胡志和，程凱麗，魯丁強(qiáng)，薛 璐，賈凌云，趙旭飛

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

牛奶是非常優(yōu)質(zhì)的食品資源，但由于部分人群受到乳糖不耐受問(wèn)題的困擾，嚴(yán)重影響了這一優(yōu)質(zhì)食品資源的利用[1]。特別是在我國(guó)，乳糖酶缺乏現(xiàn)象尤為嚴(yán)重[2-3]，不僅影響了我國(guó)居民對(duì)牛奶的消費(fèi)量，還會(huì)導(dǎo)致老年人和嬰幼兒因缺乏攝入牛奶而引發(fā)的健康問(wèn)題[4]。因此，開發(fā)低乳糖或無(wú)乳糖乳制品對(duì)于滿足居民的消費(fèi)需求尤為重要。

目前，制備低乳糖或無(wú)乳糖乳制品的方法包括膜分離法[5-6]、酶法[7-10]、微生物發(fā)酵法[11]和基因工程法[12]等，其中，乳糖酶水解法是主要的制備方法。在利用乳糖酶水解乳糖制備低乳糖牛奶的過(guò)程中，為了防止牛奶品質(zhì)發(fā)生變化，一般采用低溫長(zhǎng)時(shí)間的水解方式。該方法存在生產(chǎn)效率低和生產(chǎn)設(shè)備占用時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，進(jìn)而造成生產(chǎn)成本偏高。為解決該問(wèn)題，本課題組采用高壓下乳糖酶水解乳糖生產(chǎn)低乳糖牛奶。該方法的優(yōu)點(diǎn)是利用高壓抑制牛奶中微生物生長(zhǎng)，提高乳糖酶活性，可在較高溫度下水解乳糖，提高乳糖水解效率，同時(shí)能夠保證牛奶的品質(zhì)。

乳糖酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，但商品化的乳糖酶多是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)[13-14]。源于微生物的乳糖酶，研究較多的是米曲霉和克魯維酵母源乳糖酶[15-16]。目前針對(duì)乳糖酶的研究更多的是關(guān)注其酶學(xué)特性和穩(wěn)定性[17-20]，而對(duì)其結(jié)構(gòu)變化與活性的關(guān)系研究較少，特別是在超高壓處理過(guò)程中，乳糖酶活力是如何變化的，其變化與乳糖酶分子結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系如何，目前還鮮有研究。

乳糖酶中芳香族氨基酸殘基（如色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）等）處于不對(duì)稱微環(huán)境時(shí)，在紫外光譜區(qū)可產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)。通過(guò)熒光強(qiáng)度分析能夠反映Trp、Tyr和Phe等所處微環(huán)境的變化，從而研究蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的精細(xì)變化，了解蛋白質(zhì)的化學(xué)組成、蛋白質(zhì)分子構(gòu)象及其與小分子的相互作用等信息[21-22]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究高壓處理引發(fā)乳糖酶活力和熒光強(qiáng)度變化，進(jìn)而推斷乳糖酶活力與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，為高壓處理乳糖酶水解乳糖制備低乳糖牛奶提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中性乳糖酶（酶活力5 998.87 U/g） 天津海河乳業(yè)有限公司提供；鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG）、二水乙二胺四乙酸鈉 北京Biotopped科學(xué)技術(shù)有限公司；鄰硝基苯酚 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；氫氧化鈉（NaOH） 天津市華東試劑廠；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸鈉 天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；三水磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O） 天津市化學(xué)試劑六廠；七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）北京五七六零一化工廠；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L2-800/2.5超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽 寧波新芝生物科技股份有限公司；U-5100紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4600熒光光度計(jì)日本日立高新技術(shù)公司；VELP漩渦振蕩器 北京德祥科技有限公司；DK-420型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20型pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超高壓處理乳糖酶

采用外接DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽的HPP.L2-800/2.5超高壓設(shè)備處理樣品。取5 g乳糖酶液裝入聚乙烯密封袋中真空密封，將壓力300 MPa、溫度30 ℃、保壓時(shí)間10 min作為相對(duì)固定的條件，研究不同壓力（0.1、100、200、300、400、500、600 MPa）和溫度（室溫（18 ℃）、20、25、30、35、40、45 ℃）下處理不同時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)乳糖酶活力的影響，各條件（壓力、溫度、時(shí)間）的對(duì)照組分別為0.1 MPa、室溫（18 ℃）、0 min。

1.3.2 乳糖酶活力檢測(cè)

參照趙華梅等[23]的實(shí)驗(yàn)，采用ONPG法測(cè)定乳糖酶活力。

1.3.3 乳糖酶的內(nèi)源性熒光光譜掃描

將不同超高壓條件下處理的乳糖酶溶液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至0.1 mg/mL。取3 mL樣品，用F-4600熒光光度計(jì)進(jìn)行內(nèi)源性熒光測(cè)定。以激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm的光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.3.4 乳糖酶的外源性熒光光譜掃描

將不同超高壓條件下處理的乳糖酶溶液用pH 7.0的PBS稀釋至0.1 mg/mL。分別取4 mL，加入20 μL的ANS熒光探針溶液（5.0 mmol/L）?；旌暇鶆蚴覝叵卤芄夥磻?yīng)1 h后，采用F-4600熒光光度計(jì)進(jìn)行熒光光譜掃描。選擇激發(fā)波長(zhǎng)284 nm，掃描發(fā)射波長(zhǎng)290～420 nm的光譜，狹縫寬度為2 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 95C軟件作圖，采用SPSS 16軟件通過(guò)皮爾遜雙尾分析法對(duì)處理后樣品的酶活力與熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓處理對(duì)乳糖酶活性的影響

2.1.1 不同壓力對(duì)乳糖酶活性的影響

真空密封后的乳糖酶溶液，在30 ℃和不同壓力（0.1～600 MPa）下處理10 min后，乳糖酶活力變化如圖1所示。在0.1～400 MPa壓力范圍內(nèi)，酶活力呈上升趨勢(shì)，并且在400 MPa時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為6 783.20 U/g，相比于對(duì)照組（0.1 MPa組，酶活力5 986.87 U/g）酶活力提高了13.30%。壓力在400～600 MPa范圍內(nèi)，酶活力隨壓力的提高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；500 MPa和600 MPa時(shí)，酶活力分別為4 299.03 U/g和3 498.88 U/g，比對(duì)照組分別降低28.19%和41.56%。因此，溫度30 ℃、保壓時(shí)間10 min條件下，在實(shí)驗(yàn)壓力范圍內(nèi)，乳糖酶較適宜的處理壓力條件為400 MPa。

圖1 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min對(duì)乳糖酶活力的影響Fig.1 Effect of ultrahigh pressure treatment at different pressures and 30 ℃ for 10 min on lactase activity

酶是蛋白質(zhì)，通常具有多級(jí)結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)的變化與活性的關(guān)系密切相關(guān)。超高壓處理是一種高強(qiáng)度動(dòng)力作用，會(huì)改變酶分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)并影響其活性[24-26]。高壓處理對(duì)蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵產(chǎn)生作用。在壓力的影響下，酶分子的空間結(jié)構(gòu)以及酶活性部位的構(gòu)象也發(fā)生改變，進(jìn)而影響酶活力[27-28]。

2.1.2 不同處理時(shí)間對(duì)乳糖酶活性的影響

真空密封后的乳糖酶溶液，在溫度30 ℃和壓力300 MPa下分別處理10、20、30、40、50、60 min后乳糖酶活力變化如圖2所示。在20 min內(nèi)乳糖酶活力呈上升趨勢(shì)，并且在20 min時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為6 888.32 U/g，相比于對(duì)照組（0 min處理組，酶活力5 998.87 U/g）提高了14.83%。處理時(shí)間在20～60 min，酶活力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)；但在30 min時(shí)，酶活力依然高于對(duì)照組；當(dāng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，在40 min以后，酶活力低于對(duì)照組；40 min和50 min時(shí)，酶活力相差不大，分別為5 912.69 U/g和5 885.94 U/g，比對(duì)照組分別降低1.44%和1.83%。而處理時(shí)間延長(zhǎng)至60 min時(shí)，酶活力急劇下降，為5 213.18 U/g，比對(duì)照組降低13.10%。該變化可能是由于高壓造成乳糖酶分子結(jié)構(gòu)變化而引發(fā)[25]。

圖2 300 MPa 30℃超高壓處理不同時(shí)間對(duì)乳糖酶活力的影響Fig.2 Effect of ultrahigh pressure treatment time at 300 MPa and 30 ℃ on lactase activity

2.1.3 不同溫度對(duì)乳糖酶活性的影響

真空密封后的乳糖酶溶液在壓力300 MPa、不同溫度（18、20、25、30、35、40、45 ℃）下處理時(shí)間10 min乳糖酶活力變化如圖3所示。在18～30 ℃范圍內(nèi)，乳糖酶活力呈上升趨勢(shì)，并且在30 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，為6 540.6 U/g，與對(duì)照組（室溫組，酶活力6 086.56 U/g）相比提高了7.46%。30～35 ℃的溫度范圍內(nèi)酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照組。當(dāng)溫度提高至40～45 ℃時(shí)，酶活力繼續(xù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且酶活力低于對(duì)照組。因此，300 MPa處理10 min條件下，乳糖酶適宜的處理溫度條件為30 ℃。綜上，在一定壓力下，溫度變化可能引發(fā)酶結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而引發(fā)酶活力的變化[29]。

圖3 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min對(duì)乳糖酶活力的影響Fig.3 Effect of ultrahigh pressure treatment at 300 MPa and different temperatures for 10 min on lactase activity

根據(jù)上述研究可知，在超高壓處理過(guò)程中，壓力、處理時(shí)間和處理溫度均會(huì)引發(fā)乳糖酶活性的變化。在相關(guān)研究中，Masson等[30]通過(guò)研究指出，酶的活性可通過(guò)壓力調(diào)節(jié)。Rivalain等[31]研究發(fā)現(xiàn)某些酶隨著壓力的增加會(huì)喪失活性。Trovaslet等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在壓力為100～400 MPa之間，馬肝醇脫氫酶的催化活性急劇降低，該現(xiàn)象與其熒光特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。Aertsen等[29]的研究結(jié)果顯示，α-糜蛋白酶在470 MPa下的酶活力是常壓下的6 倍；在360 MPa、50 ℃下處理30 min，α-糜蛋白酶活力顯著增加。

2.2 超高壓處理對(duì)乳糖酶內(nèi)源性熒光光譜的影響

在蛋白質(zhì)分子中能發(fā)射熒光的氨基酸有色氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸，通常在發(fā)射波長(zhǎng)為280 nm和295 nm處能檢測(cè)到熒光光譜[33]。295 nm激發(fā)波長(zhǎng)處僅有疏水性色氨酸殘基被激發(fā)。280 nm激發(fā)波長(zhǎng)處內(nèi)源熒光主要來(lái)自疏水性色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等殘基[34]。有時(shí)蛋白質(zhì)分子中從酪氨酸殘基到色氨酸殘基之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，也會(huì)導(dǎo)致酪氨酸殘基的熒光猝滅和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度增加[35-36]。為了分析內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與乳糖酶活力變化的關(guān)系，選擇280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，觀察不同高壓條件處理后乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化。同時(shí)，將內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化與酶活力的變化趨勢(shì)進(jìn)行擬合分析。

2.2.1 處理壓力對(duì)乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的影響

在30 ℃、不同壓力（0.1～600 MPa）下處理10 min，檢測(cè)不同壓力條件下乳糖酶內(nèi)源性熒光光譜。由圖4可知，在0.1～400 MPa范圍內(nèi)乳糖酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度隨壓力的升高而增加，400 MPa時(shí)最大發(fā)射波長(zhǎng)為338 nm，熒光強(qiáng)度為4 223.33，比對(duì)照組（0.1 MPa）增加了7.45%；當(dāng)壓力大于400 MPa，隨著壓力繼續(xù)增大，乳糖酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐步減小。另外，在0.1～200 MPa范圍內(nèi)，最大發(fā)射波長(zhǎng)從335 nm藍(lán)移至333 nm；300～600 MPa，最大發(fā)射波長(zhǎng)從336 nm紅移至338 nm。綜上，在30 ℃不同壓力下處理10 min，乳糖酶的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度隨處理壓力的不同而發(fā)生變化，且最大發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，但紅移或藍(lán)移幅度較小。根據(jù)Burstein等[37]提出的色氨酸殘基微環(huán)境基本特點(diǎn)可以推測(cè)，在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)生紅移或藍(lán)移，主要是埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)的色氨酸等疏水性氨基酸暴露的結(jié)果。

圖4 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min乳糖酶在280 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的內(nèi)源性熒光光譜Fig.4 Intrinsic fluorescence spectra of lactase treated by different pressures at 30 ℃ for 10 min at excitement wavelength of 280 nm

如圖5所示，將該條件下處理乳糖酶的熒光強(qiáng)度與酶活力變化進(jìn)行趨勢(shì)擬合，二者的變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明在該條件下處理的乳糖酶活力變化可能與其酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的暴露程度有關(guān)。

圖5 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min乳糖酶的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.5 Relationship between intrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 30 ℃ and different pressures for 10 min

2.2.2 處理時(shí)間對(duì)乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的影響

真空密封后的乳糖酶溶液在30 ℃、300 MPa條件下分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，測(cè)其熒光強(qiáng)度。由圖6可知，在0～20 min內(nèi)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐漸提高；在處理20 min時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，為4 338。20 min后隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐漸降低。在處理30～50 min范圍內(nèi)，乳糖酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度與未處理組（0 min處理組）的無(wú)明顯差異。另外，不同時(shí)間下，最大發(fā)射波長(zhǎng)（335 nm）基本不變。

圖6 30 ℃、300 MPa下超高壓處理不同時(shí)間的乳糖酶在280 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的內(nèi)源性熒光光譜Fig.6 Extrinsic fluorescence spectra of lactase treated at 30 ℃ and 300 MPa for different durations at excitement wavelength of 280 nm

在該條件下處理的乳糖酶，熒光強(qiáng)度變化和酶活力變化趨勢(shì)并非完全一致（圖7），特別是在40～60 min的時(shí)間范圍內(nèi)。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因，可能是在一定壓力下處理不同時(shí)間，引發(fā)乳糖酶分子結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致乳糖酶分子中酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸不同程度的暴露。

圖7 30 ℃、300 MPa下超高壓處理不同時(shí)間的乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.7 Relationship between intrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 30 ℃ and 300 MPa for different durations

2.2.3 處理溫度對(duì)乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的影響

將真空密封后的乳糖酶溶液在300 MPa和不同溫度（18（室溫）、20、25、30、35、40 ℃）下處理10 min，檢測(cè)其內(nèi)源性熒光強(qiáng)度的變化。由圖8可知，當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，隨溫度升高，最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐漸增大，30 ℃時(shí)達(dá)到最大，為4 158，且最大發(fā)射波長(zhǎng)為335 nm；在此溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，最大發(fā)射波長(zhǎng)從334 nm紅移至336 nm。30～45 ℃范圍內(nèi)，隨溫度升高，最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度逐漸下降，且最大發(fā)射波長(zhǎng)在334～335 nm范圍內(nèi)。另外，25 ℃和35 ℃條件下處理乳糖酶的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異。綜上，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)，隨溫度變化，內(nèi)源性熒光強(qiáng)度發(fā)生改變；根據(jù)發(fā)射波長(zhǎng)移動(dòng)變化分析，可能是非極性區(qū)域的色氨酸暴露所致[37-38]。由圖9可知，最大發(fā)射波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度與乳糖酶活力之間變化趨勢(shì)較為一致。

圖8 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min的乳糖酶在280 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的內(nèi)源性熒光光譜Fig.8 Intrinsic fluorescence spectra of lactase treated at different temperatures and 300 MPa for 10 min at excitement wavelength of 280 nm

圖9 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min乳糖酶內(nèi)源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.9 Relationship between intrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 300 MPa and different temperatures for 10 min

2.3 超高壓處理對(duì)乳糖酶的外源性熒光光譜影響

蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的特征是疏水性與親水性之間的平衡，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在很大程度上依賴于分子內(nèi)的疏水作用。疏水基團(tuán)的相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力之一，疏水性熒光探針ANS與蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)結(jié)合產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度與蛋白表面暴露的疏水性氨基酸的數(shù)量相關(guān)[27]。因此，能夠通過(guò)疏水性熒光探針ANS測(cè)定不同高壓條件處理乳糖酶的疏水性，表征處理后乳糖酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)，與相同處理?xiàng)l件下乳糖酶活力變化進(jìn)行比較，揭示二者的關(guān)系。

2.3.1 處理壓力對(duì)乳糖酶熒光強(qiáng)度的影響

在30 ℃不同壓力（0.1～600 MPa）下處理10 min，檢測(cè)乳糖酶分子表面疏水性氨基酸的熒光強(qiáng)度變化。由圖10可知，與對(duì)照組（0.1 MPa處理組）相比，在100～400 MPa范圍內(nèi)，隨壓力升高，其最大波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，400 MPa達(dá)到最高，與對(duì)照組相比差異明顯，但與100、200 MPa和300 MPa下處理乳糖酶的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異。在400～600 MPa范圍內(nèi)，乳糖酶分子的熒光強(qiáng)度隨壓力升高而下降，且500 MPa和600 MPa時(shí)與0.1 MPa相比具有明顯差異。上述結(jié)果可能是高壓處理的過(guò)程中疏水氨基酸發(fā)生部分暴露和掩埋所致[32,36]。綜上，高壓處理對(duì)乳糖酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)有影響，且隨著壓力的變化而變化。由圖11可知，在實(shí)驗(yàn)條件下處理后乳糖酶分子的熒光強(qiáng)度與酶活力的變化趨勢(shì)具有很好的一致性。

圖10 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min的乳糖酶在284 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的外源性熒光光譜Fig.10 Extrinsic fluorescence spectra of lactase treated at 30 ℃ and different pressures for 10 min at excitement wavelength of 284 nm

圖11 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min乳糖酶外源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.11 Relationship between extrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 30 ℃ and different pressures for 10 min

2.3.2 處理時(shí)間對(duì)乳糖酶熒光強(qiáng)度的影響

將真空密封的乳糖酶溶液，在30 ℃、300 MPa條件下分別處理0、10、20、30、40、50、60 min，檢測(cè)乳糖酶分子外源性熒光強(qiáng)度的變化。由圖12可知，處理0～20 min，隨時(shí)間延長(zhǎng)，最大波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度呈增加趨勢(shì)，在20 min時(shí)最高，為2 856，且發(fā)射波長(zhǎng)從336 nm藍(lán)移至334 nm。當(dāng)處理時(shí)間在20～60 min范圍時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，最大波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度開始下降；當(dāng)處理時(shí)間長(zhǎng)于30 min時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度小于對(duì)照組（0 min處理組），但最大發(fā)射波長(zhǎng)基本不變（333 nm）。綜上可知，在一定壓力和溫度下，處理不同時(shí)間對(duì)乳糖酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生影響。由圖13可見，乳糖酶分子的熒光強(qiáng)度與其活力之間的變化趨勢(shì)較為一致。

圖12 300 MPa、30 ℃下處理不同時(shí)間的乳糖酶在284 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的外源性熒光光譜Fig.12 Extrinsic fluorescence spectra of lactase treated at 300 MPa and 30 ℃ for different durations at excitement wavelength of 284 nm

圖13 300 MPa、30 ℃下超高壓處理不同時(shí)間乳糖酶外源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.13 Relationship between extrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 300 MPa and 30 ℃ for different durations

2.3.3 處理溫度對(duì)乳糖酶熒光強(qiáng)度的影響

將真空密封的乳糖酶溶液，在300 MPa和不同溫度（18（室溫）、20、25、30、35、40、45 ℃）條件下處理10 min，檢測(cè)乳糖酶分子外源性熒光強(qiáng)度的變化。由圖14可知，在18～30 ℃范圍內(nèi)，最大波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度隨著溫度提高而增強(qiáng)，30 ℃達(dá)到最大。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)最大波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)。此外，在300 MPa下處理10 min，室溫、20 ℃和40 ℃處理乳糖酶的外源性熒光強(qiáng)度差異較小，其原因還需要進(jìn)一步研究。但總體來(lái)看，處理溫度對(duì)乳糖酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)有影響。由圖15可知，實(shí)驗(yàn)條件下處理的乳糖酶活力與其外源性熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)較為一致。

圖14 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min的乳糖酶在284 nm波長(zhǎng)處激發(fā)的外源性熒光光譜Fig.14 Fluorescence spectra of lactase treated at 300 MPa and different temperatures at excitement wavelength of 284 nm

圖15 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min乳糖酶的外源性熒光強(qiáng)度與酶活力的關(guān)系Fig.15 Relationship between extrinsic fluorescence intensity and activity of lactase treated at 300 MPa and different temperatures for 10 min

2.4 超高壓處理引發(fā)乳糖酶活力變化與熒光強(qiáng)度之間相關(guān)性分析結(jié)果

由表1可知，在30 ℃不同壓力下處理10 min引發(fā)的乳糖酶活力變化與乳糖酶分子內(nèi)源性熒光強(qiáng)度和外源性熒光強(qiáng)度之間存在極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。在300 MPa、30 ℃下處理不同時(shí)間引發(fā)的乳糖酶活力變化與其內(nèi)源性和外源性熒光強(qiáng)度之間存在極顯著相關(guān)性（P＜0.01）（表2）。在300 MPa不同溫度下處理10 min引發(fā)的乳糖酶活力變化與乳糖酶分子內(nèi)源性和外源性熒光強(qiáng)度之間存在極顯著相關(guān)性（P＜0.01）（表3）。此外，不同壓力條件下引發(fā)的內(nèi)源性和外源性熒光強(qiáng)度之間存在顯著或極顯著相關(guān)性（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 30 ℃不同壓力下超高壓處理10 min引發(fā)酶活力變化與內(nèi)源性熒光和外源性熒光強(qiáng)度的相關(guān)性Table 1 Correlation between changes in intrinsic and extrinsic fluorescence intensity and lactase activity induced by treatment at 30 ℃for 10 min under different pressures

表2 300 MPa、30 ℃下超高壓處理不同時(shí)間引發(fā)酶活力變化與內(nèi)源性熒光和外源性熒光強(qiáng)度的相關(guān)性Table 2 Correlation between changes in lactase activity and intrinsic and extrinsic fluorescence intensity induced by treatment at 300 MPa and 30 ℃ for different durations

表3 300 MPa不同溫度下超高壓處理10 min引發(fā)乳糖酶活力變化與內(nèi)源性熒光和外源性熒光強(qiáng)度的相關(guān)性Table 3 Correlation between changes in lactase activity and intrinsic and extrinsic fluorescence intensity induced by 10 min treatment at 300 MPa and different temperatures

綜上，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的條件下，不同壓力、不同處理時(shí)間和處理溫度均會(huì)引發(fā)乳糖酶活力的變化，該變化與乳糖酶分子的內(nèi)源性和外源性熒光強(qiáng)度有極顯著相關(guān)性（P＜0.01），由此推斷超高壓處理乳糖酶引發(fā)酶活力變化與乳糖酶分子三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。類似研究發(fā)現(xiàn)，高壓處理能夠引發(fā)胰蛋白酶[34,39]、馬肝醇脫氫酶[32]、α-糜蛋白酶[35]等多種蛋白酶的活力變化，均與其二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化有相關(guān)性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同超高壓條件（壓力、溫度、時(shí)間）處理乳糖酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同處理?xiàng)l件能夠引發(fā)其三級(jí)結(jié)構(gòu)（氨基酸微環(huán)境）及乳糖酶活力的變化；疏水性氨基酸暴露程度與乳糖酶活力大小有關(guān)，其暴露程度越大，酶活力越大。通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)乳糖酶活力的變化與乳糖酶分子的內(nèi)源性和外源性熒光強(qiáng)度均有極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。綜上，乳糖酶活力變化與乳糖酶分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。