于100 mL dH2O，離心后取上清液緩慢加到DEAE-纖維素層析柱中，待樣品完全進入纖維素柱后，用dH2O壓樣兩次，保證樣品完全進入纖維素柱，隨后用5 倍柱體積的dH2O洗脫中性糖，流速1.5 mL/min，收集洗脫液，即薇菜中性糖（neutral WOJP，WOJP-N）溶液。再用0～0.5 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，流速2 mL/min，用自動收集器收集洗脫液，6.25 min收集一管。利用苯酚-硫酸法[19]在490 nm波長處測定收集液的吸光度，繪制洗脫曲線圖，確定薇菜酸性糖（acidic WOJP，WOJP-A）梯度洗脫的鹽離子濃度，根據(jù)洗脫曲線圖可得到具有良好對稱性的峰圖，將該峰對應(yīng)的洗脫液收集，即WOJP-A溶液。將WOJP-N溶液和WOJP-A溶液進行旋蒸濃縮和透析，最后冷凍干燥，得到WOJP-N和WOJP-A。

1.3.3 薇菜多糖的化學(xué)成分測定

1.3.3.1 糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用苯酚-硫酸法[19]測定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液，在490 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣600 μL，加400 μL的dH2O，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.2 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用間羥基聯(lián)苯法[20]檢測WOJP和WOJP-A的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的半乳糖醛酸溶液，在525 nm波長處測定吸光度。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.3 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用考馬斯亮藍法[21]檢測WOJP、WOJP-N和WOJP-A的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品；配制不同質(zhì)量濃度的牛血清白蛋白溶液，在595 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的多糖溶液，取樣400 μL，其余步驟按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作步驟進行，做3 組平行實驗。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3.4 灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用馬弗爐灼燒法[22]測定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。灼燒坩堝8 h至其質(zhì)量恒定后，稱取待測多糖樣品50 mg，精準(zhǔn)至0.001 g，設(shè)置3 組平行實驗，輕輕搖動振蕩坩堝，使多糖樣品在坩堝中均勻分布。打開馬弗爐爐門，將坩堝置于爐膛內(nèi)，馬弗爐加熱的溫度設(shè)置為550 ℃，灼燒樣品8 h，坩堝冷卻至室溫后稱取質(zhì)量。多糖樣品灼燒至恒質(zhì)量后，稱量并計算多糖樣品中的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 薇菜多糖分子質(zhì)量的測定

采用高效液相凝膠滲透色譜法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）[23]分析多糖的均一性和分子質(zhì)量，高效液相色譜系統(tǒng)配備折射率檢測器（refractive index detector，RID）和超水凝膠線性凝膠過濾色譜柱。稱取1 mg多糖樣品置于1.5 mL微型離心EP管中，加入200 μL超純水（ddH2O），完全溶解多糖樣品。0.22 μm無機相濾膜過濾，然后進行HPGPC檢測。

HPGPC分析：采用Shimadzu HPLC系統(tǒng)（配有CTO-20A泵和RID-20折射率檢測器），TSK-gel G-3000 PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm），流動相為NaCl（0.15 mol/L）-ddH2O，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長245 nm。

1.3.5 薇菜多糖單糖組成測定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分析單糖組成[24]。稱取1 mg多糖樣品置于酸水解小瓶中，加入1 mL的2 mol/L鹽酸-甲醇溶液，充N2密封后，置于80 ℃金屬浴中水解10 h后用空氣泵吹干，再加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，于120 ℃金屬浴中水解1 h，用空氣泵吹干除去TFA溶液。分別吸取100 μL質(zhì)量濃度1 mg/mL的甘露糖（mannose，Man）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、鼠李糖（rhamnose monohydrate，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)品混合液，置于酸水解小瓶中備用。

向完全酸水解后得到的干燥樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，使樣品充分溶解，再加入500 μL的PMP-甲醇溶液，使其混合，取200 μL混合液于1.5 mL EP管中。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品在70 ℃條件下水浴反應(yīng)0.5 h，分別加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液，充分混勻后加入700 μL CH3Cl，充分振蕩后，棄去CH3Cl層，保留水層，重復(fù)操作萃取3 次。0.22 μm有機相濾膜過濾，然后進行HPLC檢測。

HPLC分析：采用HPLC系統(tǒng)（配有CTO-20A泵和SPD-20AVD紫外光檢測器），DIKMA Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×150 mm），流動相為磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 7.0）-乙腈（81∶19，V/V），流速1 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長245 nm。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將1 mg樣品粉末和180 mg KBr混合研磨，壓片機壓片。樣品測試前進行背景掃描去除干擾，在4 000～500 cm-1的條件下，測定多糖的有機官能團[25]。

1.3.7 薇菜多糖抗氧化活性的測定

考慮到結(jié)果的全面性，將樣品質(zhì)量濃度分別設(shè)定為0.5、1、2、5 mg/mL和10 mg/mL[26]，以期得到較完整的實驗結(jié)果，達到分析薇菜多糖體外抗氧化活性的目的。

1.3.7.1 還原力測定

還原力的測定根據(jù)文獻[27]稍作修改，配制5 個質(zhì)量濃度梯度的多糖樣品溶液，分別取1 mL樣品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS和2.5 mL 體積分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液混合，于50 ℃下恒溫水浴20 min，迅速冰浴冷卻，加入1 mL的體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液混合均勻后8 000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL dH2O、1.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%的FeCl3溶液混勻，靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照，每個樣品測定3 次取其平均值，通過比較樣品和VC的吸光度，判斷多糖的還原能力。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除率的測定根據(jù)文獻[28]稍作修改。分別取0.6 mL不同質(zhì)量濃度的多糖樣品溶液和2.4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合均勻，避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長處測定混合溶液的吸光度A1，同時測定用dH2O作空白對照的吸光度A0以及無水乙醇代替DPPH溶液作對照的吸光度A2，以VC為陽性對照，每個樣品測定3 次取其平均值，按公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為0.6 mL dH2O+2.4 mL DPPH的吸光度；A1為0.6 mL樣品溶液+2.4 mL DPPH的吸光度；A2為0.6 mL樣品溶液+2.4 mL無水乙醇的吸光度。

1.3.7.3 羥自由基清除能力測定

羥自由基清除率的測定根據(jù)文獻[29]稍作修改，分別取500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與1 mL FeSO4、1 mL水楊酸、1 mL過氧化氫（H2O2）混合，25 ℃室溫下靜置避光反應(yīng)30 min，測定其在510 nm波長處的吸光度A1，以dH2O代替H2O2測得吸光度A2，以dH2O代替樣品測得吸光度A0，以VC為陽性對照。每個樣品測定3 次取其平均值，按公式（3）計算羥自由基清除率。

式中：A0為500 μL dH2O+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光度；A1為500 μL樣品溶液+1 mL水楊酸+1 mL H2O2的吸光度；A2為500 μL樣品溶液+1 mL水楊酸+1 mL dH2O的吸光度。

1.3.7.4 超氧陰離子自由基清除能力測定

超氧陰離子自由基清除率的測定根據(jù)文獻[30]稍作修改，分別取50 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與50 μL 300 μmol/L NBT、50 μL 936 μmol/L NADH、50 μL 120 μmol/L PMS混合均勻后，避光反應(yīng)30 min，測定其在570 nm波長處的吸光度A1，以dH2O代替樣品測得吸光度A0，以dH2O代替PMS測得吸光度A2，以VC為陽性對照。每個樣品測定3 次取其平均值，超氧陰離子自由基清除率按公式（4）計算。

式中：A0為50 μL dH2O+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A1為50 μL樣品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A2為50 μL樣品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL dH2O的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 24.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用多重比較法進行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著），使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 薇菜多糖的分離純化

2.1.1 陰離子交換柱層析法分離純化薇菜多糖

通過水提醇沉法對薇菜粗多糖WOJP進行提取，測定WOJP的得率為9.3%。進一步利用陰離子交換柱層析法對WOJP進行分離純化，薇菜多糖的梯度洗脫結(jié)果如圖1所示。薇菜粗多糖經(jīng)過分離純化得到2 個多糖組分，分別為dH2O洗脫獲得的中性糖WOJP-N和0.2 mol/L NaCl洗脫獲得的酸性糖WOJP-A。收集樣品，濃縮、透析、凍干后分別得到棕色和白色粉末。進一步測定WOJP-N的得率為23.4%，WOJP-A的得率為26.3%。WOJP-N和WOJP-A的得率均在25%左右，作為WOJP的主要組成成分，兩者均具有一定的研究應(yīng)用價值，因此對兩者進行進一步的分析測定。

圖1 薇菜多糖的梯度洗脫圖Fig.1 Gradient elution curve of polysaccharides from Osmunda japonica

2.1.2 薇菜多糖的化學(xué)成分分析結(jié)果

對WOJP、WOJP-N和WOJP-A的化學(xué)成分進行分析，結(jié)果如表1所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為73.2%、38.5%和49.0%，WOJP-A的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于WOJP-N，說明在薇菜多糖組分中，酸性糖中的可溶性多糖含量高于中性糖。WOJP和WOJP-A的糖醛酸含量差異不明顯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在68%左右，說明薇菜多糖中的糖醛酸含量集中于酸性糖組分中，中性糖中含有微量或幾乎沒有游離糖醛酸成分。WOJP-N和WOJP-A的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于WOJP，鑒于接下來的抗氧化實驗主要研究薇菜多糖不同組分體外抗氧化活性之間的關(guān)系，蛋白質(zhì)的存在對實驗結(jié)果的影響不起決定性因素，因此，不進行進一步的脫蛋白處理。WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高，證明薇菜多糖中含有少量無機鹽等雜質(zhì)。

表1 薇菜多糖的化學(xué)成分分析Table 1 Chemical composition analysis of polysaccharides from Osmunda japonica

2.2 薇菜多糖的分子質(zhì)量分析結(jié)果

采用HPGPC測定WOJP-N和WOJP-A的分子質(zhì)量。由圖2可知，兩種多糖的色譜圖均主要存在一個明顯的特征峰，經(jīng)過計算可知，WOJP-N的主要分子質(zhì)量分布在31.8 kDa左右，WOJP-A則主要分布在15.7 kDa左右。但同時二者均存在若干響應(yīng)值較低的雜峰，說明WOJP-N和WOJP-A均不是均一多糖。

圖2 WOJP-N和WOJP-A的高效凝膠滲透色譜Fig.2 Determination of molecular mass of WOJP-N and WOJP-A by high performance gel permeation chromatography

2.3 薇菜多糖的單糖組成分析結(jié)果

進一步通過HPLC測定薇菜多糖的單糖組成，以9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照，結(jié)果表明，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的單糖組成存在明顯差異。經(jīng)過計算各單糖的物質(zhì)的量比，結(jié)果如表2所示，WOJP中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是GalA∶Glc∶Gal∶Ara＝41.0∶15.5∶23.7∶5.8；WOJP-N中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是Rha∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Ara＝9.1∶5.7∶13.3∶37.6∶5.6∶11.8；WOJP-A中的主要單糖組分及其物質(zhì)的量比是Rha∶GalA∶Gal∶Ara＝7.0∶56.4∶26.1∶5.2。分析各單糖組成的結(jié)果可知，WOJP主要由GalA、Glc和Gal組成；WOJP-N主要由Glc、Gal和Ara組成，推測其可能由阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）型果膠（主要含有β-Galp和α-Araf）和葡聚糖組成[31]；而WOJP-A的組成成分中則主要含有GalA和Gal，推測其可能由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）型果膠（主要含有α-1,4-GalpA）和半乳聚糖（主要含有β-Galp）組成[32]。

表2 薇菜多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from Osmunda japonica

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

利用傅里葉變換紅外光譜對薇菜多糖進行分析，如圖3所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A在3 400 cm-1附近的吸收峰為多糖O—H伸縮振動特征峰；在2 930 cm-1附近的吸收峰為多糖類物質(zhì)C—H伸縮振動所產(chǎn)生，這是糖類物質(zhì)的兩個特征吸收峰[33]；進一步分析發(fā)現(xiàn)，WOJP-A在1 740 cm-1處具有明顯的酯化糖醛酸特征吸收峰，且在1 410 cm-1附近處有COO—對稱伸縮振動吸收峰[34]，說明WOJP-A中含有較多的糖醛酸，且存在部分酯化修飾；此外，還可以觀察到WOJP和WOJP-A在1 100 cm-1和1 020 cm-1附近具有C—O—C和C—O—H中C—O的伸縮振動吸收峰，是吡喃環(huán)的特征吸收峰[35]，說明WOJP和WOJP-A均含有吡喃糖環(huán)，其中WOJP-A含量最多；在890 cm-1附近的吸收峰可以歸屬于β-糖苷鍵的振動[36]，表明WOJP-N中主要含有β-糖苷鍵。結(jié)合單糖組成分析結(jié)果可以推斷：WOJP-N主要由β-構(gòu)型的半乳糖組成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸組成，且存在部分酯化修飾。

圖3 薇菜多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5 薇菜多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 還原能力分析結(jié)果

薇菜多糖對Fe3+的還原能力實驗結(jié)果如圖4所示。隨著薇菜多糖質(zhì)量濃度增加，F(xiàn)e3+還原力均呈上升趨勢。在相同質(zhì)量濃度下，WOJP對Fe3+的還原力明顯高于WOJP-N和WOJP-A，其中WOJP-A對Fe3+的還原力最弱。研究表明，多糖的還原能力是其判斷抗氧化活性的一個重要指標(biāo)，其抗氧化活性與單糖組成密切相關(guān)[37-38]。與WOJP-A相比，WOJP和WOJP-N單糖組成中Glc的含量相近，且高于WOJP-A中Glc的含量；同時，WOJP-A中GalA的含量明顯高于WOJP-N，略高于WOJP。這幾種糖組成的差異可能是導(dǎo)致WOJP和WOJP-N還原Fe3+能力相當(dāng)，且高于WOJP-A的主要原因。此外，當(dāng)質(zhì)量濃度達到10 mg/mL時，WOJP-N對Fe3+還原力與VC相當(dāng)，而WOJP在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時對Fe3+的還原力已經(jīng)與VC相當(dāng)。因此，在進行WOJP的還原能力分析時可將樣品質(zhì)量濃度控制在5 mg/mL，以達到節(jié)省樣品的目的。結(jié)果表明WOJP對Fe3+的還原能力的主要活性多糖組分為WOJP-N。

圖4 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的Fe3＋還原能力Fig.4 Fe3+-reducing power of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.2 DPPH自由基清除能力分析結(jié)果

薇菜多糖對DPPH自由基的清除能力實驗結(jié)果如圖5所示。薇菜多糖是多羥基化合物，具有很強的還原性，極易與DPPH發(fā)生氧化反應(yīng)生成醌類物質(zhì)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度從0.5 mg/mL增加到10 mg/mL時，WOJP的DPPH自由基清除能力逐漸增強。在10 mg/mL下，WOJP對DPPH自由基的清除能力達到100%，與VC的清除能力相當(dāng)。WOJP-A隨著質(zhì)量濃度的提高，其DPPH自由基清除能力增強。在10 mg/mL下，WOJP-A的DPPH自由基清除率為72.46%。WOJP-N的DPPH自由基清除能力從2 mg/mL提高到10 mg/mL，清除能力增長較為緩慢。而在10 mg/mL濃度下，WOJP-N的DPPH清除率為86.39%，其清除率接近WOJP。由此可以推斷，對于薇菜多糖的DPPH自由基清除能力，WOJP-N為主要活性多糖組分。與冬棗多糖[38]、茶粕多糖[39]和刺五加果多糖[40]等多數(shù)植物多糖相比，薇菜多糖具有較強的清除DPPH自由基能力，可作為新型的天然抗氧化劑。

圖5 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.3 羥自由基清除能力分析結(jié)果

通過測定薇菜多糖對羥自由基的清除能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖6所示。薇菜多糖對羥自由基具有一定的清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加，薇菜多糖清除羥自由基的能力也逐漸增強。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，WOJP的羥自由基清除能力為75.50%，WOJP-A的羥自由基清除能力為73.60%，而WOJP-N的羥自由基清除能力為49.17%，說明WOJP和WOJP-A的羥自由基清除能力相當(dāng)且強于WOJP-N。研究表明多糖清除羥自由基的機制可能是通過糖醛酸與亞鐵離子耦合，從而抑制羥自由基的產(chǎn)生[41-42]。由于WOJP-A和WOJP中半乳糖醛酸含量較高，即含有的糖醛酸較高，而WOJP-N中含有的糖醛酸極低，因此，WOJP中清除羥自由基的主要活性多糖組分為WOJP-A。

圖6 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的羥自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda sinensis

2.5.4 超氧陰離子自由基清除能力分析結(jié)果

通過測定薇菜多糖清除超氧陰離子自由基的能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，結(jié)果如圖7所示。隨著質(zhì)量濃度的增加，WOJP和WOJP-N清除超氧陰離子自由基的能力增強顯著（P＜0.05），呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴性，而WOJP-A對質(zhì)量濃度的依賴性較低。此外，隨著質(zhì)量濃度的升高，WOJP和WOJP-N的清除超氧陰離子自由基的能力相當(dāng)，且均高于WOJP-A，當(dāng)質(zhì)量濃度達到10 mg/mL時，WOJP的超氧陰離子自由基清除率為91.09%，WOJP-N的超氧陰離子自由基清除率為93.59%，而WOJP-A的超氧陰離子清除率為61.05%。由此可以推斷，WOJP清除超氧陰離子自由基的主要活性多糖組分為WOJP-N。研究表明，不同分子質(zhì)量、糖苷鍵類型以及單糖組成的多糖清除超氧陰離子自由基能力不同，其中含有β-糖苷鍵的多糖清除自由基能力較強[43-44]。比較WOJP-N和WOJP-A中糖苷鍵的構(gòu)型可知，WOJP-N中含有較多的β-糖苷鍵，這可能是導(dǎo)致WOJP-N具有較高清除超氧陰離子自由基能力的主要原因。

圖7 不同質(zhì)量濃度薇菜多糖的超氧陰離子自由基清除能力Fig.7 Superoxide anion radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

綜上所述，根據(jù)薇菜多糖的4 種體外抗氧化實驗結(jié)果可知：WOJP-N和WOJP-A在清除自由基以及還原Fe3+能力方面表現(xiàn)出不同活性。其中WOJP-N清除DPPH自由基和超氧陰離子自由基的能力以及還原Fe3+的能力與WOJP基本相當(dāng)，而WOJP-A相對較弱；WOJP-A清除羥自由基的能力與WOJP基本相當(dāng)，而WOJP-N相對較弱。在4 種體外抗氧化活性中，WOJP均表現(xiàn)出較好的活性，其主要原因是兩者在WOJP的體外抗氧化活性中起協(xié)同作用，從而使WOJP發(fā)揮抗氧化作用。因此，WOJP-N和WOJP-A均是WOJP抗氧化能力的主要活性組分。

3 結(jié) 論

本實驗通過水提醇沉技術(shù)對薇菜多糖進行提取，利用DEAE-纖維素離子交換柱層析對其進行分離純化，獲得2 種多糖組分WOJP-N和WOJP-A，并對其組成成分和體外抗氧化活性進行了分析。結(jié)果表明，WOJP-N和WOJP-A的分子質(zhì)量分別為31.8 kDa和15.7 kDa，化學(xué)成分分析表明2 種多糖存在一定差異，傅里葉變換紅外光譜測定發(fā)現(xiàn)WOJP-N主要由β-構(gòu)型的半乳糖組成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸組成，且存在部分酯化修飾。4 種體外抗氧化實驗結(jié)果表明，WOJP具有很好的抗氧化活性，其抗氧化活性與VC相當(dāng)。進一步明確了在WOJP發(fā)揮抗氧化活性時，WOJP-N和WOJP-A具有協(xié)同作用。上述研究結(jié)果可為薇菜多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)，對薇菜綜合開發(fā)利用具有一定意義。