王洪秀，孫 鵬，安 穎，胡 佳，陳緒濤，李 菁，魏云輝

（1江西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)應用微生物研究所，南昌 330200；2浙江大學生命科學學院生物物理研究所/教育部生物系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)與保護重點實驗室，杭州 310058）

0 引言

茶樹菇(Agrocybe aegerita)屬于球蓋菇科(Strophariaceae)田頭菇屬(Agrocybe)，分布于中國的江西、福建、云南、浙江及四川等地。因其生長宿主的多樣性及形態(tài)上的細微差別，又被命名為楊樹菇、柳松茸（日本與中國臺灣省）、柳環(huán)菌（貴州、云南）、柱狀田頭菇、茶薪菇、油菜菇等[1]，是集高蛋白、低脂肪、低糖分的可營養(yǎng)、保健和食療的珍稀食用菌。江西省茶樹菇產(chǎn)量為全國第一[2]，種植規(guī)模越來越大。食用菌種質資源是選育優(yōu)良品種的基礎，對茶樹菇種質資源親緣關系進行準確分析和評價，可為種植品種選擇和育種親本選配提供科學依據(jù)。

DNA分子標記是對DNA水平遺傳變異的直接反映，不受環(huán)境、組織特異性和發(fā)育階段等因素的影響，具有數(shù)量大、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢[3-9]。簡單序列重復區(qū)間 (inter-simple sequence repeat，ISSR)是在微衛(wèi)星(simple sequence repeats，SSR)基礎上發(fā)展起來的分子標記技術[10]。采用分子標記對茶樹菇種質資源進行分類、評價，分析親緣關系和多態(tài)性的研究已經(jīng)有一些報道[11-16]。由于每種方法的原理不同，聚類分析結果通常會存在較大差異。因此，本研究綜合采用ISSR分子標記、拮抗試驗和同工酶技術相結合的方法，對18株不同來源茶樹菇親緣關系進行分析，評價其農(nóng)藝性狀，以期為茶樹菇分類鑒定、遺傳育種和商業(yè)化栽培菌株篩選提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

參與研究的18株茶樹菇均保存于江西省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)應用微生物研究所食用菌育種室，菌株信息見表1。其中4株是野生菌株（編號Aa1～4）、7株是栽培菌株（編號Aa5～11）、5株是經(jīng)鈷60（劑量為600、700、800 Gy）輻照誘變菌株（編號Aa12～16）、2株為搭載神十的航天誘變菌株（編號Aa17～18）。

表1 茶樹菇的18個供試菌株

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 馬鈴薯綜合培養(yǎng)基 200 g馬鈴薯，1.5 g硫酸鎂，20 g瓊脂，1.0 g磷酸二氫鉀，20 g葡萄糖，水1000 mL[17]。

1.2.2 栽培袋培養(yǎng)基 45%棉籽殼，30%玉米芯，18%麩皮，5%玉米粉，1%石灰，1%石膏，含水量60%左右。

1.3 試劑與儀器

DP305植物基因組DNA提取試劑盒購于TIANGEN生化科技（北京）有限公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖、Marker DL2000和 6× Loading Buffer購于寶生物工程（大連）有限公司，PCR引物購于上海立菲生物技術有限公司，核酸染料、溴酚藍指示劑和RNaseA購于北京索萊寶科技有限公司。

S1000TMThermal Cycler型PCR儀和PowerPacTMBasic型電泳槽購于Bio-Rad公司，G:Box F3型高級凝膠成像系統(tǒng)購于Syngene公司。

1.4 拮抗試驗

參照國家行業(yè)標準《食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應》(NY/T 1845—2010)[18]操作。18株供試菌接種到馬鈴薯綜合培養(yǎng)基中活化，然后用打孔器取直徑0.5 cm的10天菌齡的菌塊，按“品”字形接種于同一固體平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)15天，每個處理3次重復，觀察菌株間菌落交界處菌絲的拮抗現(xiàn)象[19]。

1.5 酯酶同工酶電泳試驗

參照國家行業(yè)標準《食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》(NY/T 1097—2006)[20]操作。將保存的試管種接種到150 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中180 r/min、25℃避光培養(yǎng)20天。采用3層紗布過濾菌絲球，并用濾紙吸干菌絲球的水分，稱取0.5 g菌絲，放于預冷研缽中，加入液氮研磨至乳白色疏松狀，加入2倍體積樣品緩沖液[稱取6.02 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)，0.5 g磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)，溶于水中，并稀釋至100 mL，pH 7.5]，4℃、10000 r/min離心10 min。取上清液與蔗糖溶液（稱取40 g蔗糖，溶于水中，并稀釋至100 mL）、溴酚藍指示劑混合，比例為8:3:1，混合液即為電泳樣品。采用聚丙烯酰胺凝膠雙槽垂直平板電泳，濃縮膠濃度為3.0%，分離膠濃度為7.5%，染色液為固藍RR-乙酸萘酯染色液[21]。電泳開始時電壓為80 V，溴酚藍指示劑進入分離膠以后，將電壓升至120 V，指示劑距離凝膠底部約1 cm時，結束電泳。取下膠后，用染色液在37℃培養(yǎng)箱染色，最后用7%醋酸溶液（量取14 mL乙酸，加到適量水中，并稀釋至200 mL）固定保存并拍照記錄。計算每個菌株條帶的相對遷移率Rf，如式(1)[17]。

1.6 供試菌株培養(yǎng)及基因組DNA的提取

接種少量菌絲體于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基上，接入前先在平皿培養(yǎng)基上鋪一張滅菌的玻璃紙，25℃活化培養(yǎng)至菌絲長滿平板，而后刮取少量菌絲作為試驗材料，采用TIANGEN DP305植物基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 ISSR分子標記的引物篩選

參照國家行業(yè)標準《食用菌菌種真實性鑒定ISSR法》(NY/T 1730—2009)[22]操作，選本試驗彼此有明顯拮抗的5個供試菌株DNA為模板，經(jīng)過ISSR-PCR擴增，篩選出電泳條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物用于下一步的ISSR試驗。試驗篩選到的引物序列如表2所示。

表2 ISSR分析用引物

1.8 ISSR-PCR擴增

用篩選到的20條多態(tài)性引物對所有供試菌株進行ISSR-PCR擴增，ISSR擴增反應20 μL的總體系為2 × PCR Premix 10 μL、Primer 10 μmol/L 1 μL、DNA 1 μL、ddH2O 8 μL。ISSR擴增反應程序為94℃預變性3min，然后94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，進行35次循環(huán)后72℃延伸5 min。反應結束后，取PCR產(chǎn)物于1.8%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測并拍照[23]。

1.9 子實體農(nóng)藝性狀測定

將18株茶樹菇分別接種到栽培袋中，每個菌株接種32袋，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)至出菇，待茶樹菇子實體生長至七八分熟（菌膜已經(jīng)被打破，菌褶全部舒展開，但菌蓋卻沒有完全打開，顏色由灰白色變?yōu)楹稚樽罴巡墒諘r期即進行采收。從產(chǎn)量、生育期、顏色、子實體規(guī)格（菌蓋直徑、菌柄直徑、菌柄長度）等商品性狀進行農(nóng)藝性狀調查[17]，從中篩選出子實體朵型好、產(chǎn)量高、出菇整齊、生育期短的優(yōu)異菌株。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

酯酶同工酶使用SPSS軟件對茶樹菇菌株酶譜進行聚類分析。ISSR分子標記分析通過擴增條帶在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)與否分別標記為1或0。用SensiAnsys和UPGMA(NTSYS-pc2.1)軟件進行聚類分析，構建樹狀圖[24]。使用SPSS軟件對子實體農(nóng)藝性狀進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗試驗分析

茶樹菇供試菌株間的拮抗反應為隆起型（圖1），依據(jù)拮抗線的有無共分為7組。茶園1號、茶園2號、楊樹洞1號、楊樹上2號和白茶這5個菌株均與其他17個供試菌株都發(fā)生拮抗反應，分別單獨為一組。茶3、古1、古2、AS-1、AS-1-700、AS-2、AS-2-600、茶3-800和茶3神這9個菌株里每一個菌株與其他17個菌株的拮抗反應類型一致，聚為一組，茶5、茶5-800、白茶700和AS-1神這4個菌株里每一個菌株與其他17個菌株的拮抗反應類型一致，聚為一組（表3）。菌株間沒有拮抗反應或拮抗性反應極不明顯，說明其親緣關系很近。而菌株之間都有著不同程度的拮抗反應，表明菌株之間的親緣關系較為疏遠[4,24]。

圖1 茶樹菇供試菌株間的拮抗現(xiàn)象

表3 18株供試菌株間的拮抗反應結果

2.2 酯酶同工酶檢驗

2.2.1 酯酶同工酶電泳圖譜分析 圖2為18個茶樹菇菌株的酯酶同工酶電泳圖譜。18個菌株共檢測出93條酯酶同工酶譜帶，其中遷移率不同的有15條，Rf在0.151～0.636之間。多數(shù)菌株酶帶數(shù)目和遷移率不同，酶帶數(shù)分別為3～8條，多為6條。18個供試菌株分為5個酶譜類型，大部分菌株間酶帶存在一定差異。茶5、茶5-800和白茶700酶帶基本相同；楊樹洞1號和楊樹上2號酶帶基本相同；AS-1-700、AS-2-600、茶3-800、茶3、古2、古1、AS-2、AS-1酶帶基本相同，表明菌株間遺傳差異較小。茶園1號、茶園2號、茶3神、AS-1神和白茶這5個菌株譜帶與其他菌株間的酶譜差異顯著，說明這5個菌株與其他菌株間遺傳差異較大[25-29]。

圖2 茶樹菇酯酶同工酶電泳條帶及對應相對的遷移率

2.2.2 酯酶同工酶聚類分析 由圖3可知，在相似水平為50%時可將供試菌株聚合為6類。第1類包括楊樹洞1號、楊樹上2號2個野生菌株，第2類包括AS-1-700、AS-2-600、茶3-800、茶3、古2、古1、AS-2、AS-1等8個工廠化栽培菌株和輻照誘變菌株，第3類包括茶園2號、AS-1神2個野生菌株和航天誘變菌株，第4類包括茶5、茶5-800、白茶、白茶700等4個工廠化栽培菌株和輻照誘變菌株，第5類為茶園1號野生菌株，第6類為茶3神航天誘變菌株。

圖3 茶樹菇酯酶同工酶聚類分析樹

2.3 ISSR分子標記試驗分析

2.3.1 引物篩選結果 以菌株茶園1號、茶園2號、楊樹洞1號、楊樹上2號和白茶為模板，篩選出20條擴增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物（表2）。

2.3.2 ISSR分析 20條引物共產(chǎn)生164條DNA片段，多態(tài)性條帶數(shù)為133個，平均每個引物產(chǎn)生DNA片段數(shù)為8.2個，平均多態(tài)性比例為81.1%。引物P1的擴增效果較好，共產(chǎn)生11條DNA片段，每個菌株產(chǎn)生DNA片段數(shù)為2～7個，平均為4個（圖4）。當相似系數(shù)在0.47時，所有菌株聚為一個群。當相似系數(shù)達到0.828時，所有菌株聚為6個群（圖5）[4,24,30-31]。類群I包括茶園1號和茶園2號，類群II包括楊樹洞1號和楊樹上2號，白茶單獨聚為類群III，AS-1單獨聚為類群V，類群IV包括茶5、白茶700、茶5-800和AS-1神，其余 8 株聚為類群 VI。其中，AS-2、古 1、古 2、Cha3和茶3-800相異系數(shù)為0，說明各菌株間遺傳差異小或為同一菌株。茶3與茶3神，AS-2與AS-2-600，AS-1與AS-1神、AS-1-700分別聚在了不同的遺傳分支，說明這7株茶樹菇可能在輻照或航天誘變后產(chǎn)生ISSR標記多態(tài)性的種內變異[11]。系統(tǒng)發(fā)育分析中18個菌株聚為6個分支，應視為6個遺傳株系，分支間遺傳距離較大，可在遺傳分支間挑選親本菌株進行雜交育種，以充分發(fā)揮雜交后代遺傳互補優(yōu)勢[32]。

圖4 引物P1的ISSR電泳圖譜

圖5 茶樹菇供試菌株的ISSR聚類樹

2.4 茶樹菇菌株的子實體農(nóng)藝性狀

供試菌株子實體階段性狀比較結果見表4。菌蓋厚度最厚的是茶5，菌蓋直徑最大的是AS-1，菌柄長度最長的是AS-2，菌柄直徑最大的是茶5；菌株茶5、AS-1、茶3、白茶、茶園1號和楊樹洞1號生育期較短；菌株茶3、AS-1、白茶、茶5、茶園1號和楊樹洞1號產(chǎn)量較高。綜合比較初步篩選出較優(yōu)菌株茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5，可作為工廠化生產(chǎn)茶樹菇菌種，其出菇照片如圖6所示。

表4 18個茶樹菇菌株的子實體農(nóng)藝性狀

3 結論與討論

茶樹菇集食用、保健和藥用價值于一身，是目前國內重要的栽培食用菌之一，近年來，茶樹菇在國內發(fā)展迅速，已成為國內第九大類栽培食用菌類，年產(chǎn)量約為65.6萬t，占全國比例達50.36%[33-34]。但因為地域、標準、來源等原因，茶樹菇分類及命名混亂。因此，為了保證菌株的可持續(xù)栽培，建立一個可靠的茶樹菇遺傳多樣性評價方法顯得尤為重要[24]。

圖6 茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5的栽培出菇照片

本研究應用拮抗、酯酶同工酶和ISSR技術對18個不同類型的茶樹菇進行菌株分型，3種試驗方法得出的分型結果大致相同，與筆者曾采用ITS序列對相同供試材料的分型結果基本一致[9]。與單一試驗方法的聚類結果相比較，3種試驗方法相結合能夠更真實準確地顯示出菌株之間的親緣關系。ISSR、ITS和酯酶同工酶3種分析方法在研究茶樹菇的親緣關系方面較其拮抗反應的結果更細致，因此拮抗試驗只能作為菌株分型的初步研究，更深一步的研究就需要通過現(xiàn)代分子生物學的方法[24]進行。

AS-1、AS-2、白茶、茶5和茶3是江西茶樹菇主產(chǎn)區(qū)的主栽品種，在拮抗試驗中5株菌聚在3個分支，在酯酶同工酶分析中5株菌聚在2個分支，在ISSR標記分析中5株菌聚在4個分支，在ITS序列分析中5株菌聚在3個分支，不同的遺傳分支系統(tǒng)發(fā)育關系較遠。栽培中可將不同分支菌株搭配種植，以擴大栽培菌株間的遺傳背景，利于改良栽培品種結構，提高茶樹菇栽培品種對環(huán)境、病蟲害等因素的適應性[11,32]。

在酯酶同工酶、ISSR和ITS分析中，茶3與茶3神、AS-1與AS-1神分別聚在了不同的分支，說明這4株茶樹菇可能由于航天誘變同工酶譜、ISSR標記的多態(tài)性及ITS序列發(fā)生改變。菌株經(jīng)航天誘變產(chǎn)生的變異可以改變菌株因長期栽培導致的菌種退化，可以選擇產(chǎn)生有利性狀的誘變菌株作為父母本進行雜交，增強后代的雜種優(yōu)勢。楊樹上2號、楊樹洞1號、茶園1號、茶園2號菌株為江西境內野生分離菌株，在拮抗試驗和ISSR分析中，4株菌單獨分支，在酯酶同工酶和ITS分析中4株菌聚為3支，4株菌與傳統(tǒng)栽培菌株親緣關系較遠，又因其采自野生環(huán)境，具有特有的環(huán)境適應性、抗逆性等優(yōu)良特性，可以作為優(yōu)良親本菌株在育種中應用[11,32]。

工廠化栽培要求菌株具有菌絲生長速度快、生長周期短、產(chǎn)量高、品質優(yōu)、耐儲運的特性[26]。本研究綜合比較初步篩選出較優(yōu)菌株茶園1號、楊樹洞1號、AS-1、茶3、白茶和茶5，可作為工廠化生產(chǎn)茶樹菇菌種。

基于本實驗室正在開展的茶樹菇全基因組、轉錄組和重測序等關聯(lián)分析技術，下一步將通過覆蓋全基因組范圍的SSR、SNP和INDEL等分子標記，構建高密度遺傳連鎖圖譜，圖位克隆高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆、抗病蟲、耐高溫、耐儲運等優(yōu)異性狀的基因，實現(xiàn)優(yōu)異基因資源定向導入茶樹菇的目的，提高特色茶樹菇精準鑒定和評價，發(fā)掘新的茶樹菇特色物種和篩選具有重要經(jīng)濟價值的優(yōu)異菌株，充分發(fā)揮江西省茶樹菇資源優(yōu)勢和提升茶樹菇種質資源創(chuàng)新利用水平。