趙 展，王曉婷，李 林，侯晟燦，霍治邦，張新成

（1.開(kāi)封市農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)工程技術(shù)中心·河南省高標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)田智能灌溉工程研究中心·開(kāi)封大學(xué)信息工程學(xué)院河南開(kāi)封 475004； 2.開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院 河南開(kāi)封 475004）

西瓜是我國(guó)重要的蔬菜型水果，因其品質(zhì)好、瓤質(zhì)細(xì)、抗病強(qiáng)等特點(diǎn)而深受消費(fèi)者和生產(chǎn)者的喜愛(ài)和信賴(lài)，具有很重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但在西瓜長(zhǎng)期育種過(guò)程中，由于育種目標(biāo)大多單一，使得西瓜種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越狹窄，進(jìn)而使西瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)等重要性狀在生產(chǎn)上均受到較大限制；且單一化的種質(zhì)資源也讓西瓜病害越來(lái)越嚴(yán)重，常給生產(chǎn)者帶來(lái)無(wú)法挽回的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，在西瓜遺傳育種過(guò)程中，利用現(xiàn)代育種技術(shù)和方法創(chuàng)新種質(zhì)資源，拓寬其遺傳基礎(chǔ)就顯得尤為重要。

目前，利用物理誘變方法和化學(xué)誘變方法對(duì)作物進(jìn)行誘變育種已成為選育新品種、創(chuàng)新種質(zhì)資源的有效手段?；瘜W(xué)誘變方法主要是利用化學(xué)誘變劑（如烷化劑、疊氮化物、堿基類(lèi)似物等）對(duì)植物進(jìn)行誘導(dǎo)變異，具有周期短、頻率高、范圍廣等特點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量突變體材料，這些材料直接或間接地應(yīng)用于新品種和新種質(zhì)資源的選育。甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methanesulfonste）是一種高效穩(wěn)定且應(yīng)用廣泛的化學(xué)誘變劑，在誘變過(guò)程中，能夠使DNA 分子發(fā)生較多點(diǎn)突變，染色體畸變減少，并通過(guò)置換其他分子中的氫原子使得一些堿基烷基化而誘導(dǎo)突變。大量研究結(jié)果表明，要獲得良好的誘變效果，必須要有適宜的誘變劑量（誘變劑量=誘變液濃度×處理時(shí)間），通常把誘變處理后50.00%植株存活的劑量即半致死劑量作為選擇依據(jù)。弭寶彬等研究發(fā)現(xiàn)EMS 誘變冬瓜種子時(shí)最佳的誘變條件為1.20%EMS 誘變12 h，此時(shí)冬瓜種子發(fā)芽率、成苗率分別為54.67%、51.83%，接近半致死劑量。黃東福等對(duì)農(nóng)作物EMS 的誘變條件進(jìn)行分析后表明大部分作物的EMS 誘變半致死劑量在1.00%以?xún)?nèi)，且處理時(shí)間集中在4～8 h 時(shí)，可以獲得較好的誘變效果。

以開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院的高代自交系石紅為研究材料，采用6 個(gè)處理濃度（0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%）和5 個(gè)處理時(shí)間（4、10、12、14、16 h）相互組合的方式，對(duì)西瓜種子進(jìn)行了EMS 誘變最佳條件的篩選，通過(guò)對(duì)誘變處理后種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行分析，獲得EMS誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為構(gòu)建西瓜突變體庫(kù)，創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，進(jìn)而深入研究西瓜的基因組和拓寬西瓜的遺傳背景奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試西瓜材料為高代自交系石紅，由開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院西瓜研究所提供。EMS 誘變劑（水劑）購(gòu)自Sigma 公司。試驗(yàn)于2020 年7 月26 日至8 月初在開(kāi)封大學(xué)信息工程學(xué)院農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 EMS 溶液的配制方法 EMS 誘變劑用pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液配制成0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的溶液。

1.2.2 EMS 的處理方法 西瓜種子誘變前設(shè)計(jì)2種種子處理方式：指甲刀切口和不切口。將切口和不切口的西瓜種子對(duì)EMS 的敏感性進(jìn)行測(cè)試：用0.40%和1.00%的EMS 溶液分別處理切口和不切口的西瓜種子各4 h 和10 h。每個(gè)處理用50 粒種子，3 次重復(fù)。

確定最佳的種子處理方式后，將試驗(yàn)設(shè)誘變濃度和誘變時(shí)間2 個(gè)因素，采用二因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法，因素1 為EMS 誘變濃度，設(shè)6 個(gè)濃度水平，即0.40%、1.00%、1.20%、1.40%、1.60%；因素2為誘變時(shí)間，設(shè)5 個(gè)誘變時(shí)間水平，即4、10、12、14、16 h。試驗(yàn)共30 個(gè)處理，3 次重復(fù)，每個(gè)處理用50粒種子。試驗(yàn)處理均以pH 7.0 的0.1 mol·L磷酸緩沖液處理作為對(duì)照，誘變結(jié)束后，用1.0 mol·L的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，接著用0.1 mol·L的硫代硫酸鈉溶液沖洗，再用蒸餾水清洗3 遍，將種子平鋪于濾紙上瀝水，后用紗布包好放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。

1.2.3 測(cè)定發(fā)芽率 分別統(tǒng)計(jì)7 d 后的種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率，篩選出EMS 溶液的半致死劑量，確定最佳的EMS 誘變濃度和時(shí)間。

發(fā)芽率=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%，相對(duì)發(fā)芽率=處理的實(shí)際發(fā)芽率/對(duì)應(yīng)CK 的實(shí)際發(fā)芽率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析作圖，使用IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件采用LSD 法分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS溶液對(duì)西瓜種子切口與不切口的影響

利用切口與不切口2 種處理方式對(duì)EMS 誘變西瓜種子的敏感性進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)（表1），0.40%的低濃度處理下，處理時(shí)間為4 h 時(shí)，與對(duì)照相比，切口與不切口2 種處理方式對(duì)西瓜種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率無(wú)影響，都是100%；但當(dāng)濃度為0.40%，處理時(shí)間為10 h 時(shí)，切口西瓜種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率都比對(duì)照顯著降低了4.00%，而不切口種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照相比無(wú)變化；當(dāng)誘變濃度為1.00%，處理時(shí)間為4 h時(shí)，2 種處理方式對(duì)西瓜種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率都無(wú)顯著變化；但當(dāng)濃度為1.00%，處理時(shí)間為10 h 時(shí)，種子切口的處理方式使西瓜種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率都分別比對(duì)照顯著下降了20.00%，而不切口的處理方式下西瓜種子的實(shí)際發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率僅下降了3.33%。由此可見(jiàn)，當(dāng)誘變濃度較低且誘變時(shí)間較短時(shí)，種子不管是切口還是不切口對(duì)EMS 誘變劑都不敏感；當(dāng)誘變濃度和誘變時(shí)間達(dá)到一定程度時(shí)，相同條件下，種子進(jìn)行切口處理能夠顯著提高西瓜種子對(duì)EMS 誘變劑的敏感性。

表1 不同種子處理方式對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2 誘變時(shí)間和誘變濃度對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2.1 誘變時(shí)間對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響 相同誘變濃度條件下，研究誘變時(shí)間對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響（表2）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘變濃度為0.40%時(shí)，誘變時(shí)間分別為4、10、12 h 的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而誘變時(shí)間為14 h 和16 h 時(shí)的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率分別比對(duì)照顯著降低了7.34%和11.78%；當(dāng)誘變濃度分別為1.00%、1.20%、1.40%、1.60%和2.00%時(shí)，誘變10、12、14、16 h 的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率均低于誘變4 h 的相對(duì)發(fā)芽率，且均達(dá)到了顯著水平。以上結(jié)果表明，誘變濃度和誘變時(shí)間對(duì)西瓜種子的發(fā)芽率都有較大影響，當(dāng)誘變濃度較低為0.40%時(shí)，誘變時(shí)間在短期內(nèi)對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響效果差異不明顯，但超過(guò)一定時(shí)間后有顯著的影響效果；當(dāng)誘變濃度≥1.00%時(shí)，誘變時(shí)間≥10 h 的影響效果均顯著低于誘變時(shí)間為4 h 的誘變效果。

表2 同一濃度下不同誘變時(shí)間對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響

2.2.2 誘變濃度對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響 相同誘變時(shí)間條件下，研究EMS 的誘變濃度對(duì)西瓜種子發(fā)芽率的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘變時(shí)間為4 h 時(shí)，誘變濃度為0.40%和1.00%的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照相比無(wú)顯著差異，而誘變濃度分別為1.20%、1.40%、1.60%和2.00%的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率均顯著低于對(duì)照（圖1）；當(dāng)誘變時(shí)間為10 h 和12 h 時(shí)，誘變濃度為0.40%的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照相比均無(wú)顯著變化，但1.00%～2.00%的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率都比對(duì)照低，且都達(dá)到了顯著水平（圖2、圖3）；誘變14 h 和16 h 時(shí)，誘變濃度0.40%～2.00%的西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率都顯著低于對(duì)照（圖4、圖5）。由此可見(jiàn)，誘變時(shí)間和誘變濃度協(xié)同影響EMS 的誘變效果，誘變時(shí)間一定時(shí)，誘變濃度越高西瓜種子的相對(duì)發(fā)芽率越低；與對(duì)照相比，誘變時(shí)間較短、誘變濃度較低時(shí)對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響不大，誘變濃度越高，影響越顯著；當(dāng)誘變時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，低濃度的誘變效果依然不顯著，但隨著誘變濃度的增大，影響效果越來(lái)越明顯，且均能夠達(dá)到顯著水平；當(dāng)誘變時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，即使誘變濃度較低，誘變效果也較顯著。

圖1 不同EMS 濃度誘變4 h 對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖2 不同EMS 濃度誘變10 h 對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖3 不同EMS 濃度誘變12 h 對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖4 不同EMS 濃度誘變14 h 對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

圖5 不同EMS 濃度誘變16 h 對(duì)西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率的影響

2.3 最佳誘變濃度和誘變時(shí)間的確定

最佳誘變劑量（包括誘變濃度和誘變時(shí)間）才能夠達(dá)到最佳的誘變效果。本試驗(yàn)利用6 個(gè)誘變濃度和5 個(gè)誘變時(shí)間共30 個(gè)組合對(duì)EMS 誘變西瓜種子的劑量效應(yīng)進(jìn)行了分析（表2 和圖1），當(dāng)誘變濃度為1.20%，誘變時(shí)間分別為12、14、16 h 時(shí)，西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率分別為50.38%、52.21%和51.97%；當(dāng)誘變濃度為1.40%，誘變時(shí)間分別為12、14、16 h 時(shí)，西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率分別為48.95%、49.97%和48.82%。由上述結(jié)果可知，當(dāng)誘變濃度為1.20%～1.40%、誘變時(shí)間為12～16 h 時(shí)，西瓜種子的相對(duì)發(fā)芽率能夠達(dá)到半致死劑量，以誘變濃度越低和誘變時(shí)間越短為最好的原則，獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%、誘變時(shí)間12 h。

3 討論和結(jié)論

最佳的誘變劑量是獲得最佳突變頻率，得到理想突變體的關(guān)鍵。而合適的誘變材料處理方式是降低誘變劑使用量和縮短誘變時(shí)間進(jìn)而獲得最佳誘變劑量的重要措施之一。康保珊等在利用EMS誘變瓠瓜種子的研究中發(fā)現(xiàn)，利用1.00% 的EMS誘變濃度誘變12 h，不開(kāi)殼種子的相對(duì)發(fā)芽率能夠達(dá)到99.20%，但開(kāi)殼種子的相對(duì)發(fā)芽率卻下降到了46.00%左右，對(duì)EMS 誘變的敏感性顯著提高。在其他葫蘆科作物中，甜瓜種子不切口且EMS 處理濃度在1.00%～3.00%之間的發(fā)芽率能夠達(dá)到97.00%以上。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)西瓜種子進(jìn)行不切口處理時(shí)，1.00%的誘變濃度下即使誘變時(shí)間達(dá)到10 h，種子相對(duì)發(fā)芽率依然能夠達(dá)到96.67%，而切口處理后該條件下的種子相對(duì)發(fā)芽率下降到了80.56%，與前人研究結(jié)論類(lèi)似，也進(jìn)一步說(shuō)明在進(jìn)行EMS 誘變處理中，可以通過(guò)種子切口或者開(kāi)殼的處理方式來(lái)提高種子對(duì)誘變劑的敏感性。

目前，關(guān)于是否存在低濃度、短時(shí)間的EMS 處理對(duì)植物種子或者幼苗有一定的促進(jìn)作用還沒(méi)有統(tǒng)一定論。李雪寶等研究表明低濃度的EMS 能夠促進(jìn)水稻種子的發(fā)芽勢(shì)及幼苗生長(zhǎng)發(fā)育。霍雅馨等在箭筈豌豆中發(fā)現(xiàn)EMS 的短時(shí)處理能夠促進(jìn)其幼苗生長(zhǎng)。康保珊等在瓠瓜中發(fā)現(xiàn)低濃度、短時(shí)間的EMS 誘變處理能夠促進(jìn)開(kāi)殼瓠瓜種子發(fā)芽率的提高。但王春語(yǔ)等在分析EMS 處理高粱種子的最佳誘變劑量中發(fā)現(xiàn)隨著EMS 誘變時(shí)間的增長(zhǎng)和EMS 誘變濃度的增加，高粱出苗率呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)?？椎屡嗟仍诿藁ㄖ幸舶l(fā)現(xiàn)EMS 對(duì)棉花種子的萌發(fā)有抑制作用，EMS 濃度越大，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)和活力的抑制作用越顯著。本試驗(yàn)中低濃度、短時(shí)間的EMS 處理后西瓜種子的相對(duì)發(fā)芽率與對(duì)照相比有所降低，但差異不顯著。此外，多數(shù)研究也表明，高濃度的EMS 處理短期內(nèi)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成無(wú)法完全修復(fù)的生理?yè)p傷，并抑制植株的生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)高濃度的EMS 條件下，即使誘變時(shí)間較短也能夠顯著降低西瓜種子的相對(duì)發(fā)芽率。

EMS 是一種高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，具有成本低、操作簡(jiǎn)單、點(diǎn)突變頻率高，而染色體畸變頻率低等特點(diǎn)，且EMS 誘變多為顯性，易于突變體篩選。目前，利用EMS 誘變來(lái)創(chuàng)新種質(zhì)資源已在不同作物育種中有了廣泛應(yīng)用，但在該過(guò)程中，篩選出最佳的誘變劑量是獲得最佳的誘變效果的前提。通常是以半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，一般以50%的種子相對(duì)發(fā)芽率作為半致死劑量的指標(biāo)。殷冬梅等以半致死劑量為選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定了2 個(gè)花生品種的最佳誘變組合，分別是中花5 號(hào)的0.90%誘變7 h 和1.20%誘變5 h，遠(yuǎn)雜9102 的0.60%誘變7 h和0.90%誘變7 h，不同品種最佳誘變組合不同?？椎屡嗟壤肊MS 誘變亞洲棉發(fā)現(xiàn)0.60%的EMS溶液處理8 h 時(shí)其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別為51.00%和18.84，該組合下的誘變效果最佳?？当Ｉ旱葘?duì)開(kāi)殼瓠瓜種子的24 個(gè)濃度/時(shí)間處理組合的研究中，發(fā)現(xiàn)1.00%～2.00%的EMS 誘變濃度為瓠瓜最適宜誘變濃度，在此濃度范圍內(nèi)，誘變8～12 h 可達(dá)到半致死劑量，提高濃度需要相應(yīng)縮短誘變時(shí)間。王學(xué)征等利用EMS 誘變西瓜種子發(fā)現(xiàn)1.80% 6 h 的組合、1.00% 9 h 的組合、1.40% 9 h 的組合和1.00%12 h 的組合發(fā)芽率均接近50%，并最終確定EMS 的最佳誘變條件為處理濃度1.00%且誘導(dǎo)時(shí)間9 h。本試驗(yàn)以半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)6個(gè)誘變濃度和5 個(gè)誘變時(shí)間共30 個(gè)誘變處理組合發(fā)現(xiàn)，EMS 誘變濃度為1.20%～1.40%，誘變時(shí)間達(dá)到12 h～16 h 的組合都能夠使西瓜種子相對(duì)發(fā)芽率達(dá)到50.00%左右，但以誘變濃度越低和誘變時(shí)間越短為原則獲得最佳的誘變組合為誘變濃度1.20%和誘變時(shí)間12 h。本試驗(yàn)結(jié)果與王學(xué)征等的試驗(yàn)結(jié)果相比誘變濃度增大，誘變時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)該問(wèn)題的原因可能是西瓜品種以及西瓜自身基因型的不同造成的。

大量研究已經(jīng)證實(shí)，最佳的EMS 誘變條件有利于獲得最佳的誘變效果，對(duì)于構(gòu)建突變體庫(kù)、篩選突變體材料有重要的作用。目前，關(guān)于西瓜EMS 誘變條件和誘變效果的研究相對(duì)較少，具體的誘變機(jī)制仍處于探究階段。本試驗(yàn)中利用誘變濃度和誘變時(shí)間的不同處理組合，篩選到了EMS 誘變西瓜種子的最佳誘變劑量，為西瓜突變體庫(kù)的構(gòu)建和突變體材料的篩選提供了基礎(chǔ)，但該條件下能否獲得滿(mǎn)意的變異率還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。