呂 娟 呂珊妹 董學(xué)君

乳腺癌的發(fā)生率在女性惡性腫瘤中居首位，是女性癌癥死亡的主要原因[1]。盡管現(xiàn)有的篩查方法和治療手段已顯著改善了乳腺癌的預(yù)后，但仍有眾多患者死于耐藥和轉(zhuǎn)移[2]。因此，尋找乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和根源，確定新的治療靶點(diǎn)，尋求新的干預(yù)策略對(duì)于提高乳腺癌的療效和預(yù)后具有重要意義。巨噬細(xì)胞來(lái)源于血液循環(huán)系統(tǒng)中的單核細(xì)胞，在不同的環(huán)境或信號(hào)刺激下發(fā)生不同性質(zhì)的活化，產(chǎn)生兩種不同的類型，包括經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)和替代活化的巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)。腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)主要為M2型巨噬細(xì)胞，TAMs在乳腺癌組織中占間質(zhì)細(xì)胞的50%～80%，乳腺癌的不良預(yù)后與TAMs的浸潤(rùn)密切相關(guān)[3]。CD163常作為M2巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物。JMJD3(jumonji domain-containing protein 3)是含JmjC結(jié)構(gòu)域組蛋白去甲基化酶家族成員之一，它可以特征性地降低組蛋白H3K27me2(dimethylation of histone H3 lysine 27)和H3K27me3(trimethylation of histone H3 lysine 27)的甲基化水平，從而上調(diào)基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化、衰老、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生理活動(dòng)中有著重要的作用[4]。JMJD3在乳腺癌中的表達(dá)，以及JMJD3與M2型巨噬細(xì)胞之間的關(guān)系，目前報(bào)道較少。本研究收集了47例乳腺癌組織標(biāo)本，利用免疫組化法檢測(cè)了乳腺癌組織中JMJD3和CD163的表達(dá)，并分析了其與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，以豐富對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

對(duì)象與方法

1.病例資料:收集紹興市人民醫(yī)院2015年1月～2016年12月收治的乳腺癌術(shù)后癌組織和癌旁組織石蠟標(biāo)本47對(duì)，并收集相關(guān)臨床資料，所有標(biāo)本均經(jīng)知情同意，并經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核?；颊咝g(shù)前均未接受化療或放療。按照2012年WHO乳腺癌組織病理分級(jí)分類法對(duì)其進(jìn)行分組。所有標(biāo)本均經(jīng)紹興市人民醫(yī)院病理科確診。

2.主要試劑：anti-JMJD3兔抗人多克隆抗體(ab38113)、anti-CD163兔抗人單克隆抗體(ab182422)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

3.免疫組織化學(xué)染色:主要步驟如下：石蠟標(biāo)本經(jīng)切片、烤片、脫蠟和水化；封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；檸檬酸鈉溶液煮沸，進(jìn)行抗原修復(fù)暴露抗原決定簇；5%羊血清室溫30min，封閉非特異性蛋白；一抗37℃孵育2h；二抗孵育30min；DAB顯色3～10min；蘇木精復(fù)染1～2min；脫水，中性樹脂封片。

4.免疫組化結(jié)果判斷:JMJD3的陽(yáng)性信號(hào)為棕褐色顆粒狀，主要位于乳腺癌組織的細(xì)胞核內(nèi)。JMJD3結(jié)果判定：①依據(jù)標(biāo)本的染色程度：陰性0分，淡黃色1分，淺褐色2分，深褐色3分；②依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量：陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)在0～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩者相加，總分在1～3分為低表達(dá)組，4～7分為高表達(dá)組。CD163在組織切片中定位于巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜，胞質(zhì)也有著色，陽(yáng)性細(xì)胞呈巢狀分布于乳腺癌癌間質(zhì)，亦有呈星形散在浸潤(rùn)于乳腺癌癌巢。CD163結(jié)果判定：首先在低倍鏡下選取視野中巨噬細(xì)胞最密集的5個(gè)區(qū)域，在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)，最后取5個(gè)視野總和的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，JMJD3在乳腺癌中的表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，CD163在乳腺癌中的表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)，CD163與JMJD3之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.乳腺癌組織中JMJD3與CD163的表達(dá):JMJD3主要在乳腺癌組織中表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，在乳腺癌組織中呈棕褐色，在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，詳見圖1。CD163主要定位于乳腺癌組織間隙，呈巢狀分布，亦有星形散在浸潤(rùn)于乳腺癌癌巢組織，在乳腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)102.6±52.3，明顯高于癌旁組織29.7±9.6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，詳見圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)JMJD3和CD163在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況(免疫組化，×400)

2.JMJD3和CD163與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系：在乳腺癌組織中，JMJD3與乳腺癌的TNM分期呈正相關(guān)，TNM分期越高，JMJD3的表達(dá)量越高(P=0.012)；JMJD3表達(dá)量與雌激素受體(estrogen receptor, ER)(P=0.032)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)(P=0.005)表達(dá)有關(guān)，ER、PR表達(dá)陰性的患者，JMJD3的表達(dá)更高；JMJD3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者JMJD3表達(dá)更高(P=0.000)，詳見表1。在乳腺癌組織中，CD163的表達(dá)與TNM呈正相關(guān)(P=0.014)，與PR陰性表達(dá)有關(guān)(P=0.001)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.001)，詳見表1。

表1 乳腺癌組織JMJD3和CD163表達(dá)與腫瘤特征的關(guān)系

3.乳腺癌中JMJD3與CD163的相關(guān)性分析:采用Spearman相關(guān)性分析顯示，乳腺癌組織中JMJD3的表達(dá)與CD163的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.635，P=0.000)。

討 論

JMJD3在腫瘤中發(fā)揮抑癌或者致癌的雙重作用[4～6]。JMJD3在淋巴瘤、肝癌、腎癌、宮頸癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、抗凋亡及調(diào)控腫瘤微環(huán)境發(fā)揮促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用；在結(jié)腸癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平較低，能夠促進(jìn)干細(xì)胞的分化和細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用。在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，JMJD3可增加SNAI1的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲[7]。JMJD3在肺癌中表達(dá)顯著上升，并且在Ras激活的肺癌細(xì)胞中促進(jìn)TGF介導(dǎo)的Smad激活和EMT[8]。IFN/STAT1/JMJD3軸可誘導(dǎo)ZEB1的表達(dá)，并增強(qiáng)肺癌的侵襲能力[9]。利用JMJD3的抑制劑GSK-J1作用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，可使細(xì)胞增殖受抑制，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。JMJD3在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，并可激活NF-κB通路、上調(diào)BCL2表達(dá)而抗凋亡[11]。抑制JMJD3可減少腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤干細(xì)胞的分化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與乳腺癌的TNM分期、ER、PR及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)：TNM分期越高，JMJD3的表達(dá)越高；ER和PR表達(dá)陰性的患者，JMJD3的表達(dá)更高；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者乳腺癌組織中JMJD3的表達(dá)明顯升高，這些結(jié)果提示JMJD3的表達(dá)可能與乳腺癌的進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)。

乳腺癌的不良預(yù)后與TAMs的浸潤(rùn)密切相關(guān)。在一項(xiàng)納入4541例乳腺癌患者的Meta分析中發(fā)現(xiàn)，TAMs高密度浸潤(rùn)與乳腺癌患者低生存率有關(guān)[13]。

使用納米顆粒雙重抑制集落刺激因子1受體(CSF1R)和MAPK途徑可誘導(dǎo)TAMs向M1型極化，抑制乳腺腫瘤的生長(zhǎng)[14]；載有CSF1R和SHP2(src homology region 2 domain phosphatases-2)抑制劑的納米顆粒靶向M2型巨噬細(xì)胞，可將M2巨噬細(xì)胞復(fù)極化為M1表型，表現(xiàn)更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性和吞噬作用，在乳腺癌小鼠模型中顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤功效[15]。Chen等[16]利用質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞分泌的CHI3L1在體內(nèi)外均促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CD163是目前公認(rèn)的M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物之一，本研究在乳腺癌中檢測(cè)CD163的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD163在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與TNM分期、PR陰性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示乳腺癌組織中有大量的M2巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并且其表達(dá)可能與乳腺癌的不良預(yù)后有關(guān)。采用Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中JMJD3的表達(dá)與CD163的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，推測(cè)M2型巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)乳腺癌中JMJD3的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)展和不良預(yù)后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，JMJD3在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，CD163在乳腺癌間質(zhì)中表達(dá)明顯升高，兩者表達(dá)呈顯著的正相關(guān)，且兩者表達(dá)均與乳腺癌的TNM分期、PR陰性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。M2型巨噬細(xì)胞可能通過(guò)促進(jìn)乳腺癌中JMJD3的表達(dá)，調(diào)控乳腺癌的發(fā)展，導(dǎo)致乳腺癌的不良預(yù)后，具體機(jī)制有待于后續(xù)開展更深入的研究。