胡慧艷，任婧楠，李曉，潘思軼，范剛

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院/環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種以記憶喪失和認(rèn)知功能障礙為特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病。目前AD的具體發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，但大量的研究表明，淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積、tau蛋白過度磷酸化、乙酰膽堿水平的降低、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、不穩(wěn)定代償功能和金屬失調(diào)可能在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1]，其中Aβ沉積、乙酰膽堿水平的降低、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)起到了關(guān)鍵性作用。

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的傳統(tǒng)藥物基于2種作用機(jī)制，包括非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑(美金剛胺)和膽堿酯酶抑制劑(鹽酸多奈哌齊、甘蘭坦胺和利瓦斯替胺)[2]。但是，市場上可用的這些藥物成本高，副作用多，并且通常無法阻止疾病的發(fā)展。因此，如何有效治療阿爾茲海默癥仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。

芳香療法在阿爾茲海默癥中的應(yīng)用已成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。佛手柑精油(bergamot essential oil,BEO)是最常見的精油之一，由揮發(fā)性芳香族萜烯和加氧衍生物如芳樟醇組成[3]，之前的研究證明其具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎的作用[4-5]，但是針對D-gal和AlCl3聯(lián)合誘導(dǎo)模型的研究較少，且攝入方式多為灌胃和腹腔注射的方式。本研究通過行為學(xué)和生化指標(biāo)的檢測來評估嗅聞BEO對D-gal和AlCl3引起的阿爾茲海默癥的影響，探討B(tài)EO在阿爾茲海默癥的治療中的作用機(jī)制，為芳香療法輔助治療阿爾茲海默癥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手柑精油，上海妙爾香精香料有限公司；D-半乳糖(D-galactose，D-gal)、三氯化鋁(AlCl3)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸多奈哌齊(Donepezil hydrochloride)，衛(wèi)材(中國)制藥有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、β淀粉樣蛋白(Aβ)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒，上海優(yōu)選生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Y-迷宮，北京眾實(shí)迪創(chuàng)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent6890N)，美國Agilent公司；SPME裝置(50/30 μmDVB/CAR/PDMS)，美國Supeleo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級4周齡的雄性昆明小鼠(KM)35只。實(shí)驗(yàn)動物和飼料購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為SCXK(鄂)2020-0019。自由飲水飲食，日光燈人工照明(照明時(shí)間：08:00-20:00)，溫度22±2 ℃。所有的實(shí)驗(yàn)都得到了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理號為202110240010)。

1.4 佛手柑精油成分定性分析

為了確定小鼠嗅聞佛手柑精油時(shí)的揮發(fā)性成分，采用固相微萃取的方法測定了佛手柑精油的成分組成[6]。運(yùn)用NIST05 與Wiley.7n 譜庫進(jìn)行檢索，利用C6～C20正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算出每種香氣物質(zhì)的保留指數(shù)，再結(jié)合文獻(xiàn)的保留指數(shù)進(jìn)行比對，確認(rèn)各個(gè)香氣物質(zhì)的化學(xué)組成。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀色譜與質(zhì)譜條件參考楊子玉[6]的方法。

1.5 AD的誘導(dǎo)

制備質(zhì)量濃度為24 g/LD-gal和 2 g/L AlCl3溶液。將上述溶液等體積混合后得到12 g/L的D-gal和1 g/L的AlCl3的混合溶液。小鼠連續(xù)49 d注射該混合溶液以誘導(dǎo)阿爾茲海默癥。

1.6 動物建模與分組

小鼠被隨機(jī)分為5組(n=7)。第1組(對照組,Con)：連續(xù)49 d接受生理鹽水腹腔注射。第2組(模型組,Mod)：腹腔注射D-gal(120 mg/(kg·d))和AlCl3(10 mg/(kg·d))，連續(xù)49 d。第3組(鹽酸多奈哌齊組,Don)：在腹腔注射D-gal和AlCl328 d后，每天喂服鹽酸多奈哌齊(2 mg/(kg·d))21 d。第4組( 1 h )和第5組( 2 h )：在腹腔注射D-gal和AlCl328 d后，分別嗅聞75% BEO 1 h和2 h，為期21 d。實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示。

1.7 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT)是用來確定小鼠在陌生環(huán)境中的行為活動以及它們對陌生環(huán)境的探索行為。該實(shí)驗(yàn)在一個(gè)敞箱(長70 cm、寬50 cm、高40 cm)中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程參考楊子玉[6]的方法，每只小鼠完成測試后，用10%的乙醇擦拭敞箱，晾干以備下次使用。

圖1 建立阿爾茲海默癥小鼠模型的實(shí)驗(yàn)方案和 BEO處理的實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental protocol for establishing a mousemodel of Alzheimer’s disease and drugadministration for BEO treatment

1.8 Y-迷宮實(shí)驗(yàn)

參考劉樹柏[7]的方法進(jìn)行Y-迷宮實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行了些許改動。Y-迷宮是一個(gè)等邊三角形區(qū)域。實(shí)驗(yàn)最初，關(guān)閉3號臂并將3號臂記為新異臂。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)小鼠被放置在1號臂，讓小鼠在迷宮中自由探索5 min。1 h后，3號臂被打開，讓小鼠從1號臂開始自由移動5 min。實(shí)驗(yàn)時(shí)記錄這5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入各個(gè)臂的順序和次數(shù)。自發(fā)交替行為是指在測試中連續(xù)進(jìn)入3個(gè)臂。自發(fā)交替行為的百分比(percentage of spontaneous alternation，SAP)計(jì)算公式如下：

每次測試后，用10%的乙醇仔細(xì)擦拭Y-迷宮。

1.9 血清和腦組織勻漿的制備

行為實(shí)驗(yàn)完成后，取眼球血并在4 ℃下以3 000 r/min離心2 min，分離出血清。此外，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即從死亡小鼠身上剝離出大腦。將大腦置于生理鹽水中，以去除血細(xì)胞，在濾紙上印跡，并在-80 ℃下冷凍。前額葉皮層和海馬結(jié)構(gòu)在冰上進(jìn)行解剖，并在液氮中冷凍。樣品保持在-80 ℃直到進(jìn)行檢測。

1.10 小鼠血清以及腦組織中生化指標(biāo)的檢測

按照所對應(yīng)的試劑盒說明書測定小鼠血清中MDA含量和SOD活性。

酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測小鼠腦組織小鼠大腦中Aβ、AchE、IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)各組樣本數(shù)為7，數(shù)值均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。柱狀圖使用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行分析與繪圖，分析時(shí)采用ANOVA單因素進(jìn)行方差分析，并采用多重檢驗(yàn)的方法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。使用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析，并采用Duncan’s法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手柑精油成分的測定結(jié)果

運(yùn)用GC-MS測定實(shí)驗(yàn)所用的佛手柑精油，檢測到29種香氣物質(zhì)。采用峰面積歸一化法進(jìn)行相對定量的計(jì)算，求得各個(gè)化合物在佛手柑精油中的相對含量，結(jié)果如表1所示。所鑒定出的29種成分,其中有13個(gè)烯烴類化合物，總相對含量為44.30%，為佛手柑精油的主要香氣成分；有7個(gè)酯類化合物，總相對含量為20.06%；有3個(gè)醇類化合物，總相對含量為9.19%；有4個(gè)醛類化合物，總相對含量為2.25%；1個(gè)酮類化合物，總相對含量為0.02%；其他1種占0.08%。由表1可知，該BEO的主要成分是萜烯類以及酯類、醇類、醛類、酮類等多種生理活性物質(zhì)，其中含量最高的是D-檸檬烯，占18.94%，可能它在改善D-gal和AlCl3導(dǎo)致的認(rèn)知障礙方面起了主要作用。

表1 佛手柑精油的化學(xué)成分及相對含量 Table 1 Chemical composition and relative percentage content of bergamot essential oil

2.2 BEO對D-gal和AlCl3誘發(fā)的OFT焦慮感的影響

在嗅聞佛手柑精油21 d后，對各組小鼠的焦慮行為進(jìn)行了評估。圖2顯示了OFT中小鼠焦慮行為的結(jié)果。與對照組相比，接受D-gal和AlCl3誘導(dǎo)處理的組在水平跨越格子數(shù)和直立次數(shù)上顯著減少(P<0.05)，表明接受D-gal和AlCl3處理的動物在OFT中有類似焦慮的行為。與模型組相比，嗅聞BEO 1 h處理組的水平跨越格子數(shù)和直立次數(shù)顯著增加 (P<0.05)，這表明BEO減弱了D-gal和AlCl3誘導(dǎo)的焦慮樣行為，提高了小鼠的活潑程度和好奇程度。另外，嗅聞1 h組和2 h組在直立次數(shù)具有顯著差異，說明在提高小鼠的好奇程度上，嗅聞1 h佛手柑精油比嗅聞2 h的效果更好。陽性對照組的水平跨越格子數(shù)和直立次數(shù)沒有顯著增加，可能是鹽酸多奈哌齊致惡心、煩躁不安的副作用[8]影響了小鼠的情緒。

2.3 BEO對D-gal和AlCl3引起的空間記憶損害的作用

如圖3所示，在Y-迷宮測試中各實(shí)驗(yàn)組自發(fā)交替百分比(圖3A)和進(jìn)入新臂的次數(shù)(圖3C)均顯著下降，其中模型組小鼠下降最多，下降幅度分別達(dá)到45%和36%。陽性對照組小鼠在連續(xù)21 d口服標(biāo)準(zhǔn)藥物的鹽酸多奈哌齊(2 mg/kg)后，自發(fā)交替百分比顯著上升42%，證明鹽酸多奈哌齊對該模型的認(rèn)知障礙具有改善作用。所有治療組之間的交替現(xiàn)象均有顯著提高，但1 h和2 h嗅聞組間無顯著性差異。與正常組相比，交替百分比最低的是模型組，最接近正常水平的是陽性對照組。結(jié)果見圖5。圖3B中各組小鼠總進(jìn)臂數(shù)無顯著差異。圖3C中模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)入新臂的次數(shù)顯著減少，但經(jīng)過嗅聞BEO 2 h后進(jìn)入新臂的次數(shù)得到了很大的改善。

差異性用“*”(P<0.05)和 “**”(P<0.01)表示。下同。Differences are indicated by “*” (P<0.05) and “**” (P<0.01). The same as below.

圖3 吸入 BEO(1 h和 2 h)對自發(fā)交替百分比(A)、總進(jìn)臂數(shù)(B)和進(jìn)入新臂的次數(shù)(C)的影響Fig.3 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) on the percentage of alternation (A) and onthe number of entry arms (B) and on the number of entries into the new arm (C) in the Y-maze task

2.4 嗅聞BEO對氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響

與對照組相比，腹腔注射D-gal和AlCl3導(dǎo)致MDA水平顯著增加(P<0.01)(圖4A)。與模型組相比，鹽酸多奈哌齊和精油嗅聞組的MDA水平分別下降18%、34%和44%(P<0.05)。

此外，與對照組相比，模型組小鼠腦組織中的SOD水平明顯下降(圖4B)。相反，與模型組相比，吸入佛手柑精油2 h后，小鼠腦組織中的SOD明顯增加。鹽酸多奈哌齊處理組和1 h嗅聞組與模型組兩兩相比均沒有明顯差異。

另外，我們還測試了小鼠海馬和皮層中的GPX(圖4C和4D)。經(jīng)過D-gal和AlCl3處理的小鼠海馬中GPX含量顯著下降，但是精油吸入處理未能起到明顯的改善作用。類似地，與對照組相比，小鼠皮層中的GPX含量也顯著下降。與海馬中GPX結(jié)果不同的是精油吸入1 h和2 h均能夠顯著提高GPX含量，分別提高了33%和17%。

圖4 吸入BEO(1 h和2 h)對D-gal和AlCl3處理的小鼠血清中的MDA(A)和SOD(B)水平及小鼠海馬(C)和皮層(D)中GPX的影響Fig.4 Effects of inhaling BEO (1 h and 2 h) on the levels of MDA (A) and SOD (B) in the serum and the levels of GPX in hippocampal (C) and cortex (D) of D-gal and AlCl3-treated mice

2.5 吸入精油對阿爾茲海默癥模型小鼠腦內(nèi)Aβ含量的影響

圖5顯示了各組小鼠腦組織Aβ含量的不同。與正常組相比，模型組小鼠海馬中Aβ含量顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組和嗅聞組中Aβ含量均顯著下降，其中2 h組最低，1 h組次之，最后是陽性對照組。這表明小鼠在嗅聞2 h佛手柑精油后降低Aβ沉積的效果最好。

2.6 吸入佛手柑精油對阿爾茲海默癥模型小鼠腦部炎癥因子的影響

表2顯示了小鼠海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。與對照組相比，D-gal和AlCl3顯著提高了海馬中的IL-1β、IL-6和TNF-α(P<0.05)水平，分別提高了83%、38%和71%。與模型組相比，1 h和2 h嗅聞均顯著降低了海馬中IL-1β和TNF-α (P<0.05)的水平，從而顯著降低了炎癥反應(yīng)，且吸入精油2 h顯示出更好的效果。

圖5 吸入BEO(1 h和2 h)對D-gal和AlCl3處理的小鼠腦部Aβ水平的影響Fig.5 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) onthe Aβ level in the D-gal and AlCl3 treated mice

表2 吸入BEO(1 h和2 h)對D-gal和AlCl3處理的小鼠腦部AchE水平的影響 Table 2 Effect of BEO inhalation (1 h and 2 h) on AchE levels in the brains of D-gal and AlCl3-treated mice 10-12 g/mL

2.7 吸入佛手柑精油對阿爾茲海默癥模型小鼠膽堿功能的影響

腦組織的生化分析顯示，與對照組相比，模型組海馬和皮層組織中的AchE活性顯著提高(P<0.01)(圖6)，而與模型組相比，精油處理顯著降低了皮層的AchE活性(1 h為P<0.01，2 h為P<0.01)，且精油處理2 h作用更為顯著。因此，吸入精油減少了D-gal和AlCl3給藥后產(chǎn)生的膽堿功能障礙，從而在Y型迷宮和曠場實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更大的促進(jìn)作用。

圖6 吸入BEO(1 h和2 h)對D-gal和AlCl3處理的小鼠海馬(A)和大腦皮層(B)中AchE水平的影響Fig.6 Effects of the inhaled BEO (1 h and 2 h) on the AchE level in hippocampus(A) and cortex(B) in the D-gal and AlCl3 treated mice

3 討 論

本研究檢測了小鼠在OFT和Y-迷宮中的表現(xiàn)，僅與對照組和實(shí)驗(yàn)組相比，模型組小鼠出現(xiàn)了探索能力和短期記憶指數(shù)下降等行為障礙。經(jīng)過D-gal和AlCl3處理后的小鼠腦中Aβ含量顯著升高，也證明了小鼠出現(xiàn)了阿爾茲海默癥的病理性癥狀。然而，在吸入BEO后，認(rèn)知功能顯著恢復(fù)，Aβ含量也有所降低。Rombolà等[9]也利用OFT和強(qiáng)迫游泳等實(shí)驗(yàn)證明了注射佛手柑精油可以減輕大鼠焦慮行為。這種整體影響可能歸因于其對神經(jīng)的保護(hù)能力。為進(jìn)一步探究BEO對AD小鼠神經(jīng)保護(hù)的機(jī)制，筆者進(jìn)行了有關(guān)氧化應(yīng)激和炎癥因子指標(biāo)的檢測。

酶抗氧化劑如過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)以及紅細(xì)胞狀態(tài)和血漿中總抗氧化水平的變化，可以作為患有AD患者大腦病理特性的指標(biāo)[10]。通過測量不同組血清和腦組織中MDA、SOD、GPX水平來確定不同組小鼠的體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。有研究表明長期注射D-gal會導(dǎo)致代謝紊亂，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的增加；鋁會誘導(dǎo)突觸囊泡和軸突線粒體周轉(zhuǎn)的減少，導(dǎo)致神經(jīng)元氧化產(chǎn)物的釋放[11]。在本研究中，模型組小鼠的MDA含量顯著上升，SOD和GPX含量顯著下降，從而表明腦組織內(nèi)自由基增加。然而，吸入佛手柑精油顯著降低了MDA含量，并提高了SOD和GPX的含量，使氧化應(yīng)激的程度降低。這一發(fā)現(xiàn)與另一項(xiàng)研究相一致，該研究表明口服長葉薄荷揮發(fā)油通過抗氧化(SOD，GSH)和抑制NO和脂質(zhì)過氧化水平，顯著改善了AlCl3導(dǎo)致的氧化應(yīng)激[12]。

由于AD的確切病因仍然難以捉摸，有越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)炎癥也參與了AD的發(fā)生。許多促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α，都是神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因素[13]。在目前的研究中，D-gal和AlCl3增加了海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，表明大腦區(qū)域存在嚴(yán)重的神經(jīng)炎癥情況。本研究結(jié)果與其他研究一致[1,14-16]，表明負(fù)責(zé)小鼠認(rèn)知的海馬在接受D-gal和AlCl3腹腔注射后受炎癥刺激影響。這也與BEO被發(fā)現(xiàn)可以通過抗氧化劑、抗炎劑和GABA調(diào)節(jié)的聯(lián)合作用來緩解AlCl3誘導(dǎo)的大鼠的焦慮行為相似[17]。

膽堿系統(tǒng)也在AD過程中起著重要的作用。AchE是催化膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)水解的酶，在與鋁相互作用時(shí)增強(qiáng)活性[18]，且Aβ對乙酰膽堿(acetylcholin，Ach)的合成和釋放有不利影響[19]，共同解釋了D-gal和AlCl3處理組AchE活性的升高。然而，吸入佛手柑精油抑制了AchE活性的升高，尤其是嗅聞2 h 組的抑制性更為顯著。大量研究證明了植物精油的AchE抑制活性。Tundis等[20]研究發(fā)現(xiàn)柑橘精油具有抗體外AchE活性。Sadiki等[21]研究發(fā)現(xiàn)吸入Tetraclinisarticulata精油能夠通過調(diào)節(jié)AchE的作用，改善Aβ42導(dǎo)致的記憶缺陷。因此，BEO能夠降低D-gal和AlCl3給藥后產(chǎn)生的膽堿功能缺陷，從而增強(qiáng)了Y-迷宮和OFT中的益智效應(yīng)。

上述結(jié)果證明了BEO具有抗炎等作用，從而在阿爾茲海默癥模型小鼠中發(fā)揮作用，但是BEO作為一種復(fù)雜的化合物，具體是哪種氣味物質(zhì)起到了作用還不明確。值得注意的是，檸檬烯的抗氧化和抗炎活性已被證明其對Aβ42毒性的保護(hù)作用至關(guān)重要[22-23]。Boiangiu等[24]發(fā)現(xiàn)檸檬烯能減少氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物如丙二醛(MDA)，以及增加超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶和谷胱甘肽(GSH)的含量，從而提高大鼠的認(rèn)知功能。另外，也有研究表明芳樟醇也對阿爾茲海默癥有積極作用。芳樟醇被認(rèn)為可以保護(hù)神經(jīng)元免受毒性和損傷，從而對阿爾茲海默癥有積極的治療作用。據(jù)報(bào)道，慢性芳樟醇可以減輕AD3xTg-AD三轉(zhuǎn)基因小鼠模型的記憶喪失和情緒損傷[25]。Caputo等[26]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芳樟醇可以通過抵消Aβ42低聚物誘導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的失調(diào)來緩解Aβ42的神經(jīng)毒性。因此，我們初步猜測是佛手柑精油中的檸檬烯和芳樟醇起到了積極作用，能提高認(rèn)知功能，改善D-gal和AlCl3模型小鼠的認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，嗅聞2 h后的阿爾茲海默癥小鼠表現(xiàn)出更好的神經(jīng)保護(hù)作用，達(dá)到了提高認(rèn)知能力和探索能力的作用，這可能是更長時(shí)間的嗅聞使得精油中的有效成分在腦中積累的更多，從而更能發(fā)揮出保護(hù)作用。分析表明佛手柑精油在吸入后是通過減少小鼠腦中Aβ的沉積，抑制氧化應(yīng)激、炎癥因子和膽堿酯酶水平來起到神經(jīng)保護(hù)的作用，從而使得小鼠在曠場實(shí)驗(yàn)和Y-迷宮實(shí)驗(yàn)中探索能力和認(rèn)知能力顯著增強(qiáng)。