歐陽(yáng)仁俊 綜述 楊曉紅 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，貴州 遵義 563000

骨骼受損后骨的修復(fù)與再生都涉及細(xì)胞因子、細(xì)胞內(nèi)外基質(zhì)的復(fù)雜整合[1]，骨質(zhì)缺損后伴有延遲愈合或不愈合，并發(fā)展為較大的骨缺損時(shí)，傳統(tǒng)的修復(fù)手段已不能很好的恢復(fù)這一缺損。近年來，外泌體的應(yīng)用越來越廣泛，若采用生物支架材料負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體可以更好的修復(fù)骨缺損，促進(jìn)骨的修復(fù)與再生，獲得更好的治療效果?，F(xiàn)就不同復(fù)合支架材料負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體應(yīng)用于骨組織再生的研究進(jìn)展予以綜述。

1 骨組織缺損與修復(fù)

骨是一種高度血管化的器官，骨骼系統(tǒng)受到外界刺激后作出一系列的反應(yīng)[2]。若骨質(zhì)缺損后伴有延遲愈合或不愈合，并發(fā)展為較大的骨缺損時(shí)，傳統(tǒng)的修復(fù)手段已不能很好的恢復(fù)這一缺損。自體骨移植物本質(zhì)上具有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性[3]，通常被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)[4]；但它的使用有許多限制，包括供體部位所提供的骨量不足、術(shù)后可能導(dǎo)致供體部位出現(xiàn)并發(fā)癥；受體部位相對(duì)較高且難以預(yù)測(cè)的自體吸收等。于是，異體骨移植成為另一種選擇，異體骨移植物依舊保持著骨傳導(dǎo)特性，并在一定程度上具有骨誘導(dǎo)性，但它可能成為疾病傳播的媒介或細(xì)菌感染的載體[5]。若采用諸如生物活性玻璃和陶瓷等材料代替缺損部位實(shí)現(xiàn)骨傳導(dǎo)，一定程度上能夠恢復(fù)骨結(jié)構(gòu)和功能，且成本較低，免疫原性小，安全便捷，但是普通生物材料往往缺乏骨誘導(dǎo)活性，對(duì)患者自身的骨沒有實(shí)質(zhì)性的促進(jìn)再生作用[2]。

相較于傳統(tǒng)的組織修復(fù)手段，基于細(xì)胞、分子水平的再生技術(shù)正在不斷改進(jìn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對(duì)組織的修復(fù)作用表現(xiàn)在可以在體外誘導(dǎo)刺激分化為實(shí)質(zhì)細(xì)胞以替代受損部位，但其存在不可逾越的倫理學(xué)問題[6-7]，而MSCs的致瘤性、潛在的疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)和可能存在的免疫排斥反應(yīng)阻礙了它在骨組織再生中前進(jìn)的腳步。外泌體(exosomes，Exos)是細(xì)胞通過旁分泌作用產(chǎn)生的一種細(xì)胞外囊泡，在細(xì)胞間傳遞生物信號(hào)。Exos多為納米級(jí)，呈碟形，直徑為40～160 nm。Exos可以為膜蛋白提供天然的膜環(huán)境，有助于維持其穩(wěn)定性和生物活性，從而有助于提高膜蛋白治療劑的治療效率[8]。其次，Exos中包含著多種物質(zhì)，如RNA和蛋白質(zhì)[9]。它表達(dá)親代細(xì)胞類似的功能[10]又可作為納米載體傳遞活性因子或小分子物質(zhì)，在細(xì)胞的自分泌和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)中都起著重要作用。

2 支架材料負(fù)載外泌體

生物材料會(huì)影響相鄰細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，從而顯著加速組織再生，因?yàn)檫@些囊泡可以從患者的細(xì)胞中分離出來，避免了免疫原性對(duì)后續(xù)治療的影響，支架作為Exos和其攜帶生物因子的載體，在極大程度上影響著多種因子的活性。理想情況下，骨支架材料應(yīng)模仿天然骨細(xì)胞外基質(zhì)的特征和特性，為細(xì)胞黏附、遷移、增殖、成骨分化提供適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)支持和生化環(huán)境[4]。良好的支架材料本身應(yīng)具有(1)“匹配同稱”，具有良好的生物相容性，不引起機(jī)體免疫排斥和炎癥激惹；(2)“剛?cè)岵?jì)”，具有良好的可塑性與一定的機(jī)械強(qiáng)度，能為缺損部位的骨組織提供足夠支撐；(3)“四通八達(dá)”，具有三維多孔結(jié)構(gòu)、合適的孔徑大小與高孔隙率；(4)“無毒無害”，具有良好的生物可降解性，其降解產(chǎn)物無毒性，降解速率須與骨再生速率相匹配；(5)“平復(fù)如故”，具有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，恢復(fù)骨缺損部位的結(jié)構(gòu)和功能，能加速骨質(zhì)沉積、促進(jìn)骨的生長(zhǎng)；(6)“得天獨(dú)厚”，具有良好的界面微環(huán)境，能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖與分化；(7)“不拘一格”，來源不受限制，易獲得且易消毒。

Exos衍生療法由于其獨(dú)特的調(diào)節(jié)和治療特性以及非細(xì)胞參與而使并發(fā)癥最小化，其臨床轉(zhuǎn)化潛能顯而易見[11]，向患有牙周炎的小鼠體內(nèi)局部注射Exos可顯著減輕炎癥和修復(fù)牙槽骨破壞[12]。利用人臍帶沃頓氏膠來源的Exos可增強(qiáng)并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cell，BMSCs)的遷移和增殖以及軟骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)蛋白多糖和膠原蛋白(尤其是Ⅱ型膠原蛋白)的分泌，抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)[13]。

2.1 孔隙率對(duì)外泌體釋放的影響當(dāng)機(jī)械性能得到滿足時(shí)，使用高孔隙率值(超過90%)能獲得更好的效果，在對(duì)大鼠橈骨缺損模型的研究中[14]所采用的聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)外泌體復(fù)合支架，其微孔結(jié)構(gòu)孔徑約為250 μm，該結(jié)構(gòu)能夠很好的模擬骨小梁構(gòu)成，利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換以及新生血管的形成。魏松喬等[15]將絲素與殼聚糖以質(zhì)量比為5：5的比例混合制備支架，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)穩(wěn)定的多孔網(wǎng)狀，方便細(xì)胞的長(zhǎng)入和Exos發(fā)揮效能。支架表面孔隙率的高低和微觀納米形態(tài)直接影響細(xì)胞的功能[16]。骨再生過程需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生長(zhǎng)因子從外部持續(xù)流入支架的核心。介孔生物活性玻璃分級(jí)支架的微米級(jí)孔隙率為0.5～2 μm，能提供更高的比表面積為Exos負(fù)載提供保護(hù)，使冷凍干燥的Exos均勻分布在微孔的內(nèi)表面，并維持其球形顆粒結(jié)構(gòu)和生物活性[17]。CHEN等[18]發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎中軟骨細(xì)胞的線粒體損傷會(huì)影響ATP的合成，致使軟骨細(xì)胞的合成與代謝均受影響。將間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體(mesenchymal stem cells exosomes，MSCs-Exos)與脫細(xì)胞軟骨和甲基丙烯酸明膠水凝膠復(fù)合成生物墨水，通過桌面立體光刻技術(shù)進(jìn)行高分辨率光交聯(lián)生物材料打印，該復(fù)合支架中的Exos可以通過補(bǔ)充線粒體相關(guān)蛋白來修復(fù)退行性軟骨中的線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激損傷；支架則有效增強(qiáng)軟骨細(xì)胞遷移。

2.2 材料對(duì)外泌體釋放的影響Exos在復(fù)合支架中如何長(zhǎng)效保存及釋放也是值得研究的熱點(diǎn)問題，Exos起源于細(xì)胞的多泡分裂，雖具有很高的治療潛力但隨著時(shí)間的推移，Exos在缺陷部位的生物活性和穩(wěn)定性也會(huì)發(fā)生改變[19]。與Exos的全身給藥不同，Exos的局部釋放能夠帶來更好的治療效果，Mohammadi[20]表示MSCs-Exos受控釋放時(shí)可以有效預(yù)防或延遲宿主對(duì)植入物的排斥反應(yīng)?，F(xiàn)有研究證實(shí)光敏水凝膠——明膠甲基丙烯酰(Gelatin methacryloyl，GM)水凝膠具有水合3D微環(huán)境以及支持細(xì)胞黏附的能力，可有效結(jié)合和改善生物活性因子并穩(wěn)定其局部濃度，利用甲基丙烯酰明膠(Gelatin methacryloyl，GelMA)-納米黏土鋰皂石(laponite，LAP)GelMA-LAP水凝膠作為一種新的骨修復(fù)策略來改善Exos的局部保留和控制遞送[21]，同時(shí)水凝膠中的鋰皂石可以幫助延緩Exos的釋放。若將硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，OCS)引入GM水凝膠中，GM-OCS水凝膠的雙重網(wǎng)絡(luò)框架可確保Exos的持續(xù)釋放，其抗炎作用還可以改善局部微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的合成代謝[22]。水凝膠應(yīng)用于Exos緩釋主要是在非承重區(qū)域，羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)具有與天然骨礦物質(zhì)相似的物理結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是與水凝膠結(jié)合形成骨修復(fù)復(fù)合支架的理想材料。YANG等[23]將HAP與透明質(zhì)酸-海藻酸鹽水凝膠系統(tǒng)相結(jié)合，可在大鼠骨缺損處持久保留Exos并實(shí)現(xiàn)受控Exos遞送和一定的力學(xué)支持。Exos修飾為水凝膠的常用方法是直接混合，其可能存在負(fù)載效率低、外泌體結(jié)構(gòu)破壞、阻礙外泌體成骨潛力等缺點(diǎn)。為了克服這些限制，由兩條或更多肽鏈組成的多功能融合肽在藥物遞送方面表現(xiàn)出優(yōu)異的能力[24]。融合肽可以增強(qiáng)Exos的保留和穩(wěn)定性，由小腸黏膜下層和BMSCs-Exos組成的可注射熱敏水凝膠，結(jié)合帶有兒茶酚基團(tuán)的丙酸改善其力學(xué)性能。丙酸使水凝膠變得更加致密，三級(jí)結(jié)構(gòu)被整合，兒茶酚基團(tuán)可以與水凝膠中的膠原分子相互作用，在膠原分子之間形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步增強(qiáng)水凝膠的力學(xué)性能。LI等[25]將外泌體固定于肽修飾的黏合水凝膠上并局部植入，以此實(shí)現(xiàn)外泌體的有效保留、釋放和整合。聚乳酸-乙醇酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid，PLGA)作為一種可降解的生物共聚物，因其可調(diào)節(jié)的降解速率和安全地降解副產(chǎn)物而廣泛用于控釋系統(tǒng)。劉寧[26]通過提取軟骨細(xì)胞分泌的Exos聯(lián)合PLGA-HA梯度復(fù)合支架，對(duì)新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨損傷進(jìn)行修復(fù)。SUN等[27]開發(fā)了一種基于絲素蛋白的冷凍海綿，實(shí)現(xiàn)MSCs-Exos的長(zhǎng)期穩(wěn)定釋放并維持生物學(xué)活性，以及支架降解。外泌體被絲心蛋白鏈緊緊包裹，并保持了它們的膜完整性，使得外泌體的釋放完全依賴于酶促支架的降解。同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，Exos在未消化的海綿材料中可保留兩個(gè)月之久。SWANSON等[28]將源自人牙髓干細(xì)胞的外泌體(human dental pulp stem cells exosomes，hDPSCs-Exos)利用微流體裝置封裝在聚乳酸-乙醇酸共聚物結(jié)合聚乙二醇(poly ethylene glycol，PEG)所形成的三嵌段微球中，并使用聚多巴胺(polydopamine，pDA)進(jìn)行表面改性以修復(fù)小鼠顱骨缺損，hDPSCs-Exos可將內(nèi)源性細(xì)胞募集到缺損處并促進(jìn)它們的分化，刺激缺損部位骨組織再生。pDA改性后的PLGA支架可以更好的黏附、攜帶和保留Exos，使Exos可以局部緩慢釋放[29]。不同的材料憑借其自身特性影響外泌體作用的效能，選用合適的負(fù)載材料可以進(jìn)一步增強(qiáng)外泌體在骨組織缺損上的治療效果。

3 支架材料應(yīng)用于骨組織缺損

3.1 凝膠材料在復(fù)合支架中的應(yīng)用游離在體液中的Exos容易被宿主細(xì)胞吞噬而無法發(fā)生效應(yīng)[30]，這會(huì)限制Exos本身的作用，采用諸如透明質(zhì)酸、殼聚糖和聚乙二醇這類生物醫(yī)學(xué)水凝膠則可以在一定程度上解決這一問題，水凝膠憑借其優(yōu)越的生物相容性、生物降解性、封裝能力和三維多孔結(jié)構(gòu)得到廣泛應(yīng)用。透明質(zhì)酸鈉保濕能力卓絕，在組織損傷和組織修復(fù)方面發(fā)揮著重要作用。透明質(zhì)酸水凝膠可起到了良好的載體作用，將臍帶來源的Exos封裝于水凝膠內(nèi)，并植入缺損部位，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成[31]；將牙髓干細(xì)胞來源的Exos負(fù)載于殼聚糖水凝膠中并局部注射至小鼠體內(nèi)，則可緩解其牙周炎的快速進(jìn)展[32]；使用水凝膠材料搭載脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(adipose-derived mesenchymal stem cells exosomes，AMSCs-Exos)可促進(jìn)骨再生[33]并獲得更好的治療效果[34]。明膠水凝膠和纖維蛋白交聯(lián)改性后可獲得良好的三維空間結(jié)構(gòu)，以此延長(zhǎng)Exos作用的時(shí)間，更好地促進(jìn)牙髓細(xì)胞的組織再生[35]。可注射黏附性多功能多糖基敷料[36]以溫敏性、可注射性、自愈性和黏附性的多糖基水凝膠支架作為基礎(chǔ)，負(fù)載AMSCs-Exos，能促進(jìn)細(xì)胞快速增殖、肉芽組織形成、膠原沉積、重塑和再上皮化。源自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的MSCs所分泌的Exos可以促進(jìn)卵巢切除術(shù)后大鼠顱骨缺損處的骨再生和血管生成，其對(duì)骨增殖的促進(jìn)效果隨著Exos濃度的增加而增加[37]。殼聚糖-明膠-硫酸軟骨素冷凍凝膠支架[38]中殼聚糖是糖胺聚糖的類似物，已被證明可促進(jìn)人類軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，而明膠作為水解膠原蛋白，可幫助細(xì)胞附著。兩者均可以自凝膠化，進(jìn)一步增強(qiáng)支架穩(wěn)定性。

3.2 聚己內(nèi)酯在復(fù)合支架中的應(yīng)用聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)是一種具有良好生物相容性和降解性的高分子有機(jī)聚合物，在組織缺損修復(fù)中可作為良好的支撐材料，具有出色的韌性和機(jī)械強(qiáng)度[39]。負(fù)載阿司匹林的脂質(zhì)體與骨形成肽-1組合后并結(jié)合在PCL支架上，可以刺激MSCs的成骨分化，還可以協(xié)同促進(jìn)新骨的形成[40]。若將PCL與Exos結(jié)合使用，會(huì)帶來更好的修復(fù)效果，通過結(jié)合S-亞硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione，GSNO)和MSCs-Exos[41]，構(gòu)建具有免疫調(diào)節(jié)潛力的PCL支架，可顯著減輕巨噬細(xì)胞刺激的炎癥并在一定程度上加速了MSCs的成骨分化。但PCL支架相對(duì)生物惰性，導(dǎo)致治療效果不理想；濃度為2.5 μg/mL的銀納米顆?？赏ㄟ^自噬調(diào)節(jié)增加MSCs的成骨分化和礦化[42]，銀納米顆粒的膠原蛋白支架可以促進(jìn)骨再生并誘導(dǎo)體內(nèi)骨折間隙的早期閉合[43]，低劑量的銀納米顆粒結(jié)合PCL支架可以增強(qiáng)BMSCs的成骨分化。

3.3 鈦合金材料在復(fù)合支架中的應(yīng)用鈦及鈦合金[44]憑借自身良好的生物相容性和機(jī)械性能，在臨床種植材料中脫穎而出，成為應(yīng)用最廣泛的硬組織支架之一[45]。將透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉凝膠分別制備成水凝膠負(fù)載Exos，并配合高強(qiáng)度的鈦合金材料以修復(fù)骨缺損可以取得良好的效果[46]，用骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)刺激巨噬細(xì)胞后獲得外泌體與單尺寸的鈦納米管進(jìn)行整合，與骨質(zhì)疏松患者的BMSCs共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，該BMSCs的堿性磷酸酶和BMP2的表達(dá)顯著增強(qiáng)，可有效促進(jìn)BMSCs的成骨能力[47]。通過支架負(fù)載Exos以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖和遷移。先前許多的體外和體內(nèi)研究表明，鈦合金可以促進(jìn)成骨和骨整合[48]，且具有更高的彈性模量和生物惰性，但單純使用鈦合金作為植入物可能會(huì)導(dǎo)致應(yīng)力屏蔽和骨植入物界面效應(yīng)，導(dǎo)致骨吸收和纖維組織包封。有研究指出，Exos與多孔鈦合金結(jié)合可以有效提高鈦合金支架在骨修復(fù)中的功效[49]。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展，可以制備具有精確空間構(gòu)型的多孔鈦(porous Ti，pTi)合金。一方面，植入物可以與缺損部位完美匹配。另一方面，合適的多孔結(jié)構(gòu)可以有效促進(jìn)骨組織向內(nèi)生長(zhǎng)，從而增加植入物的骨結(jié)合。最重要的是，多孔結(jié)構(gòu)可以有效降低鈦基合金的彈性模量，減少應(yīng)力屏蔽。WU等[49]使用(710±42)mm的大孔徑和(68±5.3)%的孔隙率來促進(jìn)體內(nèi)成骨和骨整合，用鎂和羥基磷灰石對(duì)鈦合金進(jìn)行表面改性可有效提高鈦合金的生物活性。將雪旺細(xì)胞衍生的外泌體均勻摻雜到人工基底膜中，將此膜注入多孔pTi支架的孔隙中可以有效提高鈦合金的生物活性。

4 展望

Exos復(fù)合支架的應(yīng)用為骨組織修復(fù)和再生帶來新的啟示，其與組織損傷后相關(guān)的抗炎和促炎息息相關(guān)，然而，負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的復(fù)合支架材料其實(shí)際臨床應(yīng)用仍然存在許多障礙。例如，支架材料與Exos如何更好的結(jié)合，復(fù)合支架在體內(nèi)所處的環(huán)境如何影響Exos的效能，復(fù)合支架如何做到極速釋放或緩慢釋放，釋放量的可控性和釋放部位的選擇性都是亟待解決的問題，其次Exos修復(fù)和再生背后的分子機(jī)制尚未完全闡明，更值得深入探究。本課題組致力于頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤來源外泌體方面的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)頜骨來源的BMSCs具有更高增殖特性，通過對(duì)頜骨來源的BMSCs的miRNAs表達(dá)譜篩選、驗(yàn)證和miRNAs調(diào)控機(jī)制的探討，發(fā)現(xiàn)引起頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的miRNAs差異性表達(dá)的原因是關(guān)鍵免疫因子發(fā)生了改變，進(jìn)而導(dǎo)致了miRNAs前體的成熟，影響了miRNAs的差異性表達(dá)，另一方面，課題組發(fā)現(xiàn)Exos在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面具有促進(jìn)作用。課題組將在試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究負(fù)載頜骨來源的BMSCs-Exos支架材料的生物學(xué)性能及其表征，以及其對(duì)骨缺損的修復(fù)作用。總體而言，對(duì)生物材料負(fù)載Exos修復(fù)骨缺損的研究，將為再生醫(yī)學(xué)中的無細(xì)胞治療提供更多新思路和新見解。