聶 蓉，李 雪，郜亞昆，2，劉國榮*，王成濤，孫寶國

（1 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京工商大學(xué) 北京 100048 2 天津市和平區(qū)市場監(jiān)督管理局 天津 300041）

乳酸菌細菌素是乳酸菌為適應(yīng)生長條件或環(huán)境變化，由核糖體合成后經(jīng)加工修飾的具有抑菌活性的蛋白質(zhì)或多肽[1]，因其可被人胃腸道蛋白酶降解，且具有無抗藥性、安全、無毒、無殘留等優(yōu)良特性，而成為益生菌活性代謝產(chǎn)物研究與開發(fā)的熱點[2]。受到培養(yǎng)條件、細菌生長期及自身調(diào)控系統(tǒng)的影響，乳酸菌細菌素的產(chǎn)生水平往往很低，嚴重制約了其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[3-5]。目前已工業(yè)化應(yīng)用的細菌素僅有乳酸鏈球菌素[6]（Nisin）和片球菌素[7]（Pediocin） PA-1。

目前可用于提高乳酸菌細菌素產(chǎn)量的方法有優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，高效表達合成相關(guān)基因，添加誘導(dǎo)物或施加環(huán)境條件刺激等[3]。采用發(fā)酵條件優(yōu)化來提高細菌素產(chǎn)量的效果有限，而且所使用的大部分培養(yǎng)基成本不夠經(jīng)濟；利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的乳酸菌細菌素異源表達系統(tǒng)[4-5]可能會出現(xiàn)細菌素活性低和安全性有待驗證等問題；添加誘導(dǎo)物或施加環(huán)境條件刺激可利用誘導(dǎo)調(diào)控和脅迫應(yīng)答提高細菌素產(chǎn)量，不涉及安全性問題且成本低廉，被認為是最有應(yīng)用前景的技術(shù)手段[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加外源特定微生物共培養(yǎng)可以作為環(huán)境條件刺激乳酸菌細菌素的生物合成[8]。如在植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NC8[9]、J23[10]、嗜酸乳桿菌N2[11]等菌株代謝產(chǎn)細菌素的研究中，均發(fā)現(xiàn)存在外源微生物可通過共培養(yǎng)促進產(chǎn)細菌素菌株生長并誘導(dǎo)細菌素高效合成，而且這些外源微生物具有一定的特異性[12]。

植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）RX-8分離自中國傳統(tǒng)泡菜，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株可代謝產(chǎn)生IIb 類細菌素plantaricin EF[13]。有研究報道該細菌素抑菌譜廣，加工應(yīng)用特性良好，有作為天然食品生物防腐劑的巨大潛力[14]，然而合成水平較低，使其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用嚴重受限。為了探索外源微生物共培養(yǎng)作為環(huán)境刺激因子誘導(dǎo)菌株RX-8 高效合成plantaricin EF 的可行性，本研究基于菌株RX-8 代謝產(chǎn)細菌素現(xiàn)有常規(guī)純培養(yǎng)條件及其主要合成影響因素，構(gòu)建低產(chǎn)、不產(chǎn)細菌素純培養(yǎng)模型評價體系。分別添加不同發(fā)酵食品來源（谷物醋、白酒、酸魚）的16 個菌株進行共培養(yǎng)，通過測定共培養(yǎng)前、后代謝所產(chǎn)細菌素的抑菌活性，篩選最佳共培養(yǎng)誘導(dǎo)菌株及其條件。對比分析誘導(dǎo)菌株在不同處理菌體細胞及發(fā)酵上清液的誘導(dǎo)作用，推測起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)類型。研究結(jié)果對解析混合發(fā)酵體系下細菌素生物合成調(diào)控機制，實現(xiàn)植物乳桿菌素的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株 產(chǎn)細菌素菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） RX-8，分離自泡菜，保藏于北京工商大學(xué)中水樓微生物實驗室。

共培養(yǎng)菌株：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-47、Y-48、Y-49、Y-50、Y-51 分離自白酒酒曲；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BS-15、BS-77、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BC-29、BC-83 分離自谷物醋醋醅；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）LP-45、LP-68、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）LF-23、LF-33、LF-56、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）LF-78、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）PP-30 分離自酸魚；以上菌株均保藏于北京工商大學(xué)益生菌活性代謝產(chǎn)物課題組實驗室。

指示菌：單核細胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes）ATCC 35152（4B），美國典型微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑材料 MRS 肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、YPD 培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白酶K、牛津杯、硫酸銨、細菌過濾膜（直徑0.22 μm），北京半夏生物有限公司；Trans-Well 小室，美國康寧公司；2.5 mol/L HCl、2.5 mol/L NaOH、Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 7.0）、生理鹽水均為分析純級，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標儀，美國Thermo Electron 公司；UB-7 pH 計，美國DENVER 儀器公司；LDZX-75KB 立式壓力滅菌器，上海安申醫(yī)療器械廠；TGL-20M 低溫離心機，長沙平凡儀器儀表有限公司；Supra 22K 大容量高速冷凍離心機，韓國翰尼（Hanil）公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不產(chǎn)和低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系構(gòu)建 基于前期對植物乳桿菌RX-8 代謝產(chǎn)細菌素培養(yǎng)條件的研究，在接種量（體積分數(shù)1%）和培養(yǎng)時間（24 h）不變的條件下，選取3 種對細菌素合成影響顯著的因素（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基起始pH 值、培養(yǎng)基濃度）設(shè)置以下培養(yǎng)條件。通過對細菌素合成量的測定，確定不產(chǎn)和低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型體系的培養(yǎng)條件，細菌素的合成量用對指示菌的抑菌圈直徑表示。

表1 不產(chǎn)和低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)條件設(shè)置Table 1 Setting of non-and low-yield bacteriocin culture conditions

1.3.2 可誘導(dǎo)菌株的篩選

1.3.2.1 純培養(yǎng)與共培養(yǎng)發(fā)酵上清液的制備 將植物乳桿菌RX-8 接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h 后得純培養(yǎng)發(fā)酵液。

將各共培養(yǎng)試驗菌株（16 株）從斜面接種到各自的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期后以體積分數(shù)1%接種量轉(zhuǎn)接一代，期間每隔1 h 測定OD600nm吸光度。連續(xù)培養(yǎng)2 代，取第3 代菌株備用。在不產(chǎn)、低產(chǎn)、正常產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)模型下，向乳桿菌RX-8 發(fā)酵液中加入16 株共培養(yǎng)試驗菌株進行共同發(fā)酵，接種比例1∶1（體積比），接種密度則根據(jù)各自菌體達到穩(wěn)定初期時的OD 值確定，培養(yǎng)24 h 得共培養(yǎng)發(fā)酵液。

將純培養(yǎng)與共培養(yǎng)發(fā)酵液10 000 r/min 離心取上清，用2.5 mol/L NaOH 調(diào)整pH 值為6.5。在調(diào)好pH 值的發(fā)酵上清液中加入溶于磷酸緩沖液的過氧化氫酶，至終質(zhì)量濃度5 mg/mL，37 ℃水浴2 h 后用0.22 μm 濾膜過濾，得無細胞發(fā)酵上清液（Cell-free supernatant，CFS）。

1.3.2.2 細菌素粗提液的制備 采用硫酸銨沉淀法[15]從無細胞發(fā)酵上清液中制取純培養(yǎng)細菌素粗提液。用NaOH 調(diào)節(jié)CFS 的pH 值至7，再將研磨成粉的硫酸銨緩慢加入，用磁力攪拌器不斷攪拌，直到硫酸銨的最終飽和度為80%。置于4 ℃冰箱中靜置沉淀過夜，然后12 000 r/min 4 ℃下冷凍離心10 min，收集沉淀。將沉淀復(fù)溶于0.02 mol/L 的Na2HPO4-NaH2PO4（pH 7.0）緩沖液中，即為細菌素粗提液。

1.3.2.3 測定不同細菌素粗提液的抑菌活性 取純培養(yǎng)和共培養(yǎng)細菌素粗提液，通過瓊脂擴散法[16]測定其對指示菌單增李斯特菌ATCC 35152 的抑菌圈直徑，其中平板在30 ℃下培養(yǎng)6 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，讀數(shù)精確至0.01 mm。進行3次生物學(xué)重復(fù)試驗，取3 次結(jié)果的平均值。在不產(chǎn)、低產(chǎn)、正常產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)模型培養(yǎng)條件下，以純培養(yǎng)下的細菌素EF 粗提液為對照，比較共培養(yǎng)和純培養(yǎng)條件下所得抑菌圈直徑差，抑菌直徑差為正數(shù)代表有誘導(dǎo)能力，為0 或負數(shù)代表無誘導(dǎo)能力。以最大的抑菌直徑差下的共培養(yǎng)菌株為最佳誘導(dǎo)菌，相應(yīng)的培養(yǎng)模型為后續(xù)研究所用的培養(yǎng)模型體系。

1.3.3 共培養(yǎng)菌株對細菌素RX-8 的敏感性測試 采用1.3.2.3 方法研究純培養(yǎng)細菌素粗提液對16 株共培養(yǎng)菌株的抗菌活性。每組處理重復(fù)3次，以抑菌圈直徑的平均值代表共培養(yǎng)菌株對細菌素EF 的敏感性。

1.3.4 最佳誘導(dǎo)菌誘導(dǎo)能力的驗證 使用低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)模型的條件，分別純培養(yǎng)和1∶1 共培養(yǎng)最佳誘導(dǎo)菌和植物乳桿菌RX-8，每隔4 h 取純培養(yǎng)和共培養(yǎng)下的CFS，制取細菌素粗提液，然后用1.3.2.3 節(jié)的方法測定三者對指示菌的抑菌活性。每組處理重復(fù)3 次，以抑菌圈直徑的平均值為結(jié)果。并且每隔4 h 取純培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液，進行梯度稀釋后，平板計數(shù)和測定OD600nm的吸光度。

1.3.5 確定最佳誘導(dǎo)菌與RX-8 的最佳接種比例和初始接種濃度 為確定枯草芽孢桿菌BS-15 和植物乳桿菌RX-8 的最佳接種比例，分別采用1∶1，10∶1，1∶10 （枯草芽孢桿菌BS-15∶植物乳桿菌RX-8，體積比）這3 種比例接種培養(yǎng)，測定共培養(yǎng)發(fā)酵上清液的抑菌活性。

制備不同菌體密度的乳桿菌RX-8 和枯草芽孢桿菌BS-15：分別將2 株菌活化2 代，從0～24 h，每隔3 h 取第3 代菌株的發(fā)酵液，進行梯度稀釋后平板計數(shù)并測定OD600nm的吸光度，確定菌體密度與吸光度的變化關(guān)系。通過吸光度進而獲得不同菌體密度105，106，107，108，109CFU/mL 的發(fā)酵液。在最佳初始接種濃度的基礎(chǔ)上，將不同濃度的2 株菌進行組合，測定共培養(yǎng)發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.6 起誘導(dǎo)作用物質(zhì)的初步探究 將枯草芽孢桿菌BS-15 進行如下處理：（1） 將枯草芽孢桿菌BS-15 純培養(yǎng)發(fā)酵液10 000 r/min 離心后棄上清，然后用生理鹽水清洗3 遍，即得菌懸液；（2）將菌懸液在121 ℃滅活15 min，得滅活菌懸液；（3）用0.22 μm 細菌過濾膜處理發(fā)酵上清液，得無菌發(fā)酵上清液；（4）在無菌發(fā)酵上清中加入2 mg/mL 的蛋白酶K，在pH 8.0 下37 ℃孵育2 h，再于80 ℃加熱15 min 滅活酶，即得酶解無菌發(fā)酵上清；將上述操作處理所得與植物乳桿菌RX-8 在1.3.5 節(jié)所得的最優(yōu)條件下直接共培養(yǎng)。（5）用Trans-Well分隔兩種菌，使二者雖無法直接接觸但可以自由交換代謝物質(zhì)，使兩種菌在1.3.5 節(jié)所得的最優(yōu)條件下間接共培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的不同處理組菌液離心取上清液，進行抑菌活性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不產(chǎn)和低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系的建立

分析12 種培養(yǎng)條件組合下細菌素合成的變化情況，如圖1所示，不同培養(yǎng)條件下，抑菌圈直徑變化差異明顯，在組合8 和9 條件下，乳桿菌RX-8 不能代謝產(chǎn)生細菌素；在組合3 條件下，該菌株可代謝產(chǎn)生較低水平的細菌素。根據(jù)以上結(jié)果，確定低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)基起始pH 5、培養(yǎng)基1/10 MRS、接種量1%、培養(yǎng)時間24 h。不產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度42 ℃、培養(yǎng)基起始pH 5、培養(yǎng)基1/10 MRS、接種量1%、培養(yǎng)時間24 h。

圖1 低產(chǎn)和不產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系的建立Fig.1 The establishment of low-yield and non-bacteriocin-producing culture system

2.2 誘導(dǎo)菌株及共培養(yǎng)體系的確定

在不同產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系下，植物乳桿菌RX-8 與16 株試驗菌株共培養(yǎng)后得到的抑菌直徑差如表2所示。在不產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系下，只有5株菌能誘導(dǎo)乳桿菌RX-8 產(chǎn)細菌素，然而未實現(xiàn)細菌素產(chǎn)量從不產(chǎn)到正常產(chǎn)，推測是由于這種不產(chǎn)培養(yǎng)體系的營養(yǎng)物質(zhì)少，不能滿足菌體自身營養(yǎng)供給；在低產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系下，有15 株菌促進了乳桿菌RX-8 細菌素的合成，其中枯草芽孢桿菌BS-15 和釀酒酵母菌Y-49 促進效果最為顯著，抑菌直徑差達到11 mm 以上，使細菌素產(chǎn)量從低產(chǎn)到較高產(chǎn)；而在正常產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系下，雖然16 株試驗菌株都有促進效果，但促進效果低于低產(chǎn)培養(yǎng)體系，因此不能作為最佳共培養(yǎng)體系，枯草芽孢桿菌在此體系下促進效果顯著，抑菌直徑差達10.55 mm。綜合以上不同培養(yǎng)體系抑菌直徑差的結(jié)果，最終選取枯草芽孢桿菌BS-15 為共培養(yǎng)菌株，低產(chǎn)培養(yǎng)體系為共培養(yǎng)的培養(yǎng)條件。

表2 不同產(chǎn)細菌素培養(yǎng)體系下共培養(yǎng)誘導(dǎo)菌株的篩選Table 2 Screening of co-culture induced strains in different bacteriocin-producing culture systems

2.3 共培養(yǎng)菌株對細菌素EF 的敏感性研究

如表3所示，細菌素EF 對試驗的16 株菌株具有不同程度的抑制作用。其中對2 株釀酒酵母菌（Y-50、Y-51）沒有抑制作用；對1 株釀酒酵母菌（Y-49）、1 株發(fā)酵乳桿菌（LF-56）、1 株腸膜明串珠菌（LF-78） 和2 株凝結(jié)芽孢桿菌 （BC-29、BC-83）有較弱的抑制作用；對細菌素EF 敏感性差的菌株更容易造成環(huán)境脅迫，出現(xiàn)強誘導(dǎo)性的可能性更大。對釀酒酵母菌Y-48、植物乳桿菌LP-45、枯草芽孢桿菌BS-77 有明顯的抑制作用。只有特定的菌株有敏感性且敏感性強弱各不相同，這與細菌素對不同靶細胞的作用機制不同，以及對同一種細菌素可以通過多種作用機制發(fā)揮作用有關(guān)[17]。

表3 共培養(yǎng)菌株對細菌素EF 的敏感性研究Table 3 Study on the sensitivity of co-cultured strains to plantaricin EF

2.4 最佳誘導(dǎo)菌對指示菌誘導(dǎo)作用的驗證結(jié)果

枯草芽孢桿菌BS-15 對指示菌有無抑菌活性的檢測如圖2a 所示，可以看出枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液發(fā)酵上清對指示菌無抑菌作用，枯草芽孢桿菌BS-15 與植物乳桿菌RX-8 共培養(yǎng)發(fā)酵液對指示菌的抑菌活性明顯強于乳桿菌RX-8 純培養(yǎng)發(fā)酵液。由此，可以排除誘導(dǎo)菌對抑菌圈直徑的干擾。表明枯草芽孢桿菌BS-15 與乳桿菌RX-8 共培養(yǎng)發(fā)酵液所提取出的細菌素是plantaricin EF，增加的抑菌圈直徑代表著plantaricin EF 的產(chǎn)量增高。

共培養(yǎng)和純培養(yǎng)過程中，0～32 h 細菌素的合成情況如圖2b 所示，4 h 時共培養(yǎng)體系中只產(chǎn)生少量細菌素，而純培養(yǎng)體系還尚未合成細菌素。兩種培養(yǎng)體系下，細菌素的合成量變化趨勢大致相同，合成量均在20 h 左右達到穩(wěn)定，32 h 左右開始減少。當(dāng)達到穩(wěn)定期時，共培養(yǎng)體系中細菌素的合成量約是純培養(yǎng)的3 倍。說明誘導(dǎo)菌不僅可以極大的提高細菌素產(chǎn)量，還可以把開始產(chǎn)細菌素的時間提前。共培養(yǎng)和純培養(yǎng)過程中，0～32 h 細菌生長情況如圖3所示，細菌素合成量的變化趨勢和群體密度的變化一致，表明細菌素的產(chǎn)量和細胞數(shù)量有關(guān)，這或許涉及到群體感應(yīng)機制。

圖2 共培養(yǎng)與純培養(yǎng)過程中細菌素合成量的變化情況Fig.2 The changes of bacteriocin synthesis in co-culture and mono-culture

圖3 共培養(yǎng)和純培養(yǎng)條件下菌株的生長情況Fig.3 The growth of strains in co-culture and mono-culture

2.5 共培養(yǎng)下的最佳接種比例和初始接種濃度

由圖4a 可知，不同接種比例對細菌素RX-8的產(chǎn)量影響不大。10∶1 接種比例下，細菌素plantaricin EF 的合成量略高于接種比例為1∶1 和1∶10 的培養(yǎng)體系。圖4b 所示，不同濃度的枯草芽孢桿菌無法誘導(dǎo)濃度為105CFU/mL 的乳桿菌RX-8分泌plantaricin EF；發(fā)現(xiàn)乳桿菌RX-8 的接種濃度從106CFU/mL 起，不同濃度枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)后都能誘導(dǎo)其分泌plantaricin EF；枯草芽孢桿菌接種濃度在105～108CFU/mL 時，誘導(dǎo)乳桿菌RX-8（107，108，109CFU/mL）所分泌的細菌素量基本一致。在該濃度范圍內(nèi)，細菌素plantaricin EF產(chǎn)量與乳桿菌RX-8 的濃度無關(guān)，而與枯草芽孢桿菌BS-15 的濃度有關(guān)。而且，乳桿菌RX-8 濃度在105～108CFU/mL 時，濃度為109CFU/mL 的枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)效果與108CFU/mL 的相同，然而乳桿菌RX-8 濃度為109CFU/mL 時，109CFU/mL枯草芽孢桿菌BS-15 的誘導(dǎo)效果比濃度為108CFU/mL 的效果差。最終確定乳桿菌RX-8 初始接種濃度為107CFU/mL，誘導(dǎo)菌株枯草芽孢桿菌初始接種濃度為108CFU/mL。

圖4 初始接種比例與接種濃度的測定Fig.4 Determination of initial inoculation ratio and inoculation concentration

2.6 起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)研究

為探明誘導(dǎo)乳桿菌RX-8 合成更多細菌素的物質(zhì)。試驗將枯草芽孢桿菌進行不同處理，再與乳桿菌RX-8 共培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。與純培養(yǎng)乳桿菌RX-8 相比，只有枯草芽孢桿菌的上清液和菌體自身誘導(dǎo)了乳桿菌RX-8 產(chǎn)生細菌素，而蛋白酶和高壓高溫處理后的芽孢桿菌無誘導(dǎo)作用，說明誘導(dǎo)物質(zhì)是活細胞產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)。使用Trans-Well 小室可以使兩種菌無法直接接觸，然而其分泌的物質(zhì)可以自由通過，Trans-Well 小室分隔后共培養(yǎng)發(fā)酵上清的抑菌能力顯著增加。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌BS-15 可分泌合成一種能起到誘導(dǎo)作用的蛋白類物質(zhì)。

圖5 不同處理條件下枯草芽孢桿菌BS-15 的誘導(dǎo)能力檢測Fig.5 Detection of the inducibility of Bacillus subtilis BS-15 under different treatment conditions

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

本研究篩選得到的誘導(dǎo)菌具有高度特異性，并且菌株的誘導(dǎo)性和菌株的親緣關(guān)系無直接相關(guān)性，同種菌內(nèi)不同菌株誘導(dǎo)性的強弱也各不相同。與植物乳桿菌RX-8 親緣關(guān)系遠的5 株釀酒酵母中有3 株具有強誘導(dǎo)性，而另外2 株幾乎無誘導(dǎo)性。與植物乳桿菌RX-8 親緣關(guān)系近的植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌中部分菌株有較強的誘導(dǎo)性，其它菌株誘導(dǎo)性很弱。之前報道[9-10，18]中具有誘導(dǎo)作用的蠟樣芽胞桿菌、枯草芽孢桿菌、戊糖片球菌、腸膜明串球菌也表現(xiàn)出僅有一部分特定菌株有強誘導(dǎo)性；能產(chǎn)L-乳酸的2 株凝結(jié)芽孢桿菌都有優(yōu)良的誘導(dǎo)性。

結(jié)合共培養(yǎng)菌株對細菌素RX-8 敏感性來看，發(fā)現(xiàn)敏感性強的菌株的誘導(dǎo)性很低，而誘導(dǎo)性低的菌株敏感性不一定很強。釀酒酵母Y-48、植物乳桿菌LP-45、枯草芽孢桿菌BS-77 對細菌素EF 的敏感性強，然而誘導(dǎo)性很弱，推測可能是因為少量細菌素EF 就能很好的抑制這3 株菌，無法對乳桿菌RX-8 造成環(huán)境脅迫。釀酒酵母Y-47、發(fā)酵乳桿菌LF-23、植物乳桿菌LP-68 的誘導(dǎo)性也很弱，然而它們的敏感性并不強。具有抗性的兩株釀酒酵母（Y-50 和Y-51）可以誘導(dǎo)不產(chǎn)、低產(chǎn)和正常產(chǎn)培養(yǎng)模型體系中的細菌素EF 產(chǎn)量增高，表現(xiàn)出強誘導(dǎo)性?？梢姽才囵B(yǎng)菌株的敏感性并不是共培養(yǎng)菌株具有誘導(dǎo)性的唯一影響因素。

從16 株菌中篩選得到最佳誘導(dǎo)菌：枯草芽孢桿菌BS-15，對其誘導(dǎo)作用進行驗證后，優(yōu)化其與植物乳桿菌RX-8 的共培養(yǎng)體系的發(fā)酵條件。Mellefont 等[19]在乳酸桿菌與其它細菌共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，混合體系中的協(xié)同增長作用與菌株的初始濃度有一定關(guān)系。本研究在驗證過程中，同樣探究了不同共培養(yǎng)接種條件對細菌素合成的影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)下細菌素plantaricin EF 的合成與菌體密度緊密相關(guān)，因此，共培養(yǎng)中接種菌體密度配比尤其重要。試驗最終確定枯草芽孢桿菌BS-15和植物乳桿菌RX-8 的接種比例為10∶1，植物乳桿菌RX-8 接種濃度為107CFU/mL，枯草芽孢桿菌BS-15 接種濃度為108CFU/mL。并且，課題組前期研究表明純培養(yǎng)條件下乳桿菌RX-8 合成細菌素的行為受群體感應(yīng) （Quorum sensing，QS）系統(tǒng)調(diào)控。猜測共培養(yǎng)條件下細菌種屬間的群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控細菌素的合成過程，而luxS 基因是其中的關(guān)鍵基因。從系統(tǒng)發(fā)育樹上來看，乳酸乳球菌、植物乳桿菌與枯草芽孢桿菌的luxS 基因發(fā)育水平均屬于硬壁菌門（Firmicutes）[20]。或許，枯草芽孢桿菌BS-15 和植物乳桿菌RX-8 也具有相似的luxS 基因，能夠產(chǎn)生相似的AI-2 信號分子，被乳桿菌RX-8 的組氨酸激酶感受器識別，導(dǎo)致細菌素基因轉(zhuǎn)錄水平增加，從而提高plantaricin EF的產(chǎn)量。

試驗結(jié)果表明枯草芽孢桿菌BS-15 產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用的蛋白或多肽類物質(zhì)。而且已有研究報道，誘導(dǎo)菌產(chǎn)生的蛋白類信號分子能夠增強產(chǎn)細菌素菌株生存能力，甚至能增加細菌素產(chǎn)量。Cagno 等[21]將植物乳桿菌DC400 與乳酸菌共培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DC400 本身的信號分子PlnA可以增強或抑制乳酸菌一些蛋白的表達，來增強它自身的生存能力。Maldonado 等[22]在培養(yǎng)植物乳桿菌NC8 時添加外源肽PLNC8IF，發(fā)現(xiàn)與加入共培養(yǎng)物一樣均促進植物乳桿菌NC8 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生細菌素。Tabasco 等[23]在培養(yǎng)嗜酸乳桿菌La-5 時，加入人工合成的成熟肽IP-1800，發(fā)現(xiàn)細菌素lactacin B 活性增加。

誘導(dǎo)物質(zhì)也可能是具有誘導(dǎo)效應(yīng)的氨基酸，可能對細菌素合成、加工、釋放、調(diào)控過程中的關(guān)鍵蛋白或酶有誘導(dǎo)作用，比如協(xié)助切割信號肽，將成熟的細菌素轉(zhuǎn)運到胞外的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白和輔助蛋白；能提高組氨酸蛋白激酶、響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白等細菌素調(diào)控蛋白的活性；能抑制降解細菌素的酶活性，避免細菌素被分解造成細菌素胞外積累[24]。

這些猜測都需要通過進一步試驗證實，本課題組接下來會研究共培養(yǎng)體系下細菌素的合成是否與信號分子的分泌成正相關(guān)，探究細菌素產(chǎn)量增加與群體感應(yīng)系統(tǒng)之間的關(guān)系。

3.2 結(jié)論

共培養(yǎng)體系下，多種微生物都具有誘導(dǎo)植物乳桿菌RX-8 合成細菌素plantaricin EF 能力提高的作用，其中枯草芽孢桿菌BS-15 的誘導(dǎo)效果最好，且最佳初始接種比例為10∶1，最佳初始接種濃度為107CFU/mL 乳桿菌RX-8，誘導(dǎo)菌株枯草芽孢桿菌BS-15 為108CFU/mL。起誘導(dǎo)作用的是枯草芽孢桿菌的蛋白類分泌物。