劉 超 王 芳 李繼峰 武 強(qiáng) 李志國(guó) 金黛麗 靳 菲

1 河南省鶴壁市人民醫(yī)院麻醉科 458000； 2 濟(jì)寧中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸消化內(nèi)科

瑞芬太尼是一種短效的μ型阿片受體激動(dòng)劑，在臨床中應(yīng)用廣泛，尤其是急性、慢性疼痛的治療及全身麻醉的維持[1]。瑞芬太尼痛覺過敏(Remifentanil-induced hyperalgesia，RIH)是指應(yīng)用瑞芬太尼所導(dǎo)致的機(jī)體對(duì)傷害性刺激的反應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為痛閾降低、痛感增強(qiáng)或痛覺異常[2]。研究表明RIH的分子機(jī)制可能包括MOR表達(dá)水平的下調(diào)和功能改變、中樞N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)激活、脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化等多方面，但具體機(jī)制尚不明確[3-4]。蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)已被證實(shí)參與多種疼痛調(diào)節(jié)信號(hào)通路，在神經(jīng)損傷后脊髓PKC表達(dá)水平顯著增加，且抑制PKC表達(dá)后可抑制NMDA受體的磷酸化，延緩?fù)从X過敏的發(fā)生[5-6]，但目前關(guān)于PKC在RIH中是否存在異常表達(dá)及是否參與RIH的發(fā)生尚不夠明確。因此，本研究通過建立RIH切口痛模型并檢測(cè)PKC在RIH大鼠脊髓背角中的表達(dá)情況，分析PKC表達(dá)與RIH發(fā)生可能的相關(guān)性，以期為瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 30只6周齡SD雄性大鼠，體重(200±15)g，均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物檢疫許可證號(hào)SYXK(豫)-2017-0001。注射用鹽酸瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030198)；PKC抑制劑Go6983(MedChemExpress公司)；PKC兔抗大鼠多克隆一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠NMDA受體NR1、NR2A及NR2B亞基一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理:將30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、瑞芬太尼組(R組)、切口痛模型組(M組)、瑞芬太尼+切口痛模型組(RM組)和PKC抑制劑組(Inhibitor組)，每組6只。所有大鼠均經(jīng)七氟醚麻醉(3%誘導(dǎo)，1%保持)后，尾靜脈置管，R組、RM組及PKC抑制劑組以1.0μg/(kg·min)的速度靜脈輸注瑞芬太尼，對(duì)照組及M組輸注同體積的0.9%NaCl溶液；5min后對(duì)M組、RM組和PKC抑制劑組建立Brennan切口痛模型，PKC抑制劑組大鼠在切口造模完成后背部剃毛、皮膚消毒，在L4～5處穿刺將 Go6983(5μl)注射入脊髓鞘內(nèi)。對(duì)照組和R組僅仰臥固定于手術(shù)臺(tái)相同時(shí)間。

Brennan切口痛建模方法[7]：在無(wú)菌的環(huán)境下，建立SD大鼠左后足切口痛模型。其操作步驟如下：(1)取大鼠仰臥位，側(cè)頭固定于手術(shù)臺(tái)上，充分暴露左后足并用碘伏消毒；(2)用已消毒的11號(hào)刀片從足跟0.5cm處縱向延伸切開足面皮膚，切口長(zhǎng)度約1cm，切口深至淺層筋膜；(3)在保持肌肉起止完整、不傷及周圍神經(jīng)和血管的情況下，用眼科鑷分離足骨膜與跖屈肌。術(shù)后繼續(xù)輸注瑞芬太尼(或0.9%NaCl)，25min后停止輸注并撤下尾靜脈留置軟管，同時(shí)消毒處理。在大鼠蘇醒后置于室溫、干燥、安靜的環(huán)境中單只分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 痛覺行為學(xué)檢測(cè):分別于建模前24h(T-1)以及造模后2h(T1)、6h(T2)、24h(T3)、48h(T4)測(cè)定大鼠的熱刺激縮足潛伏期(Paw withdrawal thermal latency，PWL)和機(jī)械刺激縮足閾值(Paw withdrawal mechanical threshold，PWT)，每次測(cè)定前大鼠置于測(cè)定環(huán)境中適應(yīng)性活動(dòng)10min。采用熱刺痛儀(XR-YLS-22A，Xmaze)測(cè)定大鼠PWL，von Frey纖維絲(美國(guó)stoelting)測(cè)定PWT，測(cè)定間隔時(shí)間均為10min，測(cè)量3次取平均值。其中，PWL以秒(s)記錄，PWT以克(g)記錄。

PWL測(cè)定操作：基礎(chǔ)溫度設(shè)定為50°C，記錄大鼠從左后足接觸熱板至出現(xiàn)縮足、墊腳、嘶叫、掙扎、舔舐等陽(yáng)性反應(yīng)的時(shí)間即為PWL，超過30s者計(jì)為30；PWT測(cè)定操作：將大鼠放置在懸空金屬籠中，采用von Frey纖維絲垂直刺激左后足第2、3腳趾間，距切口約1cm，記錄出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)的刺激壓力值，上限為60g。

1.2.3 Western Blot:行為學(xué)檢測(cè)完成后，將大鼠立即乙醚麻醉，而后頸椎脫臼處死。迅速縱向剪開椎弓根，充分暴露脊髓組織，取左側(cè)L4～6脊髓背角組織并保存于-80℃冰箱中。采用Western blot檢測(cè)脊髓背角PKC的表達(dá)水平：將已解凍的脊髓背角組織置于培養(yǎng)皿中，加入細(xì)胞裂解液后磨成勻漿，12 000r/min離心10min，取上清；采用總蛋白提取試劑盒(Solarbio)提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；而后經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉1h后，分別加入PKC(1∶2 000)、NR1、NR2A、NR2B(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜；次日PBS清洗3次后，加入二抗羊抗兔IgG，室溫孵育2h；PBS清洗3次后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影，用Image J計(jì)算灰度值比(以β-actin為內(nèi)參)。

2 結(jié)果

2.1 痛覺行為學(xué)檢測(cè) 痛覺行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，建模前(T-1)各組PWL及PWT均無(wú)顯著差異(P>0.05)；T1～T4時(shí)，與對(duì)照組相比，其余各組的PWL和PWT均顯著降低(P<0.05)；與M組及R組相比，RM組和Inhibitor組PWL和PWT均顯著降低(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組PWL和 PWT顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組SD大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的PWL及PWT比較

2.2 各組PKC的相對(duì)表達(dá)情況 Western Blot檢測(cè)各組PKC的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0.65±0.04)相比，R組(1.36±0.08)、M組(1.52±0.10)和RM組(2.57±0.12)的PKC表達(dá)均顯著升高，且RM組顯著高于R組和M組(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組PKC表達(dá)(1.02±0.10)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組PKC蛋白表達(dá)情況

2.3 各組NMDA受體蛋白表達(dá)比較 Western Blot檢測(cè)各組NMDA受體亞基的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，其余各組NR1、NR2B的表達(dá)水平及NR2A/NR2B比值均升高，且RM組和Inhibitor組顯著高于R組和M組(P<0.05)；與RM組相比，Inhibitor組NR1、NR2B表達(dá)及NR2A/NR2B比值均降低(P<0.05)。見圖2和表2。

表2 各組脊髓背角總蛋白中NR1、NR2A、NR2B表達(dá)水平比較

圖2 各組NMDA受體蛋白表達(dá)比較

3 討論

疼痛是實(shí)際或潛在組織損傷所引起的不愉快感覺和情感體驗(yàn)，由于個(gè)體化差異每個(gè)人的痛覺敏感度不同。醫(yī)學(xué)上的痛覺過敏是指病理性的疼痛反應(yīng)過敏感，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)正常疼痛刺激的敏感性增加、疼痛忍耐閾值降低[8]。近年來(lái)，隨著瑞芬太尼在臨床的廣泛應(yīng)用，其引起的術(shù)后痛覺過敏現(xiàn)象被越來(lái)越多的醫(yī)患和學(xué)者關(guān)注。據(jù)報(bào)道，與其他阿片類鎮(zhèn)痛藥物相比，瑞芬太尼引發(fā)痛覺過敏的發(fā)生率顯著更高，達(dá)16%以上，且一般于術(shù)后24～48h的達(dá)到痛敏高峰，而后逐漸衰弱并趨于正常[9-11]。因此，本研究檢測(cè)了各組大鼠術(shù)后2～48h的痛覺行為學(xué)指標(biāo)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，R組在不同時(shí)間點(diǎn)的 PWL和PWT均顯著降低，RM組顯著低于M組，且在術(shù)后48h時(shí)PWL和PWT達(dá)到最低，與現(xiàn)有研究結(jié)果基本一致。

而隨著人類對(duì)痛覺敏感認(rèn)知和手術(shù)質(zhì)量要求的提高，RIH發(fā)生機(jī)制的研究被越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注，現(xiàn)有研究認(rèn)為其可能涉及NMDA受體激活、離子通道、信號(hào)通路及細(xì)胞因子等多個(gè)方面，但仍缺乏具體和全面的機(jī)制研究結(jié)論[2,12]。PKC是重要的磷脂依賴性蛋白激酶，由多種同工酶組成，按其結(jié)構(gòu)和功能可分為鈣依賴型PKC(α、β1、β2、γ亞類)、鈣不敏感型PKC(δ、ε、η、θ、μ亞類)和非典型PKC(λ、ζ亞類)，其中，PKCγ是神經(jīng)系統(tǒng)特有的亞型，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在脊髓組織中，PKC僅表達(dá)于脊髓背角LaminaⅡ?qū)觾?nèi)側(cè)的中間神經(jīng)元中[13]。據(jù)報(bào)道，PKC參與細(xì)胞凋亡、骨架蛋白重塑以及離子通道調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)過程，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)通路中充當(dāng)?shù)诙攀沟慕巧?，通過調(diào)節(jié)離子通道和受體參與誘導(dǎo)和維持中樞痛覺敏感化過程，但其具體機(jī)制尚不清楚[14]。有文獻(xiàn)報(bào)道PKC參與痛覺過敏過程，其作用機(jī)制可能是通過激活NMDA受體開啟Ca2+通道，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流聚集，激活PKC，活化后的PKC進(jìn)一步作用于NMDA受體，使得Ca2+內(nèi)流進(jìn)一步加劇，形成反饋性惡性循環(huán)，導(dǎo)致傷害性感受信號(hào)持續(xù)傳入和增加，即引發(fā)痛覺過敏[15]。研究表明，PKC在慢性坐骨神經(jīng)壓迫疼痛和炎性疼痛模型中表達(dá)上調(diào)，而PKC抑制劑可降低脊髓中星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度，緩解大鼠機(jī)械痛敏[16-17]；Yuan Y等[18]的研究表明RIH大鼠脊髓背角中存在PKC異常高表達(dá)，而干擾NMDA-PKC-Ca2+/CaMKⅡ通路可預(yù)防瑞芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏；于萍等[19]研究結(jié)果顯示在RIH術(shù)后24h后，大鼠的PWL和PWT值顯著降低，脊髓背角神經(jīng)元中PKC表達(dá)顯著上調(diào)，注射PKC抑制劑后可緩解大鼠痛覺過敏情況。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后48h時(shí)RM組PWL和PWT值達(dá)到最低，其脊髓背角中PKC的表達(dá)水平最高，顯著高于M組和R組，提示PCK的表達(dá)水平與RIH大鼠痛覺過敏有關(guān)；而與RM組相比，PKC抑制劑組PWL和PWT值均升高，PKC表達(dá)也顯著降低，提示抑制PKC的表達(dá)在一定程度上可以抑制痛覺過敏，與現(xiàn)有研究結(jié)論基本一致。痛覺過敏產(chǎn)生的機(jī)制之一是NMDA受體的激活和傳遞神經(jīng)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其可以通過調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流等促使痛覺信號(hào)的傳遞。NR1是NMDA受體的亞基之一，其磷酸化是NMDA受體激活的標(biāo)志，目前研究多采用NR1表達(dá)水平及NR2A/NR2B比值來(lái)代表NMDA受體的激活程度和痛覺敏感度的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。本研究同時(shí)檢測(cè)了脊髓背角中NMDA受體的表達(dá)，結(jié)果顯示，RM組NR1、NR2B的表達(dá)水平及NR2A/NR2B比值顯著高于R組及M組，抑制劑組顯著低于RM組，提示抑制PKC的表達(dá)可能通過抑制NMDA受體的激活來(lái)抑制痛覺過敏的發(fā)生。

綜上所述，本研究表明PKC在RIH大鼠脊髓背角中高表達(dá)，可能參與RIH的發(fā)生過程。抑制PKC的表達(dá)可能通過抑制NMDA受體的激活從而抑制痛覺過敏的發(fā)生。本研究為瑞芬太尼誘導(dǎo)痛覺過敏的機(jī)制研究和靶向治療提供了新的思路。