高玉青 王文成

（海陽(yáng)市果業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東海陽(yáng) 265100）

推廣優(yōu)良的無(wú)性系砧木是提高果樹(shù)良種化的重要途徑，不定根的發(fā)生作為植物無(wú)性繁殖的重要方式，具有繁殖系數(shù)高、周期較短、保持母株優(yōu)良性狀等諸多優(yōu)點(diǎn)，是集約化生產(chǎn)和實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要手段[1]。多數(shù)果樹(shù)不定根發(fā)生較為困難，因此深入探究果樹(shù)不定根發(fā)生機(jī)制，采取措施克服不定根發(fā)生困難的問(wèn)題，對(duì)于促進(jìn)優(yōu)良品種的快速繁殖，實(shí)現(xiàn)果樹(shù)產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效，具有重要的實(shí)踐意義。

不定根的形成是一種脅迫適應(yīng)機(jī)制，園藝植物的扦插、壓條等技術(shù)的應(yīng)用都依賴于不定根的正常形成。基因型、植物的生理狀態(tài)、激素水平、蛋白含量及外界環(huán)境刺激等因素都會(huì)影響不定根的形成和發(fā)育。近年來(lái)，對(duì)植物不定根發(fā)生發(fā)育調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究逐漸增多并成為研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究，對(duì)不定根發(fā)生過(guò)程形態(tài)學(xué)、生理生化等方面進(jìn)行綜述，以期為果樹(shù)無(wú)性繁殖提供一定的理論參考。

1 不定根發(fā)生的形態(tài)學(xué)研究進(jìn)展

形態(tài)學(xué)觀測(cè)是不定根發(fā)生研究的基礎(chǔ)，主要以不定根發(fā)生、生長(zhǎng)特征的解剖學(xué)觀察為主，目前主要從愈傷組織的發(fā)生發(fā)育、不定根原始體的產(chǎn)生和不定根生長(zhǎng)發(fā)育等方面展開(kāi)研究[2]。

不定根因發(fā)生時(shí)間和發(fā)生方式不同具有多樣性，按形成時(shí)間分為兩種發(fā)育類型，一是由潛伏根原基發(fā)育成的不定根，即潛伏生根型；二是由離體后需要外界條件誘導(dǎo)的根原基，即誘導(dǎo)生根型[3]。潛伏生根型的不定根由潛伏根原始體發(fā)育而來(lái)，在外植體莖中產(chǎn)生，一直處于休眠狀態(tài)，直到外界條件適宜后根原基才開(kāi)始發(fā)育，如毛白楊、垂柳等。潛伏根原始體發(fā)生的位置在不同物種之間存在著顯著的差異，且發(fā)生位置不確定。誘導(dǎo)生根型不定根由誘導(dǎo)根原始體發(fā)育而來(lái)，誘導(dǎo)根原始體需要外界環(huán)境的誘導(dǎo)才能產(chǎn)生，此類植物包括榛子、椴樹(shù)、板栗、海棠等。根據(jù)不定根在外植體上的發(fā)生方式不同分為兩類，從皮部形成的不定根稱為皮部根，從愈傷組織處形成的不定根稱為愈傷根[4]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，經(jīng)常根據(jù)皮部根和愈傷根所占的比例，將不定根劃分為三種類型，一是愈傷部位生根型，即大部分根為愈傷根，基本上不存在皮部根，愈傷部位生根型先在外植體傷口附近形成一層薄壁細(xì)胞，薄壁細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂分化一系列的細(xì)胞活動(dòng)形成愈傷組織[5]，如榛子、杉木、垂柳、板栗、梅等，此類植物較難生根。二是皮部生根型，即產(chǎn)生的不定根大多為皮部根，不存在愈傷根或者存在的愈傷根很少，其主要特點(diǎn)是根原始體在皮部和髓射線中產(chǎn)生，從皮孔上長(zhǎng)出不定根，生根速度快，生根面積大[6]，如側(cè)柏、圓柏、黃刺玫、紫杉（嫩枝扦插）、矮紫杉等。三是中間生根型，皮部根和愈傷根數(shù)量上無(wú)顯著差異，中間生根型的植物較其他兩種生根類型生根更容易[7]，如小葉楊、紫杉（硬枝扦插）、長(zhǎng)白落葉松、秤錘樹(shù)、紅皮云杉等。

2 不定根發(fā)生的生理學(xué)研究

2.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)不定根發(fā)生的影響

不定根發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中，外植體中的碳水化合物、氮素化合物是不定根形成的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是外植體在生根前維持自身代謝平衡的重要能源[8]。

碳水化合物中的可溶性糖和淀粉在不定根發(fā)生過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供所需要的碳源，為不定根發(fā)育提供能量，是不定根發(fā)生發(fā)育最主要的能量來(lái)源[8]?？扇苄蕴窃诓欢ǜ纬汕捌诖罅糠e累，在不定根起始期和伸長(zhǎng)期，外植體內(nèi)貯存的碳水化合物通過(guò)水解酶的活動(dòng)，被分解利用，為細(xì)胞分裂分化和不定根器官形成提供所必需的能量，橄欖、柚木、天竺葵等諸多試驗(yàn)也有類似現(xiàn)象。淀粉是植物細(xì)胞中碳水化合物最普遍的儲(chǔ)藏形式，所有的薄壁細(xì)胞都有淀粉粒存在。淀粉為不定根的形成提供能量和碳骨架，當(dāng)植物體內(nèi)的可溶性糖含量不足時(shí)，淀粉可以轉(zhuǎn)化為可溶性糖，是植物形成不定根過(guò)程中重要的能量來(lái)源之一。

氮素化合物中可溶性小分子蛋白與不定根發(fā)生密切相關(guān)，關(guān)系著根原始體的形成[9]。其中可溶性蛋白在不定根形成過(guò)程中代謝活躍，為不定根的形成提供充足的物質(zhì)。有研究表明，興安圓柏中可溶性小分子蛋白能夠激活與生根的相關(guān)基因[10]，此外在擬南芥、楸子樹(shù)中發(fā)現(xiàn)的可溶性小分子蛋白與細(xì)胞的分裂分化、愈傷組織的形成、根原基的誘導(dǎo)密切相關(guān)。

2.2 酶對(duì)不定根發(fā)生的影響

過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）是目前公認(rèn)的與不定根發(fā)生相關(guān)的重要的酶[11]。它們不僅參與植物體內(nèi)的生理代謝和生化反應(yīng)，而且在植物器官?gòu)念^再生中發(fā)揮著建設(shè)性的作用。

POD是植物體普遍存在的、活性高的一類酶，它與生長(zhǎng)素的氧化有密切關(guān)系[12]。在不定根形成過(guò)程中，它的活性不斷發(fā)生變化，POD含量的變化可以反映不定根發(fā)生時(shí)期植物體內(nèi)代謝變化。POD能促進(jìn)生根的另一原因是可以破壞抑制不定根發(fā)生物質(zhì)[13]。

PPO是一類金屬蛋白酶，它廣泛存在于植物體內(nèi)，能催化酚類物質(zhì)和IAA形成一種生根的輔助因子IAA-酚酸復(fù)合物[14]，與不定根的形成具有密切的聯(lián)系，可以促進(jìn)桉樹(shù)、光葉楮等難生根植物的外植體不定根的發(fā)生，在易生根植物的PPO的活性和含量比難生根植物高。通過(guò)前人對(duì)桉樹(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)PPO在外植體的根原基形成部位活性高，能催化生長(zhǎng)素的代謝，促進(jìn)不定根的發(fā)生與發(fā)育。

IAAO促進(jìn)不定根形成是由于它可以降解植物體內(nèi)IAA的水平，在易生根的植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IAAO活性高[15]。外植體內(nèi)的IAAO活性與愈傷組織有必然的聯(lián)系，IAAO可以作為判斷愈傷組織形成能力的指標(biāo)之一，一般情況下愈傷組織在激素誘導(dǎo)下會(huì)形成不定根。對(duì)榛子、馬尾松、光葉楮、刺槐等植物研究發(fā)現(xiàn)，在愈傷組織形成期和根原基誘導(dǎo)期IAAO的活性逐漸升高，在根原基形成時(shí)達(dá)到最大值，在不定根伸長(zhǎng)過(guò)程逐漸下降，因此通過(guò)IAAO含量的變化可以判斷不定根發(fā)育的時(shí)期。

2.3 激素調(diào)控對(duì)不定根發(fā)生的影響

影響不定根發(fā)生的激素主要包括生長(zhǎng)素（Aux）、細(xì)胞分裂素（CTK）、脫落酸（ABA）。其中生長(zhǎng)素在不定根發(fā)生過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。

生長(zhǎng)素中的吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）等是植物不定根誘導(dǎo)過(guò)程中是最常用的激素。扦插時(shí)，在枝條上保留一些正在生長(zhǎng)的芽或者幼葉，枝條基部會(huì)產(chǎn)生愈傷組織和不定根，這是由于芽和葉片中產(chǎn)生的生長(zhǎng)素通過(guò)極性運(yùn)輸累積到基部使插條產(chǎn)生不定根[16]，通過(guò)外施生長(zhǎng)素能使形成層薄壁細(xì)胞恢復(fù)分裂機(jī)能、刺激愈傷組織細(xì)胞的分裂與分化、誘導(dǎo)根原基的發(fā)生。生根率隨著生長(zhǎng)素濃度的升高而增加，但高濃度的生長(zhǎng)素對(duì)生根也有抑制作用。此外，生長(zhǎng)素還能顯著促進(jìn)植物維管組織的分化，促進(jìn)愈傷組織與莖的貫通。

細(xì)胞分裂素影響細(xì)胞的分裂擴(kuò)展、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、根端莖端分支等，還能加速根原始體薄壁細(xì)胞的快速分裂，進(jìn)而形成根原基，但細(xì)胞分裂素只有在與生長(zhǎng)素互相作用的前提下才能表現(xiàn)出來(lái)[17]，兩者的相互作用共同控制著愈傷組織向根或者芽的分化。對(duì)馬鈴薯、擬南芥等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中CTK/IAA比值高時(shí)，愈傷組織分化形成芽；當(dāng)CTK/IAA比值低時(shí)，愈傷組織分化形成根；如果外植體中的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素含量相當(dāng)，則愈傷組織不分化繼續(xù)保持生長(zhǎng)。所以，通過(guò)調(diào)節(jié)二者的比例，可誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生不定根[18]。在擬南芥中，根據(jù)細(xì)胞分裂素氧化酶使細(xì)胞分裂素失活原理，對(duì)細(xì)胞分裂素在根中的作用進(jìn)行反向研究，過(guò)表達(dá)的細(xì)胞分裂素氧化酶的植株根系發(fā)達(dá)、根系總長(zhǎng)度、初生根長(zhǎng)度、側(cè)生根和不定根數(shù)目增加，在細(xì)胞分裂素受體突變體中也有類似表現(xiàn)。

通常ABA含量的增加對(duì)不定根的發(fā)生有抑制作用[19]。在葡萄中ABA含量在根源誘導(dǎo)期含量最低，而在生根后含量會(huì)增加。插穗的枝齡越大，ABA含量越高，反之，ABA含量越小。因此，與硬枝扦插相比，嫩枝扦插更容易生根。研究發(fā)現(xiàn)，根原基誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)兩個(gè)階段中，ABA與表皮細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，能夠通過(guò)調(diào)整代謝網(wǎng)絡(luò)，使細(xì)胞程序性死亡從而調(diào)整不定根發(fā)生的速率。此外研究表明，在櫸樹(shù)中ABA通過(guò)與GA拮抗作用促進(jìn)不定根的發(fā)生[20]。

其它激素如乙烯、多胺、茉莉酸等對(duì)不定根的發(fā)生也有顯著作用。乙烯在根中與其它激素共同發(fā)揮作用，其中乙烯與生長(zhǎng)素之間的共同作用是不定根形態(tài)發(fā)育中的重要因素。乙烯還可誘導(dǎo)插枝不定根的形成，促進(jìn)根的生長(zhǎng)和分化，刺激根毛的大量發(fā)生[21]。多胺能調(diào)節(jié)植物的多種生理活動(dòng)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)形成層和維管組織的分化[22]，促進(jìn)不定根與枝條連接。

2.4 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)不定根發(fā)生的影響

不定根發(fā)生的信號(hào)傳導(dǎo)主要涉及激素信號(hào)傳導(dǎo)和第二信使信號(hào)傳導(dǎo)，信號(hào)傳導(dǎo)途徑通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)引起一系列生理生化反應(yīng)。

生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑是不定根發(fā)生作用中一條重要的途徑。生長(zhǎng)素對(duì)不定根的促進(jìn)作用屬于長(zhǎng)期效應(yīng)，外植體中的大部分基因處于抑制狀態(tài)，生長(zhǎng)素的作用就是通過(guò)外界的誘導(dǎo)，活化被抑制的基因，從而轉(zhuǎn)錄并翻譯出新的蛋白質(zhì)[23]。當(dāng)IAA與外植體薄壁細(xì)胞中的激素受體蛋白結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的Ca2+、IP3、cAMP等第二信使，并將信息轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，激活與不定根發(fā)生相關(guān)的基因。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白受體主要有生長(zhǎng)素/吲哚乙酸蛋白(Aux/IAAs)、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(ARFs)、SCFTIR1/AFBS復(fù)合體[24]。目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、煙草等植物中發(fā)現(xiàn)了Aux/IAA基因。Aux/IAA通過(guò)與ARF轉(zhuǎn)錄因子互作介導(dǎo)生長(zhǎng)素響應(yīng)，直接調(diào)控生長(zhǎng)素早期響應(yīng)基因的表達(dá)。擬南芥中29個(gè)AtAus/IAA大多數(shù)與側(cè)根或不定根的發(fā)育有關(guān)；水稻中31個(gè)OsIAA基因影響水稻不定根的形態(tài)和葉片的形態(tài)。SCFTIR1/AFBS復(fù)合體是多亞基泛素-蛋白連接酶E3的一種。SCFTIR1能夠解除Aux/IAA蛋白的阻遏，激活A(yù)RF蛋白。TIR1是一種生長(zhǎng)素受體，在擬南芥中生長(zhǎng)素促進(jìn)TIR1與Aux/IAA結(jié)合，隨后Aux/IAA蛋白被泛素化，逐漸降解。T1R1家族成員中的AFB1同樣也具有生長(zhǎng)素受體作用，但在擬南芥根中對(duì)2，4-D不反應(yīng)。

在植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素響應(yīng)因子主要分為兩類，一是以負(fù)反饋方式對(duì)細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行抑制，二是介導(dǎo)細(xì)胞分裂素相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄激活[25]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻中存在多個(gè)第二類調(diào)節(jié)因子RR基因，在不定根發(fā)育早期，RR2基因在根原基細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞分裂素對(duì)該基因的表達(dá)有誘導(dǎo)作用，且WOX11轉(zhuǎn)錄因子能夠在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)該基因進(jìn)行負(fù)調(diào)控。WOX11在水稻中通過(guò)反饋調(diào)控的方式對(duì)生長(zhǎng)素信號(hào)和細(xì)胞分裂素信號(hào)進(jìn)行整合，以確保水稻不定根的正常發(fā)育。

NO、Ca2+等作為第二信使對(duì)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸有重要作用。在黃瓜和萬(wàn)壽菊不定根誘導(dǎo)反應(yīng)中NO參與IAA信號(hào)傳導(dǎo)[26]，在不定根發(fā)生中，NO通過(guò)激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激活與生長(zhǎng)素相關(guān)基因，另外通過(guò)cGMP依賴途徑，NO直接調(diào)控不定根的發(fā)生。[Ca2+]cyt的時(shí)空變化影響生長(zhǎng)素和脫落酸ABA的生理作用，Ca2+作為第二信使，間接參與不定根發(fā)生的代謝通路。研究發(fā)現(xiàn)在外源激素中加入CaCl2會(huì)促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)和發(fā)育，阻斷Ca2+信號(hào)通道后不定根的發(fā)育受阻[27]。

3 展望

不定根的形成和發(fā)育是果樹(shù)重要的無(wú)性繁殖方式之一，越來(lái)越受到園藝工作者的重視。目前，對(duì)不定根發(fā)生意義的認(rèn)識(shí)已比較充分，對(duì)影響不定根形成的內(nèi)外因子也有較深入的了解，既有單個(gè)作用機(jī)理的研究，也有多種協(xié)同作用的探討。然而，不定根形成的機(jī)理和機(jī)制比較復(fù)雜，有些方面如各因子之間的相互協(xié)同作用、決定生根類型的基因等仍欠缺研究，未來(lái)對(duì)影響不定根形成的主導(dǎo)因素和機(jī)理需要做進(jìn)一步探討研究。