甄寧新， 崔 巍， 田寶平

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310009）

免疫系統(tǒng)由先天性免疫和適應(yīng)性免疫組成。先天免疫反應(yīng)作為機(jī)體免疫防御的第一道防線，能通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）迅速識(shí)別入侵體內(nèi)的病原體及組織或細(xì)胞受到損傷、低氧等因素刺激后釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），進(jìn)而產(chǎn)生快速而非特異性的免疫應(yīng)答［1］。線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）作為一種損傷相關(guān)分子模式，在激活先天免疫反應(yīng)、促進(jìn)炎癥的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［2］。mtDNA 的釋放與炎性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［2］。隨著對(duì)胞質(zhì)DNA感受器探索的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)DNA 感受器——環(huán)鳥苷酸-腺苷酸［cyclic GMP-AMP，cGAMP］合成酶（cGAMP syn?thase，cGAS）能識(shí)別胞質(zhì)中的mtDNA，激活下游干擾素基因刺激因子［stimulator of interferon（IFN）genes，STING），進(jìn)而促進(jìn)I 型IFN、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素6等的釋放［3-4］。cGAS-STING通路在機(jī)體抵抗病原體方面發(fā)揮了重要作用，也有研究表明該信號(hào)通路的紊亂參與了腫瘤、自身免疫性疾病和炎性疾病的發(fā)生［5-9］。本文就mtDNA、cGAS-STING通路與肺部炎性疾病之間的關(guān)系進(jìn)行綜述，回顧相關(guān)藥物研究的成果，為進(jìn)一步明確炎性疾病的發(fā)病機(jī)制，相應(yīng)靶向治療的策略提供參考資料。

1 mtDNA

1.1 mtDNA 激活免疫系統(tǒng)人mtDNA 的核苷酸序列于1981 年確定，它是一個(gè)16 569 bp 的雙鏈環(huán)狀分子，編碼37 個(gè)基因，能夠表達(dá)幾種參與氧化磷酸化的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。此外，近年來(lái)的研究表明，mtDNA 可以作為一種免疫刺激物在免疫應(yīng)答方面發(fā)揮重要作用。Collins 等［11］最早在2004 年報(bào)告了mtDNA 的免疫刺激潛力，將mtDNA 注射到小鼠關(guān)節(jié)中會(huì)引起關(guān)節(jié)炎，提示游離的mtDNA 可能作為免疫刺激物促進(jìn)炎癥的發(fā)生。目前認(rèn)為，mtDNA 主要通過(guò)3 種信號(hào)通路在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。（1）Toll 樣受體9（Toll-like receptor-9，TLR-9）：有學(xué)者認(rèn)為線粒體起源于20 多億年前的α-變形桿菌，因此也擁有類似于細(xì)菌DNA 未甲基化的CpG 序列，該序列能被TLR-9 識(shí)別并激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［12-15］。（2）cGAS-STING 通路：當(dāng)mtDNA 進(jìn)入胞質(zhì)，能夠被胞質(zhì)中的核酸感受器cGAS 識(shí)別，從而激活cGAS-STING 信號(hào)通路，引起I 型IFN 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［3］。（3）mtDNA 還可以激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，后者可導(dǎo)致procaspase-1 自剪切成活化形式，活化的caspase-1 可促進(jìn)IL-1β 和IL-18 的成熟和釋放，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)［16］。因此，當(dāng)mtDNA 作為一種自身免疫刺激物釋放到胞質(zhì)或循環(huán)后會(huì)激活多種信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子分泌，引起一系列免疫反應(yīng)。

1.2 mtDNA 的釋放機(jī)制任何存在于胞質(zhì)或循環(huán)中的自身DNA 都是一種潛在的免疫刺激物，可與多種PRRs 結(jié)合，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。其中，線粒體中的mtDNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)已成為cGAS-STING 途徑激活的重要觸發(fā)因素［17-18］。mtDNA 位于線粒體基質(zhì)中，必須穿越線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜兩層障礙才能到達(dá)細(xì)胞質(zhì)中［19］。

目前，許多研究顯示了線粒體外膜通透化（mito?chondrial outer membrane permeabilization，MOMP）與mtDNA 釋放之間的聯(lián)系。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和Bak受到凋亡刺激后，在線粒體外膜寡聚，誘導(dǎo)MOMP，并介導(dǎo)細(xì)胞色素C 的釋放及caspase 的激活，最終引起細(xì)胞凋亡［20］。利用多種顯微鏡技術(shù)觀察受到凋亡刺激的完整細(xì)胞的線粒體顯示，Bax和Bak蛋白激活和寡聚化后，線粒體外膜上這2種蛋白聚集的部位出現(xiàn)大孔，線粒體內(nèi)膜通過(guò)這些大孔擠入細(xì)胞質(zhì)中，形成線粒體疝，促使包括mtDNA 在內(nèi)的線粒體基質(zhì)內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)［21］。這一過(guò)程還涉及到擠入胞質(zhì)的線粒體內(nèi)膜通透性的改變。在凋亡刺激和抑制caspase 的條件下，MOMP 發(fā)生后不久，線粒體內(nèi)膜對(duì)小離子的通透性增加［22］。在不同的研究中線粒體內(nèi)膜通透性的變化程度不同［21-22］。關(guān)于線粒體內(nèi)膜如何通透，其通透過(guò)程是否受到調(diào)控，目前尚不清楚。值得注意的是，以往的研究認(rèn)為強(qiáng)烈的促凋亡刺激會(huì)導(dǎo)致MOMP 快速擴(kuò)散到細(xì)胞中的所有線粒體，這一過(guò)程是完全且同步的，被認(rèn)為是觸發(fā)細(xì)胞死亡不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵步驟［23］。但最近的研究使用一種新的成像技術(shù)顯示，在亞致死劑量的刺激下，MOMP 僅發(fā)生在有限數(shù)量的線粒體中，且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這一現(xiàn)象被稱為少數(shù)MOMP，會(huì)導(dǎo)致DNA 損傷和基因組不穩(wěn)定，并且可以介導(dǎo)促炎信號(hào)的傳導(dǎo)以抑制體內(nèi)多種病原體的生長(zhǎng)［24-25］。目前，少數(shù)MOMP 的生物學(xué)功能仍未知，部分線粒體被選中發(fā)生MOMP的潛在機(jī)制需要更深入的研究。

mtDNA 釋放的另一個(gè)潛在機(jī)制是通過(guò)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）［18，26］。親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CypD）被認(rèn)為對(duì)mPTP的形成至關(guān)重要，而環(huán)孢菌素A（cyclospo?rin A）是CypD 的抑制劑，能抑制線粒體膜通透性的改變，減少釋放到胞質(zhì)的mtDNA［18，26］。但與之相矛盾的是，有研究顯示誘導(dǎo)線粒體片段化及CypD 的缺失對(duì)MOMP誘導(dǎo)的mtDNA釋放沒(méi)有影響［27］。

mtDNA 在凋亡細(xì)胞中的釋放機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，但目前其在活細(xì)胞中的釋放機(jī)制并不統(tǒng)一。上文提到的少數(shù)MOMP是一種在活細(xì)胞中介導(dǎo)mtDNA釋放的可能機(jī)制［24］。另一種可能的機(jī)制是，氧化應(yīng)激的刺激，不足以激活Bak 和Bax 蛋白，但可引起電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion chan?nels，VDAC）的低聚，在線粒體外膜上形成大孔，介導(dǎo)mtDNA 片段的釋放［22，28］。 此外，mtDNA 能與VDAC1 的N 末端結(jié)構(gòu)域中帶正電荷的殘基相互作用，促進(jìn)VDAC1 的寡聚，形成前饋循環(huán)，進(jìn)一步增加mtDNA 的釋放［22］。另外，一項(xiàng)關(guān)于胃腸道嗜酸性粒細(xì)胞脫顆粒的研究顯示，在沒(méi)有細(xì)胞死亡的情況下，胃腸道嗜酸性粒細(xì)胞釋放mtDNA 而不是核DNA，這一過(guò)程可被活性氧生成抑制劑阻止，且通過(guò)延時(shí)自動(dòng)共聚焦成像（time-lapse automated confocal imaging）分析單細(xì)胞中DNA 釋放的動(dòng)力學(xué)后觀察到，mtDNA的釋放發(fā)生在1 s 內(nèi)，單個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞以彈射器樣的方式釋放mtDNA，但不同嗜酸性粒細(xì)胞的釋放時(shí)點(diǎn)有所不同［29］。不過(guò)，關(guān)于引起這種彈射釋放的能量是如何產(chǎn)生和存儲(chǔ)的仍有待進(jìn)一步研究。不同的是，在大量嗜酸性粒細(xì)胞群體中評(píng)估顯示，mtDNA 的釋放要慢得多，細(xì)胞外mtDNA 的水平持續(xù)上升長(zhǎng)達(dá)30～60 min［30］。造成這種差異的原因可能是其分泌具有的不同分子機(jī)制。

2 mtDNA與cGAS-STING通路

2.1 cGAS-STING 通路Sun 等［3］在2013年通過(guò)分離純化，鑒定了一種環(huán)化核苷酸合成酶（cGAS），并揭示了一種新型的免疫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，即cGASSTING 信號(hào)通路。cGAS 是一種位于胞質(zhì)的核酸感受器，能夠識(shí)別出現(xiàn)在胞質(zhì)中的各種來(lái)源的雙鏈DNA，與之結(jié)合形成二聚體，隨后cGAS 發(fā)生構(gòu)象變化，從而促進(jìn)ATP 和GTP 轉(zhuǎn)化為cGAMP。cGAMP 是一種第二信使，它與錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的STING 結(jié)合，誘導(dǎo)其C末端尾巴的構(gòu)象發(fā)生變化，構(gòu)象變化的STING從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，并能募集TANK 結(jié)合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1），使它和轉(zhuǎn)錄因子IFN調(diào)節(jié)因子3（IFN regulatory factor 3，IRF3）磷酸化，后者可入核促進(jìn)IFN 刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）的大量轉(zhuǎn)錄，從而引起I型IFN介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。另外，STING 還可以激活I(lǐng)κB 激酶，使IκB磷酸化，釋放NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，與IRF3 和其他轉(zhuǎn)錄因子一起發(fā)揮功能，誘導(dǎo)IFN 和炎性細(xì)胞因子如TNF、IL-1β和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)炎癥發(fā)生［31］。

2.2 mtDNA激活cGAS-STING信號(hào)通路多種致病因素導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)某些尚未闡明的機(jī)制使mtDNA 釋放到胞質(zhì)。胞質(zhì)mtDNA 作為cGAS 的配體激活STING 通路的作用在許多研究中已經(jīng)被證實(shí)［4，32］。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcrip?tion factor A，TFAM）在維護(hù)mtDNA 穩(wěn)定方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。 West 等［4］在TFAM雜合敲除（TFAM+/-）小鼠模型和皰疹病毒感染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中的研究顯示，TFAM敲除會(huì)導(dǎo)致mtDNA 包裝蛋白TFAM 丟失，引起細(xì)胞mtDNA應(yīng)激，mtDNA釋放到胞質(zhì)中激活cGAS-STING-TBK1-IRF3信號(hào)通路，上調(diào)ISGs的表達(dá)并增強(qiáng)I型IFN 對(duì)病毒感染的反應(yīng)。但Song 等［33］的研究結(jié)果與之相反，TFAM 蛋白水平的降低導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中mtDNA 拷貝數(shù)減少，并抑制牛分枝桿菌在骨髓基質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生I 型IFN。造成這種差異的原因并未闡明，可能是由于細(xì)胞類型和病原體不同。mtDNA 的胞質(zhì)異位以及隨后的cGAS-STING 激活是腎損傷和纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TFAM敲除小鼠中mtDNA 胞質(zhì)異位，促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β 和CCL2 水平升高并募集巨噬細(xì)胞，且STING 通路活化和NF-κB 水平升高，最終引起小鼠腎臟炎癥和纖維化；這種病理改變可以被STING 抑制劑所緩解［32］。肥胖癥會(huì)誘發(fā)mtDNA 釋放，從而觸發(fā)cGAS-STING 途徑的激活，導(dǎo)致脂肪組織中慢性無(wú)菌炎癥反應(yīng)的增加［34］。另外，如前文所述，細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后線粒體上形成Bak/Bax 孔，誘導(dǎo)MOMP，被認(rèn)為是釋放mtDNA 到胞質(zhì)的途徑，但值得注意的是，凋亡細(xì)胞通過(guò)Bak/Bax 孔同時(shí)釋放的細(xì)胞色素C 促進(jìn)了凋亡小體的形成和下游caspase-3和caspase-7 的激活，這會(huì)抑制mtDNA 介導(dǎo)的cGASSTING 途徑的IFN 反應(yīng)，從而減輕mtDNA 釋放引起的無(wú)菌性炎癥［35-36］。

3 mtDNA激活cGAS-STING通路與肺部炎性疾病

3.1 急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）與cGAS-STING 通路的激活目前ARDS的發(fā)病率和病死率仍然很高，其發(fā)病率占入住ICU 患者的10.4%，死亡率約為40%［37］。ARDS 病理特征主要為彌漫性肺泡損傷，從而導(dǎo)致肺泡內(nèi)液體滲出增加，清除減少，促進(jìn)肺水腫和透明膜形成，肺內(nèi)分流增加和通氣血流比例失調(diào)，最終導(dǎo)致頑固性低氧血癥［38］。目前認(rèn)為，失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ARDS進(jìn)展的中心環(huán)節(jié)。在治療方面，以支持治療為主的非藥物治療（包括通氣策略的改變、俯臥位通氣、體外膜氧合的應(yīng)用等）取得了一定的進(jìn)展，有效降低了ARDS 患者的病死率［39］；但相關(guān)藥物治療并未取得較為理想的進(jìn)展，究其根本，是由于ARDS 發(fā)生及發(fā)展的病理生理分子機(jī)制尚未完全明確，無(wú)相應(yīng)的靶向治療藥物。近年來(lái)，有研究關(guān)注到mtDNA與ARDS病理過(guò)程之間的關(guān)聯(lián)。

組織細(xì)胞損傷釋放mtDNA 被認(rèn)為是炎癥病理學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵因素。最近的研究表明，患者血清、血漿及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中mtDNA 含量升高與ARDS 發(fā)生率之間存在相關(guān)性［15，40］。一項(xiàng)臨床研究觀察到，ARDS 患者血清及BALF 中mtDNA 的水平較對(duì)照組均顯著升高，其水平高低與患者的預(yù)后相關(guān)，并且在ARDS 早期，BALF 中mtDNA 的升高遠(yuǎn)高于血清［15］。在多種病理狀態(tài)（如創(chuàng)傷、膿毒癥等）下，患者血清mtDNA 水平普遍升高，這可能是由于mtDNA 作為觸發(fā)炎癥發(fā)生和擴(kuò)大的啟動(dòng)分子，是多種疾病進(jìn)展的共同啟動(dòng)因子［41-42］。在臨床應(yīng)用中，血清mtDNA 這一指標(biāo)診斷ARDS的特異性并不高，并且僅有對(duì)炎癥損傷的提示作用。此外，BALF 中的mtDNA 水平對(duì)ARDS 的預(yù)測(cè)是否具有更高的敏感性，需要更多的臨床研究闡明。

另一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，當(dāng)把mtDNA 通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)輸入體內(nèi)時(shí)會(huì)引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）。在研究輸血相關(guān)ALI（transfusion-related ALI，TRALI）時(shí)，通過(guò)對(duì)血制品中的mtDNA DAMPs 進(jìn)行測(cè)定顯示，mtDNA 主要存在于堆積的紅細(xì)胞、新鮮冰凍血漿和血小板中，表明mtDNA 可能與TRALI 的發(fā)生有關(guān)［43］。那么輸血是否可以看作是將累積在血制品中的mtDNA 人為地輸入患者體內(nèi)？這一想法在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了驗(yàn)證。利用外源性mtDNA 刺激小鼠后，肺部大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡。此外，mtDNA 暴露會(huì)顯著增加肺損傷和水腫的程度［14］。Zhang 等［2］將mtDNA 注入小鼠血管后，引起了肺部及全身其他臟器的炎癥反應(yīng)，并在BALF 中測(cè)得中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，TNF-α 和IL-6含量升高。這提示mtDNA 作為一種自身免疫刺激物，激活了先天免疫反應(yīng)，刺激循環(huán)中的中性粒細(xì)胞趨化聚集至肺部，引起中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性器官損傷。另外，Kuck 等［44］將來(lái)源于大鼠肝臟的mtDNA 經(jīng)動(dòng)脈輸入大鼠體內(nèi)后，觀察到血管濾過(guò)系數(shù)顯著升高，最終導(dǎo)致ALI 的發(fā)生。進(jìn)一步研究表明，這一現(xiàn)象能被靶向mtDNA 的8-氧橋鳥嘌呤DNA糖基化酶1（8-oxoguanine DNA-glycosylase 1，Ogg1）所減弱。上述研究提示，mtDNA 可以使肺血管通透性增加，通過(guò)影響肺血管內(nèi)皮屏障的完整性，促進(jìn)ARDS的發(fā)生。但值得注意的是，該實(shí)驗(yàn)中經(jīng)動(dòng)脈注射的mtDNA 濃度比生理狀態(tài)高很多，這一濃度下所產(chǎn)生的效應(yīng)在生理狀態(tài)下是否能繼續(xù)發(fā)生，還需進(jìn)一步的研究。上述體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，mtDNA 可以激活先天免疫，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致器官損傷，這一過(guò)程與ARDS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

Wu等［14］的研究顯示，肺組織中細(xì)胞外的mtDNA可通過(guò)TLR-9、p38 MAPK 和NF-κB 途徑促進(jìn)NLRP3炎癥小體活化，介導(dǎo)急性炎癥和肺組織損傷。更深入的研究表明，利用脂多糖氣道霧化誘導(dǎo)小鼠發(fā)生ARDS，mtDNA 可以放大這種效應(yīng)，導(dǎo)致肺部滲出增加，在TLR-9基因敲除小鼠中，炎癥反應(yīng)的相關(guān)效應(yīng)被削弱［15］，提示mtDNA 可以通過(guò)TLR-9 發(fā)揮其免疫激活作用，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。目前，尚不明確cGASSTING通路在mtDNA介導(dǎo)ARDS中的機(jī)制，這也給后續(xù)的研究提供了一種新的方向，可以利用基因編輯技術(shù)，敲除或過(guò)表達(dá)動(dòng)物體內(nèi)cGAS-STING 通路上的相關(guān)基因，研究ARDS動(dòng)物模型中某種病理機(jī)制的改變或信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子和炎癥介質(zhì)的變化。

3.2 慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）與cGAS-STING 通路的激活COPD 是以不可逆的氣流受限為特征的一種氣道慢性炎性疾病［45］。長(zhǎng)期吸入香煙煙霧和顆粒物等能通過(guò)PPRs 激活先天免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織內(nèi)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量及黏液分泌增加［45］。暴露于香煙煙霧，在體外實(shí)驗(yàn)中會(huì)導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞死亡，并在細(xì)胞外環(huán)境中檢測(cè)到雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）和mtDNA 釋放增加，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)小鼠支氣管肺泡中dsDNA 和mtDNA 釋放［46］。另外，哮喘-COPD 重疊綜合征患者體內(nèi)mtDNA/核DNA比率增加，提示該疾病中也存在線粒體功能障礙［47］。但暴露于香煙煙霧這種造模方法具有操作時(shí)間長(zhǎng)、難度大、動(dòng)物模型不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。近來(lái)，研究人員采用滴鼻途徑給予香煙塵霧顆粒建立的小鼠COPD 模型，更為簡(jiǎn)便穩(wěn)定［48］。Nascimento 等［49］研究表明，在COPD 模型小鼠的BALF 中自身DNA 含量增加，中性粒細(xì)胞募集增多，同時(shí)伴隨著cGAS 和STING 的過(guò)表達(dá)。與野生型小鼠相比，分別敲除STING基因和cGAS基因的小鼠BALF 中dsDNA 含量顯著減少，下游趨化因子CXCL10 產(chǎn)生減少，肺部炎癥也相對(duì)較輕，而TLR-9基因敲除小鼠的上述指標(biāo)與野生型小鼠相似，提示暴露于香煙煙霧后釋放的自身DNA 被cGAS而不是TLR-9識(shí)別，進(jìn)而激活STING通路導(dǎo)致I型IFN 分泌增加，促進(jìn)肺部炎癥的發(fā)生。長(zhǎng)期吸入顆粒物如二氧化硅，是COPD 的另一大病因，也會(huì)導(dǎo)致慢性肺部炎癥，研究表明二氧化硅也依賴cGASSTING 途徑發(fā)揮誘導(dǎo)肺部炎癥的作用［50］。因此，香煙煙霧暴露與吸入顆粒物誘導(dǎo)的肺部炎癥均被證實(shí)能通過(guò)釋放自身DNA，依賴cGAS-STING途徑激活發(fā)揮促炎作用。目前尚缺少cGAS-STING 參與COPD病理生理的直接臨床證據(jù)。

3.3 支氣管哮喘與cGAS-STING 通路的激活支氣管哮喘是一種由多種免疫細(xì)胞參與的慢性氣道炎性疾病。研究表明，線粒體功能障礙與哮喘發(fā)生的病理生理機(jī)制有關(guān)。鼻病毒感染引發(fā)與中性粒細(xì)胞胞外網(wǎng)狀陷阱形成相關(guān)的dsDNA 釋放，促進(jìn)過(guò)敏性哮喘的進(jìn)展［51］。卵清蛋白是實(shí)驗(yàn)性過(guò)敏性哮喘的常見(jiàn)過(guò)敏原，能導(dǎo)致小鼠支氣管上皮細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)改變及功能障礙［52］。另外，暴露于豚草花粉提取物也能造成線粒體功能障礙，并加劇了抗原驅(qū)動(dòng)的過(guò)敏性氣道炎癥［53］。L-精氨酸的使用能減少支氣管上皮細(xì)胞DNA 片段化，恢復(fù)了支氣管上皮細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變，緩解了小鼠過(guò)敏性氣道炎癥中的氣道損傷［52］。臨床研究顯示，哮喘患者外周血中線粒體拷貝數(shù)顯著升高［54］，并且細(xì)胞外DNA 的水平高低與哮喘的嚴(yán)重程度有關(guān)［55］。這提示線粒體功能障礙可能導(dǎo)致mtDNA 釋放，通過(guò)某些機(jī)制促進(jìn)哮喘的發(fā)生。相關(guān)機(jī)制研究顯示，在卵清蛋白和塵螨誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中，氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)中dsDNA 的積累增加，并且氣道上皮細(xì)胞中cGAS的缺失顯著減少了氣道嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集及集落刺激因子的產(chǎn)生，減輕氣道高反應(yīng)性并緩解了氣道炎癥，但該研究并未確定STING蛋白在其中發(fā)揮的作用［56］。使用cGAS結(jié)合dsDNA 后產(chǎn)生的第二信使cGAMP 作為DNA 的替代刺激物，能加劇塵螨誘導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥，提示cGAMP 可能是過(guò)敏性哮喘的內(nèi)源性加重因素，TBK1抑制劑可改善這一病理過(guò)程［57］。以上研究表明，線粒體功能障礙和mtDNA 的累積與哮喘的發(fā)生存在關(guān)系，并且可能通過(guò)cGAS-STING 途徑發(fā)揮作用，但后續(xù)的損傷機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

4 cGAS-STING相關(guān)抑制劑及其應(yīng)用

4.1 與cGAS 相關(guān)的抑制劑cGAS 作為胞內(nèi)DNA感受器被持續(xù)激活可能導(dǎo)致炎性疾病，作為通路上的啟動(dòng)因子，抑制其激活可能成為這類疾病的潛在治療方法。抑制cGAS 激活的方式包括干擾DNA 與cGAS結(jié)合、干擾底物（ATP和GTP）與cGAS的結(jié)合以及通過(guò)對(duì)cGAS進(jìn)行翻譯后修飾改變其催化活性。

有許多化合物在藥理學(xué)上被證實(shí)能干擾DNA與cGAS 的結(jié)合?？汞懰帲╝ntimalarial drugs，AMDs）如羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）、喹吖因（quina?crine）等通過(guò)將其插入DNA-cGAS 界面上DNA 凹槽中，呈劑量依賴性地阻礙DNA與cGAS的相互結(jié)合并能替換已結(jié)合的DNA，從而抑制Ⅰ型IFN在THP-1細(xì)胞的表達(dá)［58］。在AMDs的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，An等［59］合成了幾種含6-氨基-2-甲氧基-9-氨基吖啶的新化合物，其中X6 具有最佳的水溶性和細(xì)胞滲透性，通過(guò)與兩個(gè)相鄰cGAS 單體上的DNA 結(jié)合位點(diǎn)相互作用，妨礙cGAS 與DNA 的結(jié)合。隨后以X6 和HCQ 分別干預(yù)Trex1（three prime repair exonuclease 1）?/?小鼠，結(jié)果顯示，與HCQ 相比，X6 治療的小鼠心肌中cGAMP 產(chǎn)生減少，ISGs表達(dá)顯著下降。在治療cGAS 介導(dǎo)的自身免疫性心肌炎方面，X6比HCQ 有著更出色的表現(xiàn)和更低的毒副作用；X6 還能降低來(lái)自系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中ISGs 的表達(dá)［59］。此外，通過(guò)液相色譜分析評(píng)估化合物對(duì)人cGAS 的抑制作用篩選出了蘇拉明（一種曾用于治療非洲錐蟲病和盤絲尾蟲病的帶負(fù)電的多磺酸萘醌鹽類化合物），可以作為DNA 模擬物，占據(jù)DNA 結(jié)合位點(diǎn)但不能激活cGAS，從而抑制2'，3'-cGAMP 的合成，降低了THP-1細(xì)胞中IFN-β的水平［60］。最近，Padilla-Salinas等［61］篩選出在體外靶向人cGAS的高親和力抑制劑CU-32和CU-76，分子對(duì)接分析表明，它們能插入DNA 結(jié)合表面Zn環(huán)附近的凹槽中，通過(guò)構(gòu)象變化抑制h-cGAS的二聚化，在人THP-1細(xì)胞中具有抑制活性。

針對(duì)cGAS 活性位點(diǎn)的小分子抑制劑能干擾底物（ATP 和GTP）與cGAS 的結(jié)合，從而抑制2'，3'-cGAMP 的產(chǎn)生。在超過(guò)1 000 種化合物的文庫(kù)中進(jìn)行基于質(zhì)譜的高通量篩選確定，對(duì)小鼠cGAS 有抑制作用的化合物RU.365及其苯并噻唑類似物RU.332通過(guò)占據(jù)cGAS的催化位點(diǎn)，降低cGAS對(duì)ATP和GTP的親和力，從而抑制2'，3'-cGAMP產(chǎn)生［62］。氯代化合物RU.521由于與Arg364和Tyr421的堆積作用疊加，在小鼠原代巨噬細(xì)胞中表現(xiàn)出了更好的抑制能力，降低了小鼠巨噬細(xì)胞中IFN-β1 的表達(dá)［62］。人和小鼠cGAS 在結(jié)構(gòu)上存在差異，RU.521 抑制h-cGAS 的能力存在爭(zhēng)議，但一項(xiàng)最新的研究顯示RU.521中在細(xì)胞水平對(duì)人源和鼠源cGAS 有相似的抑制能力［63-64］。利用基于化學(xué)發(fā)光分析ATP 濃度變化的高通量篩選確定了小分子化合物G150 是人cGAS 的特異性抑制劑，在人源的原代巨噬細(xì)胞中具有抑制活性［65］。有研究通過(guò)新型熒光偏振測(cè)定法確定了PF-06928215 作為人cGAS 的高親和力抑制劑，但在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中該化合物沒(méi)有抑制活性，其原因可能是該化合物的細(xì)胞滲透性差［66］。高分辨率X線晶體結(jié)構(gòu)顯示PF-06928215可與人cGAS 的活性位點(diǎn)結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，Zhao等［67］通過(guò)高分辨率X線晶體結(jié)構(gòu)模擬研究了cGAS與PF-06928215 相互作用的結(jié)合模型和關(guān)鍵氨基酸殘基，隨后利用熱漂移檢測(cè)技術(shù)篩選確定了與cGAS 活性位點(diǎn)結(jié)合的抑制劑——化合物S2/S3，但目前缺乏該化合物的體外和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

翻譯后修飾在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能方面十分重要。蛋白質(zhì)乙?；诎庖叻磻?yīng)在內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程中都起著重要作用。使cGAS 的關(guān)鍵位點(diǎn)Lys384、Lys394 或Lys494 乙?；梢种破浠钚?；阿司匹林作為乙?；w可增加cGAS 的乙?；⒁种芻GAS 的活性，從而抑制Trex1?/?小鼠和Aicardi-Goutières 綜合征患者細(xì)胞中DNA介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)［68］。

4.2 與STING蛋白相關(guān)的抑制劑STING蛋白作為cGAS-STING 通路上承上啟下的重要分子，其異常激活與多種自身免疫性疾病及炎性疾病密切相關(guān)，研究人員針對(duì)這一蛋白展開(kāi)了廣泛的藥物研究。棕櫚?；种苿?-溴棕櫚酰酸酯或STING蛋白N端Cys88和Cys91位點(diǎn)的突變能有效抑制STING蛋白在高爾基體中的棕櫚酰化；這種翻譯后修飾在STING蛋白激活下游通路產(chǎn)生I型IFN反應(yīng)中至關(guān)重要［69］。基于這一發(fā)現(xiàn)，研究人員開(kāi)發(fā)了靶向STING 蛋白Cys88 和Cys91位點(diǎn)以抑制蛋白棕櫚?；幕衔?。Haag等［70］進(jìn)行了基于小鼠細(xì)胞的化學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)兩種硝基呋喃衍生物C-178和C-176，能與STING蛋白Cys91之間形成共價(jià)鍵，抑制STING 蛋白的棕櫚?；?，進(jìn)而阻止STING蛋白組裝成多聚體復(fù)合物，阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)，抑制I型INF的產(chǎn)生；用C-176干預(yù)Trex1?/?小鼠，各種系統(tǒng)性炎癥明顯減輕且沒(méi)有中毒跡象。進(jìn)一步篩選確定了在人源細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)均具有良好抑制能力的化合物H-151。此外，內(nèi)源性硝基脂肪酸能與STING 蛋白Cys88 和Cys91 位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合以抑制該途徑的激活，并減少鼠源和人源細(xì)胞中I型IFN的釋放［71］。

另外，作用于STING 蛋白其他位點(diǎn)的化合物也被發(fā)現(xiàn)有抑制作用。從紫杉醇中分離出的環(huán)肽astin C 通過(guò)與2'，3'-cGAMP 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合STING 蛋白C 端的激活口袋而阻止IRF3 的募集，抑制cGAS-STING信號(hào)通路觸發(fā)的先天免疫反應(yīng)［72］。將astin C 應(yīng)用于Trex1?/?小鼠，其體內(nèi)的I 型IFN 水平顯著下降。此外，根據(jù)STING 蛋白的對(duì)稱性開(kāi)發(fā)了一種小分子的STING 蛋白拮抗劑Compound 18，它能占據(jù)cGAMP結(jié)合位點(diǎn)，在體外抑制STING通路的激活［73］。

cGAS-STING信號(hào)通路抑制劑的總結(jié)見(jiàn)表1。

表1 cGAS-STING信號(hào)通路抑制劑Table 1.Inhibitors of cGAS-STING signaling pathway

Table 1.(continued)

值得注意的是，抑制cGAS-STING 通路后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視減弱導(dǎo)致發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加以及抗病毒、抗細(xì)菌反應(yīng)減弱導(dǎo)致機(jī)體可能發(fā)生嚴(yán)重感染，這些風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)成為這類藥物臨床應(yīng)用的潛在障礙，也是在開(kāi)發(fā)藥物過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意的問(wèn)題。

5 展望

mtDNA釋放導(dǎo)致cGAS-STING信號(hào)通路的激活，與多種肺部炎性疾病的發(fā)生有關(guān)。在ARDS、COPD和哮喘的患者體內(nèi)均觀察到了血漿mtDNA 水平的升高。血漿mtDNA 水平可以幫助臨床醫(yī)生預(yù)測(cè)和識(shí)別可能發(fā)展為ARDS 的潛在患者，對(duì)其進(jìn)行更積極的早期醫(yī)療干預(yù)，但其預(yù)測(cè)能力以及與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系尚不明確。此外，在測(cè)定mtDNA 含量時(shí)，采用不同的標(biāo)本如血清、血漿及BALF時(shí)，與預(yù)后的關(guān)聯(lián)程度是否存在區(qū)別，這需要更深入的研究。在肺部炎性疾病的動(dòng)物模型中驗(yàn)證了敲除cGASSTING 信號(hào)通路上的相關(guān)基因可以減輕氣道炎癥反應(yīng)，提示肺部炎性疾病的發(fā)病機(jī)制與cGAS-STING 信號(hào)通路的激活相關(guān)，但目前研究未闡明mtDNA 是通過(guò)獨(dú)立結(jié)合cGAS 還是TLR-9，亦或是結(jié)合這2 種受體共同發(fā)揮免疫刺激作用。另外，靶向抑制cGASSTING 信號(hào)通路的藥物正處于臨床前研究階段，目前已有許多小分子抑制劑在體外和細(xì)胞研究中展現(xiàn)出生物學(xué)活性，并在自身免疫性疾病的動(dòng)物模型中展現(xiàn)出良好的療效，但對(duì)于肺部炎性疾病的作用需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究來(lái)驗(yàn)證，還需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其安全性。