姚劉旭， 滕文彬， 黃素琴， 李玉紅△， 蔣宗明

［1紹興文理學院醫(yī)學院，浙江 紹興 312000；2浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院麻醉科，浙江 杭州 310000；3樹人大學樹蘭國際醫(yī)學院附屬樹蘭（杭州）醫(yī)院麻醉科，浙江 杭州 310004；4紹興文理學院醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院麻醉科（紹興市人民醫(yī)院），浙江 紹興 312000］

腸上皮細胞及其相鄰的緊密連接結(jié)構(gòu)（tight con?junctions，TJs）是腸黏膜屏障的重要組成部分，參與機體營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、防止腸道微生物侵襲及腸黏膜損傷后修復。研究表明，生理情況下，腸上皮細胞處于“生理性低氧”環(huán)境中，腸上皮細胞可以適應(yīng)缺氧，低氧環(huán)境是腸道共生菌生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，能促進腸道物質(zhì)運輸［1］；病理情況下，血流微小波動會導致氧輸送較大幅度的下降，導致腸黏膜缺血/缺氧；膿毒癥時，炎癥反應(yīng)導致組織代謝旺盛，氧耗增加，腸黏膜血管收縮，黏膜通透性增加［2-3］，氧供降低，腸上皮細胞缺氧程度加重［4］。缺氧誘導因子1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）是人體適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在膿毒癥的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。HIF-1α 由氧依賴的α 亞基和持續(xù)性表達的β亞基組成［6］，主要在急性缺氧反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。我們最近研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠腸黏膜HIF-1α表達上調(diào)，給予HIF-1α 激活劑二甲氧基丙烯酰甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）能抑制膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，增加抗氧化物質(zhì)水平，緩解腸黏膜屏障損傷；而給予HIF-1α 抑制劑Bay87-2243 干預，作用則與其激活劑相反。結(jié)果提示HIF-1α 對膿毒癥時期的腸黏膜具有保護作用［3］。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/p70 核糖體蛋白S6 激酶（mamma?lian target of rapamycin kinase/ribosomal protein S6 ki?nase，mTOR/P70S6K）信號通路是HIF-1α上游調(diào)節(jié)信號，是代謝中關(guān)鍵通路，在能量調(diào)節(jié)的過程中發(fā)揮著重要的作用［8］。研究表明，激活mTOR 信號通路能夠上調(diào)HIF-1α 的表達，增加糖酵解導致代謝重編程，激活“訓練免疫”，從而改善炎癥，而抑制mTOR 信號通路則具有相反的作用［9］。膿毒癥腸道上皮損傷中mTOR/P70S6K 信號通路是否調(diào)節(jié)HIF-1α 的表達仍有待進一步研究。

本研究分為兩部分，第一部分：采用脂多糖（li?popolysaccharide，LPS）刺激誘導人結(jié)腸上皮細胞株Caco-2 模擬膿毒癥腸黏膜屏障損傷體外模型，觀察HIF-1α 激活劑和抑制劑對腸黏膜屏障功能的影響，探討HIF-1α 表達是否對腸黏膜屏障功能具有保護作用；第二部分：觀察mTOR 激活劑和抑制劑對HIF-1α 表達、腸黏膜屏障功能的影響，探討HIF-1α 表達是否受mTOR/P70S6K信號通路的調(diào)控。

材料和方法

1 主要材料與試劑

人結(jié)腸癌Caco-2 細胞株（中國科學院上海細胞庫）；熒光素標記的右旋糖酐（fluorescein isothiocya?nate-dextran，F(xiàn)D4）、脂 多 糖（lipopolysaccharides，LPS）購自Sigma；兔抗大鼠ZO-1、HIF-1α 和occludin多克隆抗體（Invitrogen）；claudin-1 和β -actin（Ab?cam）；mTOR、p-mTOR、P70S6K 和p-P70S6K 多克隆抗體（Cell Signaling Technology）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（Jackson ImmunoReserech）；DMOG、BAY87-2243、雷帕霉素（rapamycin，Rapa）和MHY1486 等（MedChemExpress）；胎牛血清、MEM 培養(yǎng)液、青霉素/鏈霉素、谷丙二肽、丙酮酸鈉、非必須氨基酸以及0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethyl?ene diamine tetraaceticacid，EDTA）均購自Gibco。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞株Caco-2 經(jīng)細胞復蘇后，用含10% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素（100×）、1% 丙酮酸鈉、1% 谷氨酰胺和1% 非必需氨基酸的MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)Caco-2 細胞。細胞在5% CO2環(huán)境中37 ℃孵育。每隔2 天更換1 次培養(yǎng)液。將對數(shù)期分化良好的Caco-2 細胞按2×108/L 的密度接種于24孔聚酯膜中，每孔400 μL，于基底側(cè)加入600 μL 培養(yǎng)液。接種24 h 后換液培養(yǎng)。接下來一周隔天換液，一周后每天換液，定期觀察細胞生長情況，每日用Millicell ERS-2 Epithelial Volt-Ohm Meter電阻儀測定跨上皮細胞電阻（trans-epithelial electrical resis?tance，TEER）值。培養(yǎng)約21 d，待細胞形成完整致密單層，TEER 值顯著升高且保持穩(wěn)定，表明模型基本形成。實驗中，LPS、DMOG、BAY87-2243、Rapa 以及MHY1487等均溶于細胞培養(yǎng)液中。

2.2 Caco-2 損傷模型建立及實驗分組實驗分兩部分，第一部分細胞分組：對照（control，Ctrl）組、細胞屏障損傷模型組（LPS組）、LPS+DMOG（HIF-1α 激活劑）組和LPS+BAY87-2243（HIF-1α 抑制劑）組；第二部分細胞分組：Ctrl 組、LPS 組、LPS+Rapa（mTOR 抑制劑）組；LPS+MHY1487（mTOR 激活劑）組；LPS+Rapa+DMOG 組和LPS+MHY1487+BAY87-2243 組。對照組用細胞普通培養(yǎng)液培養(yǎng)；LPS 組細胞給予500 mg/L LPS 刺激構(gòu)建細胞屏障損傷模型；LPS+DMOG組細胞在LPS 基礎(chǔ)上給予10 μmol/L HIF-1α 激活劑DMOG；LPS+BAY87-2243 組細胞在LPS 基礎(chǔ)上給予10 μmol/L HIF-1α 抑制劑BAY87-2243；LPS+Rapa 組細胞在LPS基礎(chǔ)上給予10 nmol/L mTOR 抑制劑rapa?mycin；LPS+MHY1487 組細胞在LPS 基礎(chǔ)上給予100 nmol/L mTOR 激活劑MHY1487；LPS+Rapa+DMOG 組細胞在LPS、Rapa 基礎(chǔ) 上 給 予10 μmol/L DMOG；LPS+MHY1487+BAY87-2243 組細胞在LPS、MHY1487L 基礎(chǔ)上給予10 μmol/L BAY87-2243。所有組處理溶劑中均含有0.1% 的二甲基亞砜（di?methylsulfoxide，DMSO）。

2.3 單層屏障跨膜TEER 測定電極放入70% 乙醇浸泡15 min，取出風干15 s，然后放入37 ℃的Hanks 平衡鹽緩沖溶液（hank's balanced salt solu?tion，HBSS）溶液中平衡15 min。移走培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，在上室側(cè)每孔加400 μL 預熱的HBSS，基底側(cè)每孔加600 μL，37 ℃培育箱平衡30 min，同時洗去細胞表面的雜質(zhì)，移走HBSS，重新加入預熱的HBSS，測定跨膜電阻值，用1 個空白載體重復上述步驟以獲得空白值。

TEER（Ω·cm2）=（測定電阻值-空白值）×單層表面積。

2.4 異硫氰酸熒光素右旋糖酐滲透率檢測細胞分組處理后，去除培養(yǎng)基，避光條件下，上室加入400 μL 含有1 g/L 熒光素標記的右旋糖酐的HBSS 溶液［10］，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h 后，取基底側(cè)溶液100 μL，使用熒光酶標儀測定（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm）。繪制濃度標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

2.5 Western blot 檢測TJs 相關(guān)蛋白和HIF-1α 蛋白表達按預定實驗方案處理各實驗組細胞完畢后，將細胞用冷PBS 洗滌兩次，加入含苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的蛋白RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 ×g離心15 min 后取上清。經(jīng)BCA 方法定量后，取40 g 總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸3～5 min變性，上樣于6%～10% 十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜，用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TBST（TBS+Tween）緩沖液室溫封閉2 h。TBST 洗滌3 次，每次5 min。加入抗HIF-1α（1∶1000）、抗ZO-1（1∶1000）、抗occludin（1：1000）、抗claudin-1（1∶1000）、抗β-actin（1∶2 000）、抗p-mTOR（1∶1 000）、抗mTOR（1∶1 000）、抗p-P70S6K（1∶1 000）、抗P70S6K（1∶1 000）、抗GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。 經(jīng)TBST 充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體室溫反應(yīng)2 h，TBST 洗滌3 次，用ECL 發(fā)光試劑盒顯影。膠片在凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用ImageJ軟件分析灰度值。

2.6 CCK-8 實驗當Caco-2 細胞生長至70%～80%融合度時，用胰蛋白酶消化并收集貼壁細胞，離心后制成細胞懸液。按2×107/L的細胞密度，于96孔板中加入100 μL 細胞懸液。在培養(yǎng)箱中孵育24 h 后（37 ℃、5% CO2）進行實驗分組，每組設(shè)置6 個復孔。培養(yǎng)箱中孵育24 h后，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，然后在培養(yǎng)箱中培育2 h。使用酶標儀在450 nm處測定吸光度（A）值。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用單因素方差分析法分析各組間差異。對于方差齊的數(shù)據(jù)，使用LSD 法進行兩兩比較；對于方差不齊的數(shù)據(jù)，采用Dunnett T3 檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 HIF-1α激活劑和抑制劑對LPS刺激后Caco-2細胞TEER值和FD4濃度的影響

LPS 刺激Caco-2 細胞后TEER 值顯著低于對照組（P<0.05）。與LPS 組比較，DMOG 可顯著升高細胞TEER值，降低FD4濃度（P<0.05）；而BAY87-2243的作用與DMOG相反，見圖1。

Figure 1.Effects of HIF-1α agonist（DMOG）and inhibitor（BAY87-2243）on TEER value and FD-4 concentration of Caco-2 cells af?ter LPS stimulation.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs LPS group.圖1 HIF-1α激動劑和抑制劑對LPS刺激后Caco-2細胞TEER值和FD-4濃度的影響

2 HIF-1α 激活劑和抑制劑對LPS 刺激后Caco-2細胞TJs蛋白表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，LPS 可增加Caco-2細胞HIF-1α 蛋白的表達水平（P<0.05）。與LPS 組比較，DMOG 使得HIF-1α 和TJs 相關(guān)蛋白ZO-1、oc?cludin 和claudin-1 的表達上調(diào)，而BAY87-2243 的作用則與DMOG相反（P<0.05），見圖2。

3 HIF-1α緩解LPS 誘導的Caco-2 細胞屏障損傷，其機制與mTOR/P70S6K通路有關(guān)

與LPS 組 相比，LPS+Rapa 組的Caco-2 細胞TEER 值顯著降低，F(xiàn)D-4 濃度顯著增加（P<0.05），pmTOR、p-p70S6K 和HIF-1α 蛋白表達水平顯著降低，TJs 相關(guān)蛋白（ZO-1、occludin、claudin-1）表達水平降低（P<0.05）；而LPS+MHY1487 組中Caco-2 細 胞TEER 值顯著升高，F(xiàn)D-4 濃度顯著降低，p-mTOR 和p-p70S6K 表達水平顯著增加（P<0.05），但HIF-1α 和TJs 相關(guān)蛋白表達水平無明顯變化（P>0.05）。與LPS+Rapa組相比，LPS+Rapa+DMOG 組的TEER值顯著升高，F(xiàn)D-4 濃度顯著降低（P<0.05），p-mTOR 和pp70S6K 的表達水平無明顯變化，HIF-1α 和TJs 相關(guān)蛋白表達水平增加（P<0.05）。與LPS+MHY1487（L+M）組相比，LPS+MHY1487+BAY87-2243 組Caco-2 細胞TEER 值顯著降低，F(xiàn)D4 濃度顯著增加（P<0.05），p-mTOR 和p-p70S6K 的表達水平無明顯變化（P>0.05），HIF-1α 和TJs 相關(guān)蛋白表達水平降低（P<0.05），見圖3。

討 論

膿毒癥是一種危及生命的臨床綜合征，嚴重感染可引起多個器官功能障礙，如腸道屏障功能障礙［11］。HIF-1α 是組織代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在膿毒癥發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果表明，LPS誘導Caco-2 細胞損傷，表現(xiàn)為緊密連接蛋白表達下調(diào)，通透性增加；HIF-1α 可以緩解LPS 誘導的Caco-2細胞損傷，并且其機制可能與mTOR/P70S6K 信號通路有關(guān)。

Caco-2 單層屏障模型作為體外模擬腸道屏障和藥物轉(zhuǎn)運的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要組成部分，是引起過度炎癥級聯(lián)導致膿毒癥的主要原因。腸道上皮功能的失調(diào)會導致與膿毒癥相關(guān)的器官衰竭，膿毒癥會致使多種轉(zhuǎn)錄因子激活來適應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。LPS 是核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路的有效激活劑，通過Toll 樣4 受體（toll-like receptor 4，TLR4）信號傳遞可上調(diào)HIF-1α 的mRNA 水平，促使其穩(wěn)定［12-13］。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）等炎癥介質(zhì)在炎癥性腸病中會引起腸道功能障礙［14］。

Figure 2.Effects of HIF-1α agonists（DMOG）and inhibitors on（BAY87-2243）expression of HIF-1α and TJs proteins（ZO-1，oc?cludin and claudin-1）in LPS-stimulated Caco-2 cells.Mean±SD. n=6.**P<0.01 vs Ctrl group；##P<0.01 vs LPS group.圖2 HIF-1α激動劑和抑制劑對LPS刺激的Caco-2細胞HIF-1α和TJs蛋白表達的影響

FD4 是腸道通透性和腸道屏障改變的標志物［15］。TJs，包括ZO-1、occludin 和claudin-1 等，是維系細胞間連接與細胞屏障的重要組成部分［16-17］。Oc?cludin 在維持腸道細胞TEER 值中有重要的作用，具有黏附功能，扮演著柵欄的角色；claudin-1 影響著細胞間物質(zhì)滲透率，形成細胞旁離子的選擇性通道，尤其是陽離子；ZO-1 與多種細胞骨架蛋白綁定，對TJs起到支撐骨架作用［18-19］。

本研究結(jié)果表明，HIF-1α 在LPS 刺激的Caco-2中的表達增強。脯氨酸羥化酶抑制劑，HIF-1α 刺激劑DMOG，在常氧條件下可以激活HIF-1α［18］，常用于體內(nèi)外促進HIF-1α積累。本研究表明在體外LPS刺激的Caco-2 中，DMOG 也能明顯提高HIF-1α 的表達水平，增加TEER 值，降低FD4濃度以及上調(diào)腸道TJs相關(guān)蛋白表達水平，而BAY87-2243 作用則與DMOG相反。表明HIF-1α 在膿毒癥中緩解炎癥和降低氧化應(yīng)激水平以及改善腸道上皮損傷中發(fā)揮著重要的作用。

Figure 3.The effect of HIF-1α on LPS-induced barrier damage in Caco-2 cells is regulated by the mTOR/P70S6K pathway.A：rapa?mycin（mTOR inhibitor）decreased TEER of Caco-2 cell monolayer，and MHY1487（mTOR activator）increased TEER of Caco-2 cell monolayer.DMOG（HIF-1α activator）can rescue the decrease of TEER caused by rapamycin，and BAY87-2243（HIF-1α inhibitor）can rescue the increase of TEER caused by MHY1487；B：rapamycin increased the FD4 concen?tration in Caco-2 cell monolayer，while MHY1487 had opposite effect.DMOG rescued the increase in FD4 concentration caused by rapamycin，and BAY 87-2243 rescued the decrease in FD4 concentration caused by MHY1487；C：Western blot was used to detect the expression of p-mTOR，p-P70S6K，HIF-1α and TJs（ZO-1，occludin and claudin-1）.Mean±SD. n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group；##P<0.01 vs LPS+Rapa group；△P<0.05，△△P<0.01 vs LPS+MHY1487 group.圖3 HIF-1α緩解LPS誘導的Caco-2細胞屏障損傷受mTOR/P70S6K通路調(diào)節(jié)

腸道HIF-1α 缺陷型小鼠被證實可以加劇腸道屏障的破壞［19］。Colgan 等［20］研究表明，與野生型動物相比，腸道上皮HIF-1α突變（抑制HIF-1α表達）可導致更嚴重的結(jié)腸炎，體重減輕，結(jié)腸長度減少，腸道通透性增加；相反，von Hippel-Lindau 突變（引起HIF-1α 持續(xù)表達）的腸上皮則表現(xiàn)為對腸道功能的保護作用。Claudin-1已被證明在各種人類疾病中調(diào)節(jié)功能失調(diào)［21］。Masterson 等［22］證實在腸道上皮中HIF-1α 對claudin-1 有著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，通過敲除和過表達實驗，表明HIF-1α 在基因啟動子水平上對claudin-1 表達起著基本調(diào)節(jié)作用。在TJs 靶標篩選中，claudin-1是HIF-1α缺陷型腸上皮細胞株TJs形態(tài)異常的主要原因［23-24］。

膿毒癥引發(fā)過度炎癥可引起機體能量過度消耗和多種臟器功能的損害。mTOR 信號通路是能量消耗中反應(yīng)能量狀態(tài)和自我吞噬的主要感受器［25］，對HIF-1α 有級聯(lián)放大作用［26-27］。mTOR 信號通路或許在膿毒癥腸道功能損害中發(fā)揮著重要的作用。mTOR 是雷帕霉素復合物1 的一部分，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（即AKT）在下游被磷脂酰肌醇-3-激酶激活，隨后激活mTOR［24］。mTOR 能磷酸化p70S6K［28-29］，隨后p70S6K 激活40S 核糖體蛋白S6［30］對HIF-1α蛋白的合成起到促進作用［31-32］。同樣的，mTOR 也可以磷酸化真核細胞起始因子4E 結(jié)合蛋白1（4EBP1）［28］，使4E-BP1 不能與真核細胞翻譯抑制因子4E（eIF-4E）結(jié)合并抑制eIF-4E［33］，從而阻礙HIF-1α蛋白的合成［34］。

mTOR 抑制劑rapamycin 可以抑制HIF-1α 蛋白合成，降低HIF-1α 活性［35］。在膿毒癥大鼠中，rapa?mycin 可以明顯降低心肌中p-mTOR、p-P70S6K 以及HIF-1α 的含量，通過抑制心肌細胞自噬發(fā)揮保護作用［35］。本研究中，使用mTOR 抑制劑rapamycin 在LPS 刺激的Caco-2 細胞中，降低HIF-1α 表達，降低TEER 值，增加FD4 濃度以及降低TJs 相關(guān)蛋白的表達水平，表明rapamycin 可抵消HIF-1α 對LPS 誘導的腸黏膜細胞的保護作用。而mTOR 激活劑MHY1487部分改善LPS 誘導的腸黏膜損傷作用，可能不通過HIF-1α起作用，具體機制還需要進一步研究。

綜上所述，本研究顯示HIF-1α 可減輕LPS 誘導的腸上皮Caco-2 細胞屏障功能損傷，其機制可能與mTOR/P70S6K 信號通路調(diào)控，改善緊密連接結(jié)構(gòu)的變化和相關(guān)蛋白的表達，減低腸黏膜通透性有關(guān)。