韓大勇，趙旭庭，周春寶，陳章言，倪黎剛

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場，江蘇 泰州 225300）

姜曲海豬是江蘇省的一個歷史悠久的優(yōu)良地方豬種，主產(chǎn)于江蘇省海安、泰州市姜堰區(qū)一帶，中心產(chǎn)區(qū)位于泰州、南通、揚州三市，而以姜埝、曲塘、海安鎮(zhèn)為主要集散地，因而得名。但姜曲海豬生長速度慢，瘦肉率低，自我國從國外引進(jìn)瘦肉型豬品種并廣泛推廣后，姜曲海豬種群數(shù)量逐年減少，目前在江蘇姜曲海種豬場存欄150 頭左右種豬，數(shù)量較少，已進(jìn)入國家地方品種資源保護(hù)名錄。線粒體是動物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是動物體細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)的重要載體，其分子量小，大小為16.5 kb 左右，呈共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有進(jìn)化速度快、遺傳上自主性及嚴(yán)格的母系遺傳等特性。研究表明線粒體DNA 的變異主要來源于突變，此特點對揭示動物群體的遺傳轉(zhuǎn)化關(guān)系比較準(zhǔn)確，在家畜種群分類、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、經(jīng)濟(jì)性狀的研究方面應(yīng)用廣泛。D-loop 為mtDNA的控制區(qū)，為非編碼區(qū)，是mtDNA 分子內(nèi)的高變區(qū)，進(jìn)化過程中，D-loop 的堿基替換率是mtDNA 分子的其他區(qū)域的5～10 倍，通過對mtDNA 的D-loop 區(qū)域序列的變異情況進(jìn)行檢測，分析該區(qū)域的堿基轉(zhuǎn)換、顛換、缺失、插入的情況，可以了解畜禽種內(nèi)和近緣種間親緣關(guān)系，同時分析種群的遺傳多樣性。

目前，有關(guān)姜曲海豬的線粒體DNA 的遺傳特性規(guī)律研究少見報導(dǎo)。本研究以江蘇姜曲海豬保種場保存的姜曲海豬核心種群豬只為主要對象，分析姜曲海豬保種群mtDNA D-loop 區(qū)多態(tài)位點的遺傳變異情況，評價姜曲海豬群體種質(zhì)資源特性及其遺傳多樣性，為姜曲海豬品種資源保護(hù)與開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

在江蘇姜曲海種豬場采集58 頭保種群姜曲海豬耳樣，超低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA 提取擴(kuò)增及測序

使用組織基因組DNA 抽提試劑盒（天根生化科技有限公司）提取的58 頭姜曲海豬基因組DNA。在NCBI 數(shù)據(jù)庫下載豬的線粒體序列（AJ002189），在待擴(kuò)增區(qū)域兩端選擇保守區(qū)，利用Primer5 軟件中設(shè)計如下引物：L99：5’-CCCAAAGCTGAAATTCTAA CTAAA-3’和H（451）：5’-GGTGAGATGGCCCTGAA GTAAG-3’，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR 反 應(yīng) 體 系：10 ×Buffer2.5 μL，dNTP （10 mmol·L）2 μL，上下游引物（ 10 μmol·L）各2 μL，Taq DNA 聚合酶0.21 μL，模板DNA100 ng，加雙蒸水至25 μL。

PCR 條件：95 ℃預(yù)變性5 min，33 個循環(huán)（每個循環(huán)包括94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s），72 ℃繼續(xù)延伸10 min，PCR 產(chǎn)物低溫保存，送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行經(jīng)回收、純化、測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR 軟件包中的Editseq 5.0 程序?qū)CR 擴(kuò)增序列測序結(jié)果進(jìn)行處理，然后利用Clustal（version:1.2.1）進(jìn)行比對，并將比對結(jié)果進(jìn)行手動校對，刪除序列間隙和兩端的不確定堿基。應(yīng)用DNASP 5.10 分析線粒體DNA 序列單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π），用MEGA6 軟件計算變異位點的確定及單倍型間的遺傳距離（p-距離模式）。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜曲海豬mtDNA D-loop 序列變異情況

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)1 條450 bp 左右的特異性條帶，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后測序，獲得了58 個樣本的擴(kuò)增序列，去除引物序列及兩端測序可能不準(zhǔn)確區(qū)域，獲得的有效序列基因片段長度為427 bp （AJ002189 的第15 425～15 851 bp）。在姜曲海豬的mtDNA D-loop 高變區(qū)擴(kuò)增測序的有效序列基因片段中，堿基A+T 含量為63.2%，G+C 含量為36.8%，A+T 含量明顯高于G+C含量，與以前的研究報道線粒體控制區(qū)富含AT 的結(jié)論相一致。利用Clustal 軟件進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該檢測區(qū)段，58 個姜曲海豬在該區(qū)段得到3 種單倍型，3 個單倍型個體數(shù)相差不大，3 個單倍體中有15 個多態(tài)位點（表1），表明姜曲海豬保種群單倍型數(shù)量少，種群的遺傳多樣性不高；多態(tài)位點中有13 個單一性可變位點、2 個簡約性變異位點，多態(tài)性位點比例為3.51%；序列中轉(zhuǎn)換頻率較高，顛換發(fā)生的較少，序列中無堿基缺失和插入；其中有10 次T／C 轉(zhuǎn)換，3 次G／A 轉(zhuǎn)換、1 次A／T 顛換、1 次C／A 顛換，轉(zhuǎn)換和顛換之比為6.5∶1，顯示出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)換偏倚現(xiàn)象，這是動物mtDNA 的一個顯著特征。

表1 姜曲海豬mtDNAD-loop 區(qū)多態(tài)位點

2.2 種群遺傳多樣性

應(yīng)用DNASP 5.10 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸多態(tài)性分析，結(jié)果表明姜曲海豬58 個樣本單倍型數(shù)量為3，單倍型多樣度為0.686±0.018，核苷酸多樣度（π）為0.005 2±0.000 85。單倍型多樣性指數(shù)及核苷酸多樣性分析結(jié)果說明姜曲海豬種群遺傳多樣性較低。對姜曲海豬mtDNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行中性檢驗，Tajima’s D 值為-0.927 55，差異不顯著（P＞0.05），符合中性突變。

2.3 種內(nèi)遺傳距離

對樣本進(jìn)行基于kimura 雙參數(shù)的遺傳距離計算，由表2 看出，58 個個體的3 個單倍型之間的平均遺傳距離為0.003～0.005，其中單倍型H3 與其他2個單倍型之間的距離較大，而單倍型H1、H2 之間的距離比較小，總體分析，3 個單倍型之間的距離不大。

表2 姜曲海豬mtDNA D-loop 單倍型間遺傳距離

3 結(jié)論與討論

3.1 姜曲海豬線粒體DNA 控制區(qū)的序列變異

在58 個姜曲海豬個體的mtDNA D-loop 高變區(qū)427 bp 的比對序列中，共得到15 個變異位點和3種單倍型，多態(tài)性位點比例為3.51%。亐開興等研究表明云南保山豬19 個個體的mtDNA D-loop 高變區(qū)中發(fā)現(xiàn)8 個多態(tài)位點，多態(tài)位點比例為1.83%；而劉益平等研究表明蘇鐘豬21 個個體中發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點16 個，多態(tài)位點比例3.62%；彭紅元等研究表明陸川豬在74 個個體中檢測到7 個單倍體，共發(fā)現(xiàn)20 個變異位點。本研究中發(fā)現(xiàn)姜曲海豬的線粒體單倍型和多態(tài)位點相對較少，雖然3 個單倍體的個體數(shù)量基本均衡，但還是能反映出姜曲海保種群母系來源較少，群體多樣性較低的特征。DNA 序列中有轉(zhuǎn)換和顛換2 種形式的堿基替換，多數(shù)的研究結(jié)果認(rèn)為，線粒體基因組DNA 發(fā)生轉(zhuǎn)換的頻率要遠(yuǎn)高于顛換。本研究中，姜曲海豬線粒體DNA 序列發(fā)生13 次堿基轉(zhuǎn)換，2 次堿基顛換，轉(zhuǎn)換次數(shù)顯著高于顛換，這與其他物種有一致的結(jié)果。

3.2 姜曲海豬的遺傳多樣性

衡量一個品種（群體）mt DNA 變異程度的兩個重要指標(biāo)是單倍型多樣度（Hd）和核苷酸多樣度（Pi），單倍型多樣度是指樣本中隨機(jī)抽取到2 個不同單倍型的頻率、核苷酸多樣度是指給定群體內(nèi)隨機(jī)選取的mtDNA 序列間的平均每個位點的核苷酸差異數(shù)目。Hd 和Pi 值越大，群體的多態(tài)程度越高，其遺傳多樣性越豐富。本研究中，姜曲海豬的核苷酸多樣性指數(shù)和單倍型多樣性指數(shù)分別為0.005 2 和0.686，核苷酸多樣性指數(shù)較低，單倍型多樣性指數(shù)較高，分析其原因可能是受種群的數(shù)量對該豬遺傳多樣性的影響，雖然通過堿基突變積累了比較好的單倍型多態(tài)性，但對核苷酸序列的多樣化積累效果較少。因此姜曲海豬今后的保種工作的重點應(yīng)放在提高姜曲海群體核苷酸多樣性方面。

3.3 姜曲海豬群體內(nèi)3 個單倍型之間遺傳距離

利用線粒體D-loop 區(qū)進(jìn)行的分子遺傳距離分析是基于母系起源方面的，有別于其他技術(shù)方法計算出的遺傳距離。彭紅元等研究陸川豬種群內(nèi)遺傳距離在0.003～0.005 之間，各種群間的遺傳差異很?。欢∶档妊芯堪紫簇i各單倍型之間遺傳距離變化范圍在0.003～0.007，各個單倍型之間的距離總也不大。本研究從線粒體層面計算的姜曲海豬各單倍型之間的遺傳距離在0.003～0.005 之間，各單倍型之間的遺傳距離較小。分析產(chǎn)生這種結(jié)果的原因主要是姜曲海豬種群長期獨立在保種場內(nèi)進(jìn)行人工選擇和群內(nèi)繁殖，幾乎沒有與場外的交流，造成各單倍型之間的遺傳距離交小，遺傳多樣度不高。因此必須對姜曲海豬的保種方案進(jìn)行優(yōu)化和完善，提高保種群遺傳多樣性。

3.4 姜曲海豬的種質(zhì)資源保護(hù)

姜曲海長期保存在一個相對閉鎖的保種場，近交繁殖。但受保種經(jīng)費、技術(shù)等因素的影響，姜曲海種群數(shù)量較小，小群體繁殖所導(dǎo)致基因丟失和遺傳漂變，進(jìn)而造成姜曲海豬保種種群的遺傳多樣性較貧乏，種群的延續(xù)能力降低。因此姜曲海豬保種過程中，要加強(qiáng)姜曲海遺傳多樣性的研究，通過其他技術(shù)方法進(jìn)行主要性狀的遺傳標(biāo)記研究，建立種群的遺傳譜系，較準(zhǔn)確的進(jìn)行個體識別，在選種選配過程中，讓不同單倍體群間進(jìn)行配種，促進(jìn)種群間基因交流，提高種群遺傳多樣性。