沙月霞，黃澤陽，李云翔，趙沛

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所，銀川 750011）

玉米是世界上重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料，高密度種植、化肥農(nóng)藥過量施用以及土壤鹽漬化等導(dǎo)致玉米土壤中病原菌數(shù)量連年積累，致使根系生長的微生態(tài)環(huán)境失衡[1-2]。莖基腐病是由多種病原菌復(fù)合侵染的系統(tǒng)性土傳病害，也是危害玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一，一般可使玉米減產(chǎn)10%～25%，危害嚴(yán)重時玉米產(chǎn)量損失可超過80%[3-4]。種植抗病品種和施用化學(xué)農(nóng)藥是生產(chǎn)上最常用的防治措施。隨著生態(tài)環(huán)境保護(hù)和糧食安全日益受到重視，玉米莖基腐病的生物防治越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。五谷豐素是由鏈霉菌（Streptomycessp.）NEAU6代謝產(chǎn)物研制出的生物制劑，能促進(jìn)種苗生長和提高抗倒伏能力[5-6]，是防治玉米莖基腐病的種衣劑。程星凱[7]研究發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）TA-1浸種可以有效預(yù)防玉米莖基腐病，并具有顯著的促生作用。

土傳病害常與土壤中病原菌數(shù)量積累較多、土壤生態(tài)環(huán)境失衡和氣候因子有關(guān)，因此，改善植株根系生長的土壤微生態(tài)環(huán)境、恢復(fù)土壤生態(tài)服務(wù)功能是防治土傳病害的途徑之一[8]。CHEN 等[9]研發(fā)的棘孢木霉菌（Trichoderma asperellum）顆粒劑與化肥混合后于播種前施用可以改善土壤質(zhì)量，有效預(yù)防玉米莖基腐病。土壤微生物參與物質(zhì)循環(huán)，而微生物群落結(jié)構(gòu)的變化會影響土壤健康狀況。馮帥[10]分離的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501 可以改變玉米根際土壤細(xì)菌群落和固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成，優(yōu)化土壤微生態(tài)環(huán)境。沙月霞等[11]研制的微生物菌劑撒施可顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，降低pH值，增加有機(jī)質(zhì)、全氮、速效鉀含量，改善玉米農(nóng)田土壤健康狀況，有效預(yù)防玉米莖基腐病。

采用宏基因測序技術(shù)探究生物菌劑對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響報道較多。侯景清等[12]發(fā)現(xiàn)乳酸菌復(fù)合制劑對鹽堿地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響較大，可增加碳水化合物活性酶基因序列數(shù)目，降低土壤中毒素的基因序列數(shù)目。王啟全[13]研究了多環(huán)芳烴降解菌劑對參與土壤碳、氮、磷及硫元素循環(huán)過程的微生物酶功能基因的調(diào)控作用。目前利用宏基因組測序技術(shù)探索生物制劑對玉米田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能基因的影響研究還未見報道。本課題組前期已探明了五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑防治玉米莖基腐病的田間效果、促生增產(chǎn)效果，以及對土壤微生物量、生物酶活性的改善作用。本研究采用宏基因組測序技術(shù)，一方面研究五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑撒施后寧夏玉米田土壤微生物群落的物種組成，特別明確其對土壤真菌、細(xì)菌和古菌類群的門和屬水平豐度的影響，另一方面研究五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑撒施后寧夏玉米土壤微生物功能注釋及多樣性，主要探明其對碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes，CAZy）、抗生素抗性基因（Antibiotic resistant genes，ARGs）和硝化功能微生物基因的影響，為改善農(nóng)田土壤微生態(tài)環(huán)境提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥劑及地點

試驗藥劑：微生物菌劑M1 和M2 是由枯草芽孢桿菌HR15、萎縮芽孢桿菌HR37 和貝萊斯芽孢桿菌HR55 等混合發(fā)酵粉劑（30%）、腐植酸（5%）、土壤調(diào)節(jié)劑（0.4%）、微量元素（0.6%）以及載體（64%）而成的微生物菌劑，其中M1 載體為腐熟烘干羊糞，M2 載體為雞糞有機(jī)肥（包含有機(jī)碳25.5%、氮1.63%、磷1.54%、鉀0.85%），該菌劑由寧夏農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所研發(fā)；五谷豐素粉劑是由放線菌代謝產(chǎn)物制成的微生物菌劑（用于浸種或拌種），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；20%噁霉靈可濕性粉劑由深圳諾普信生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；微生物菌劑MCK由雷邦斯生物技術(shù)（北京）有限公司生產(chǎn)。

試驗材料為玉米，品種為粒隆915，由北京粒隆種業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。

試驗地點：2020 年在寧夏回族自治區(qū)惠農(nóng)區(qū)（106°45'57″E，39°07'31″ N）進(jìn)行田間試驗。試驗土壤為草甸土，pH 8.71，堿解氮為96.1 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)為15.9 g·kg-1，有效磷為33.7 mg·kg-1，速效鉀為173.7 mg·kg-1，水溶性鹽為9.24 g·kg-1，Na+為3.97 cmol·kg-1，Ca2+為2.22 cmol·kg-1，Mg2+為2.51 cmol·kg-1，Cl-為7.28 cmol·kg-1，SO42-為5.51 cmol·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置5個處理：EES，20%噁霉靈可濕性粉劑浸種24 h 和土壤表面噴霧（EES-1、EES-2、EES-3）；CMCK，五谷豐素浸種24 h和微生物菌劑MCK在土壤表面撒施（CMCK-1、CMCK-2、CMCK-3）；CM2，五谷豐素浸種24 h 和微生物菌劑M2 在土壤表面撒施（CM2-1、CM2-2、CM2-3）；CM1，五谷豐素浸種24 h和微生物菌劑M1 在土壤表面撒施（CM1-1、CM1-2、CM1-3）；CK，清水浸種24 h 和土壤未采用任何藥劑處理（CK-1、CK-2、CK-3）。

用4 L 有效濃度為50 mg·L-1的五谷豐素（純度為58%）菌劑浸泡4 kg 玉米種子，浸種24 h 后晾干。20%噁霉靈可濕性粉劑按照推薦劑量浸種24 h 后種子晾干備用。種植玉米前，將微生物菌劑M1、M2、MCK（600 kg·hm-2）均勻撒施于農(nóng)田土壤表面，20%噁霉靈可濕性粉劑（推薦劑量）均勻噴施于土壤表面。然后將所有試驗小區(qū)進(jìn)行旋耕，深度約20 cm。每個處理4 個重復(fù)小區(qū)，每個小區(qū)面積約70 m2，小區(qū)之間用寬度為1 m 的田埂隔開。試驗期間進(jìn)行正常水肥管理和殺蟲，不施用任何殺菌劑。

1.3 樣本采集

2020 年9 月9 日玉米蠟熟期采集田間土壤，每個小區(qū)按照對角線法采集5 點樣本，土樣混合后裝入自封袋；每個處理采集4份樣本，然后將相同處理的4份樣本混合均勻，分成3 份，自封袋上作好標(biāo)記。所有樣本放入控溫采樣箱內(nèi)（內(nèi)有干冰）帶回實驗室，保存于-80 ℃冰箱待測。取土器直徑為6 cm、長度為20 cm，采集的土壤樣本距離玉米根莖部約15 cm，采樣深度為0～20 cm。

1.4 DNA提取、建庫與宏基因組測序

利用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美國）試劑盒進(jìn)行樣品DNA 抽提。完成基因組DNA 抽提后，利用TBS-380 檢測DNA 濃度，利用Nano-Drop200 檢測DNA 純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。通過Covaris M220（Gene基因有限公司，中國）將DNA 片段化，篩選約400 bp 的片段，用于構(gòu)建PE 文庫。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq（Bioo Scientific，美國）建庫，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina NovaSeq PE150（Illumina，美國）測序平臺進(jìn)行宏基因組測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

運用fastp（https：//github.com/OpenGene/fastp）剪切reads 3'端和5'端的adapter 序列，然后去除質(zhì)量剪切長度小于50 bp、平均質(zhì)量低于20 和含N 堿基的reads，保留高質(zhì)量single-end reads 與pair-end reads[14]。利 用Megahit（https：//github.com/voutcn/megahit）軟件對測序序列進(jìn)行拼接，最短contig 長度≥300 bp。采用MetaGene（http：//metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）軟件對拼接contigs 進(jìn)行ORF 預(yù)測，將長度≥100 bp的基因序列翻譯為氨基酸序列，獲得樣本基因預(yù)測結(jié)果。使用CD-HIT 軟件（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit/）進(jìn)行聚類（默認(rèn)參數(shù)為90% identity、90%coverage），建立非冗余基因集，選取每類最長基因作為代表序列[15]。運用SOAPaligner（http：//soap.genomics.org.cn/）比對樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集（默認(rèn)參數(shù)為95% identity），獲得對應(yīng)樣品的基因豐度信息[16]。

利用Diamond（http：//www.diamondsearch.org/index.php，Version 0.8.35）（BLASTP 比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5）統(tǒng)計物種分類學(xué)信息[17]。運用CAZy數(shù)據(jù)庫的對應(yīng)工具h(yuǎn)mmscan（http：//hmmer.janelia.org/search/hmmscan）（比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value 為1e-5）統(tǒng)計碳水化合物活性酶注釋信息。采用Diamond（http：//www.diamondsearch.org/ index.php）（BLASTP 比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value 為1e-5）統(tǒng)計ARGs抗性功能注釋信息。

使用Excel 2016 計算土壤微生物群落門和屬水平的物種組成，統(tǒng)計碳水化合物酶類和ARGs 的比例。利用DPS 18.1 進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE），顯著性分析采用最小顯著差數(shù)法（Least significant ranges，LSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列組裝

對15 個樣品的reads 進(jìn)行過濾處理，共獲得1 356 052 816 條clean reads，每個樣品的reads 數(shù)目范圍為83 928 522～107 437 926。對contigs 進(jìn)行評估發(fā)現(xiàn)，contigs 長度的平均N50 及平均N90 分別為566 bp 與399 bp。共獲得19 251 162 個ORFs，每個樣本的ORFs平均長度為403 bp。樣本的序列組裝和基因預(yù)測結(jié)果說明測序結(jié)果較好，序列長度可以用于下一步分析。對15 個玉米土壤微生物群落樣本的contigs進(jìn)行物種注釋，共獲得15 632 個物種，其中細(xì)菌占主導(dǎo)地位的95.21%，古菌和病毒分別占4.24% 和0.04%，真核生物（包括真菌）的比例只有0.32%，沒有分類注釋信息的占比為0.19%。

2.2 生物菌劑施用對玉米田土壤微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 對土壤微生物群落多樣性的影響

通過主坐標(biāo)（PCoA）分析，發(fā)現(xiàn)不同處理的土壤微生物群落多樣性在門水平上差異較明顯（圖1）。PCoA的前3個主成分共解釋了88.98%的群落差異，其中軸Ⅰ、軸Ⅱ和軸Ⅲ分別為66.50%、16.80%和5.68%，5 個處理的微生物群落在門水平上分布比較分散。Beta分析結(jié)果說明施用生物菌劑對玉米土壤微生物群落門水平影響較大。

圖1 生物菌劑對玉米田土壤微生物群落β-多樣性的影響（門水平）Figure 1 Impact of microbial agents on β-diversity of soil bacterial groups in maize field（phylum level）

圖2 顯示了生物菌劑施用對屬水平的玉米田土壤微生物群落β-多樣性的影響。PCoA的前3個主成分共解釋了83.53%的群落差異，其中軸Ⅰ、軸Ⅱ和軸Ⅲ分別為57.68%、16.26%和9.59%，屬水平上的不同處理微生物群落分布在不同象限，表明生物菌劑施用對屬水平的玉米土壤微生物群落多樣性影響較大。

圖2 生物菌劑對玉米田土壤微生物群落β-多樣性的影響（屬水平）Figure 2 Impact of microbial agents on β-diversity of soil bacterial groups in maize field（genus level）

2.2.2 對土壤微生物群落門水平的影響

土壤細(xì)菌在土壤微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，玉米田土壤細(xì)菌群落中相對豐度＞5%的優(yōu)勢菌門主要包括變形菌門（Proteobacteria，32.59%）、放線菌門（Actinobacteria，20.91%）、酸桿菌門（Acidobacteria，10.82%）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，6.45%）。圖3 表明，與CK 相比，4 組處理對相對豐度＞1%的土壤細(xì)菌門豐度的影響主要表現(xiàn)在變形菌門、放線菌門、擬桿菌門（Bacteriodetes）、厚壁菌門（Fimicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）的相對豐度增加。生物菌劑（CM1和CM2）處理下變形菌門、放線菌門和厚壁菌門豐度平均分別增加2.58%、4.84%和39.90%，酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門（Chloroflexi）和Candidatus Rokubacteria 豐度平均分別下降9.97%、7.71%、13.53%和3.60%。土壤微生物群落中有2.71%的細(xì)菌無法分類。

圖3 生物菌劑對玉米田土壤細(xì)菌類群門豐度的影響（相對豐度＞1%）Figure 3 Impact of microbial agents on phylum abundance of soil bacterial groups in maize field（Relative abundance above 1%）

古菌在土壤微生物群落中的比例為4.24%，奇古菌門（Thaumarchaeota）在土壤微生物群落中的比例為3.43%，廣古菌門（Euryarchaeota）的比例為0.55%，泉古菌門（Crenarchaeota）的比例為0.09%，深古菌門（Candidatus_Bathyarchaeota）的占比＜0.01%。CM1、CM2、CMCK和EES處理后，土壤中的奇古菌門豐度分別增加了16.28%、36.54%、8.31%和9.06%；CM1 和CM2 處理使廣古菌門豐度降低9.09%，CMCK 和EES處理的廣古菌門豐度沒有變化；泉古菌門和深古菌門豐度沒有變化。比較15 個樣本的古菌類群（圖4）發(fā)現(xiàn)，奇古菌門基因拷貝數(shù)量在古菌類群中占據(jù)主導(dǎo)地位，達(dá)到80.74%，其中亞硝化球菌（Nitrososphaera）是最優(yōu)勢菌群，在古菌類群中占比為70.14%，其次為氨氧化古菌（Candidatus_Nitrosocosmicus，21.07%）。廣古菌門（Euryarchaeota，13.20%）、泉古菌門（Crenarchaeota，2.08%）和深古菌門（Candidatus_Bathyarchaeota，1.54%）也是古菌類群的優(yōu)勢菌門，洛基古菌門（Candidatus_Lokiarchaeota）占古菌類群約0.09%，未分類古菌的占比為2.04%。

圖4 生物菌劑對玉米田土壤古菌類群門豐度的影響Figure 4 Impact of microbial agents on phylum abundance of soil archaeal groups in maize field

土壤真菌在土壤微生物群落中所占的比例非常低，15 組樣本檢測到9 個真菌門，1 個未分類（圖5）。子囊菌門（Ascomycota）占真菌類群主導(dǎo)地位，為64.54%，CM1、CM2、CMCK 和EES 處理后土壤中子囊菌門豐度分別下降2.77%、1.52%、4.76%和1.73%；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）在真菌類群中的占比為20.36%，CM1 和CM2 處理后土壤中擔(dān)子菌門豐度分別降低2.68%和2.20%，CMCK 和EES 處理后擔(dān)子菌門豐度分別增加16.53%和3.26%。壺菌門（Chytridiomycota）占真菌類群的比例為4.47%，CM1、CM2 和EES 處理后豐度下降約6.21%，CMCK 處理后豐度不變。球囊菌門（Glomeromycota）的占比為2.08%，4 個處理的豐度均較CK 增加。大約有6.17%的真菌無法分類。

圖5 生物菌劑對玉米田土壤真菌類群門豐度的影響Figure 5 Impact of microbial agents on phylum abundance of soil fungal groups in maize field

2.2.3 對土壤微生物群落屬水平的影響

所有樣本的土壤微生物群落中相對豐度＞1%的屬有13 個（圖6），主要包括芽單胞菌屬（Gemmatimona，3.45%）、Gemmatirosa（2.99%）、土壤紅桿菌屬（Sollrubrobacter，2.57%）、亞硝化球菌屬（Nitrososphaera，2.45%）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides，2.40%）、Pyrinomonas（1.92%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.57%）、Conexibacter（1.19%）、硝化螺菌屬（Nitrospira，1.18%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，1.16%）、念珠菌固體桿菌屬（Candidatus-Solibacter，1.15%）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium，1.10%）和Candidatus-Entotheonella（1.14%），有14.35%的微生物屬無法分類，氨氧化古菌屬（Candidatus-Nitrosocosmicus，0.75%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，0.42%）和假單胞菌屬（Pseudomonas，0.37%）在土壤微生物群落中的占比較低。

圖6 表明生物菌劑施用對玉米田土壤微生物群落屬水平的組成影響比較大，CM1、CM2、CMCK 和EES 處理使芽單胞菌屬豐度降低了6.50%，但增加了土壤紅桿菌屬、亞硝化球菌屬、類諾卡氏菌屬、Pyrinomonas、鏈霉菌屬、硝化螺菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、氨氧化古菌屬、芽孢桿菌屬和假單胞菌屬的豐度。CM1、CM2 和CMCK 處理后土壤中芽孢桿菌屬豐度分別是CK 的1.77、1.86 倍和0.86 倍，EES 處理后的豐度沒有變化；CM1、CM2 和EES 處理后假單胞菌屬豐度分別增加了8.57%、11.43%和2.86%；CM1 和CM2 處理后鏈霉菌屬豐度增加了14.44%，類諾卡氏菌屬豐度增加了6.87%。結(jié)果說明生物菌劑施用可以增加生防菌的豐度，且效果優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥處理。

圖6 生物菌劑對玉米田土壤微生物群落屬水平豐度的影響Figure 6 Impact of microbial agents on genus abundance of soil microbial community in maize field

2.3 生物菌劑施用對玉米田土壤微生物物種功能基因的影響

所有樣品的contigs通過基因預(yù)測，獲得非冗余開放閱讀框（ORFs）7 383 980 個，其中228 171 個ORFs預(yù)測為CAZy，997個ORFs預(yù)測為ARGs。

CAZy 可以降解、修飾及生產(chǎn)糖苷鍵。圖7 顯示，CM1 和CM2 處理后土壤微生物的多糖裂解酶（Polysaccharide lyases，PLs）和碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)（Carbohydrate-binding modules，CBMs）基因豐度增加，CMCK和EES處理組2種酶的基因豐度下降。樣本中不同CAZy 的占比發(fā)生較大變化，糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl transferases，GTs）和輔助氧化還原酶類（Auxiliary activities，AAs）的占比下降，糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GHs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate esterases，CEs）和碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)的占比增加，多糖裂解酶的占比沒有發(fā)生變化（P＞0.05）。

圖7 生物菌劑對玉米田土壤微生物CAZy功能基因的影響Figure 7 Impact of microbial agents on the CAZy composition of soil microorganisms in maize field

土壤微生物擁有豐富多樣的抗藥性和ARGs，微生物的抗藥性和ARGs 對公共健康的威脅已成為全球亟待解決的難題。圖8 顯示，5 組樣本的玉米農(nóng)田土壤中ARGs 基因豐度的變化較大；CM1、CM2、CMCK 和EES 處理后的桿菌肽（Bacitracin）基因豐度較CK 分別下降了5.43%、2.22%、4.76%和2.96%；氟喹諾酮（Fluoroquinolone）、氯霉素（Chloramphenicol）、氨基糖苷（Aminoglycoside）和β-內(nèi)酰胺（Beta-lactam）類ARGs基因豐度增加。

圖8 生物菌劑對玉米田土壤微生物中ARGs組成的影響Figure 8 Impact of microbial agents on the ARGs composition of soil microorganisms in maize field

硝化微生物包括氨氧化微生物（AOA 和AOB）和亞硝酸鹽氧化微生物（NOB）。表1 表明，樣本土壤中硝化微生物占總體微生物的比例為3.845%～4.701%；不同處理的AOA 硝化細(xì)菌基因豐度增加；3個生物菌劑處理增加了AOB 和NOB 的硝化細(xì)菌基因豐度，而化學(xué)農(nóng)藥EES處理降低了AOB 和NOB 的硝化細(xì)菌基因豐度。CM1 和CM2 處理的硝化微生物分別增加了10.61%和21.95%。結(jié)果說明生物菌劑處理可以提高土壤硝化微生物參與氮素循環(huán)的能力，增加土壤氮營養(yǎng)水平，而化學(xué)農(nóng)藥則會降低氮素營養(yǎng)水平。

表1 生物菌劑對玉米田土壤硝化微生物基因豐度的影響（%）Table 1 Impact of microbial agents on the gene abundance of nitrifying microorganisms in maize field（%）

2.4 生物菌劑施用后玉米田土壤微生物群落的主成分分析（PCA）

在綱水平下，PCA 分析前兩個主成分解釋了98.78%的樣本CAZy 差異，其中PC1 和PC2 分別解釋了95.61%和3.17%（圖9）。通過NMDS 分析發(fā)現(xiàn)，5組樣本土壤中CAZy 分布差異比較明顯（tress：0.001）。ANOSIM 分析表明，CAZy的組間有較大差異（R=0.26，P=0.02）。

圖9 玉米田土壤微生物CAZy的主成分分析Figure 9 The principal components analysis of CAZy of soil microorganisms in maize field

PCA 分析中前兩個主成分解釋了59.33%的樣本ARGs 差異，其中PC1 和PC2 分別解釋了41.13%和18.20%（圖10）。通過NMDS 分析發(fā)現(xiàn)，5 組樣本土壤中ARGs 呈現(xiàn)明顯的分布差異（tress：0.029）。ANOSIM 分析表明，5 組ARGs 抗性基因之間差異明顯（R=0.15，P=0.012）。

圖10 玉米田土壤微生物ARGs的主成分分析Figure 10 The principal components analysis of ARGs of soil microorganisms in maize field

3 討論

土壤微生物具有礦化有機(jī)質(zhì)、形成腐殖質(zhì)、促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)、修復(fù)污染土壤等生態(tài)服務(wù)功能[18-19]，是衡量土壤肥力和土壤質(zhì)量健康的指標(biāo)之一[20]。土壤微生物常受到肥料、化學(xué)農(nóng)藥、種植物種及模式、土壤養(yǎng)分狀況等因子影響[21-22]。土壤細(xì)菌群落優(yōu)勢菌門主要是變形菌門、放線菌門和酸桿菌門[23]。變形菌門屬于富營養(yǎng)菌群，在營養(yǎng)豐富的土壤中會迅速繁殖；綠彎菌門的耐脅迫能力較強(qiáng)，適宜在養(yǎng)分貧瘠的土壤環(huán)境中繁殖[24]。溶磷菌肥施用可以顯著降低玉米土壤厚壁菌門豐度[25]。單凱等[26]和許艷蕊等[27]的研究發(fā)現(xiàn)使它隆處理的玉米非根際土壤中酸桿菌門和綠彎菌門豐度增加，變形菌門和放線菌門豐度降低。本研究的五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 或M2 撒施增加了玉米土壤中變形菌門、放線菌門和厚壁菌門豐度，降低了酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門豐度。這一研究結(jié)果與溶磷菌肥的研究結(jié)果有相似之處，而與除草劑使它隆的研究結(jié)果差異較大。這可能是由于溶磷菌肥與生物菌劑都屬于微生物產(chǎn)品，一方面促進(jìn)了土壤中部分有益微生物生長、抑制了有害微生物的生長，另一方面改善了土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性，提高了土壤微生物量[11]和土壤肥力，適合富營養(yǎng)菌群（變形菌門）生長，而不利于耐脅迫菌群（綠彎菌門）生長。另外，生物菌劑的功能菌株是芽孢桿菌，其施入土壤后直接影響了土壤中芽孢桿菌的相對豐度和基因功能。微生物菌劑M1 和M2 載體的營養(yǎng)成分存在差異，因此也會引起2 個處理的細(xì)菌門和屬組成結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。CM1 和CM2 處理增加了土壤紅桿菌屬、類諾卡氏菌屬、鏈霉菌、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌和假單胞菌的豐度。研究報道顯示，鞘氨醇單胞菌屬常用于有機(jī)磷農(nóng)藥污染和石油污染土壤的生物修復(fù)[28]，類諾卡氏菌屬[29]、鏈霉菌[30]、芽孢桿菌[31]和假單胞菌[32]中很多微生物具有生防和促生效果。芽孢桿菌可以分解土壤有機(jī)質(zhì)，其分解過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸能夠中和土壤中的鹽堿，從而降低鹽漬化的危害[33-34]。因此，CM1 和CM2 處理可以增強(qiáng)玉米田土壤微生物的生態(tài)服務(wù)功能，有利于玉米根系土壤健康。

土壤古菌參與土壤元素轉(zhuǎn)化，特別是在氮和碳的地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用，對陸地生態(tài)系統(tǒng)的影響至關(guān)重要[35-37]。厭氧條件下的有機(jī)物通過產(chǎn)甲烷古菌產(chǎn)生甲烷氣體，硝化作用的氨氧化過程則需要氨氧化古菌[38-39]。亞硝化球菌、硝化螺菌屬和氨氧化古菌是促進(jìn)土壤氮素轉(zhuǎn)化的重要微生物，五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 或M2 撒施增加了玉米田土壤中氨氧化微生物（AOA 和AOB）和亞硝酸鹽氧化微生物（NOB）的基因豐度，特別是亞硝化球菌、硝化螺菌屬和氨氧化古菌的基因豐度，從而可增加土壤全氮和硝態(tài)氮含量[9]，提高土壤肥力，改善土壤質(zhì)量。

土壤微生物群落之間因為爭奪營養(yǎng)而存在一定的競爭關(guān)系，某些菌群會優(yōu)先占據(jù)營養(yǎng)或生殖位點等資源，那些無法競爭到營養(yǎng)的菌群的生長會受到抑制[40]。生物菌劑施用后可能增強(qiáng)了土壤細(xì)菌和古菌對碳、氮等養(yǎng)分的競爭，從而促進(jìn)了細(xì)菌和古菌的生長，降低了部分真菌對養(yǎng)分的競爭，使此類真菌的生長受到了抑制。土壤真菌群落優(yōu)勢菌門為子囊菌門，外源投入物可以顯著影響真菌門豐度[41]。由于有機(jī)肥比秸稈更易被降解，子囊菌門對配施有機(jī)肥的環(huán)境喜好性更強(qiáng)，故在配施有機(jī)肥模式中子囊菌門的相對豐度更高。施用菌渣有機(jī)肥顯著增加了土壤中毛霉門豐度，降低了子囊菌門、擔(dān)子菌門、被孢霉門和壺菌門豐度[42]。木霉菌施用可以降低鹽堿地玉米土壤中子囊菌門和球菌門豐度，增加接合菌門和擔(dān)子菌門豐度[43]。五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 或M2 撒施后，玉米土壤中子囊菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門豐度下降，腐生物質(zhì)的分解增加，促進(jìn)了土壤養(yǎng)分循環(huán)。微生物菌劑M1 或M2 對鐮刀菌、立枯絲核菌等多種植物病原菌有顯著拮抗作用，可以抑制土壤中致病菌的豐度，降低土傳病害的危害[44]。

CAZy在細(xì)菌和真菌等生物體生命活動過程中均具有重要作用[45-46]，其參與糖類物質(zhì)的合成和降解過程，具有維持自然界物質(zhì)循環(huán)的生態(tài)功能[47]。微生物的CAZy 可降解植物細(xì)胞壁，進(jìn)而可降解木質(zhì)纖維素[48]。DAI 等[49]采用宏基因組技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在牦牛瘤胃木質(zhì)纖維素降解過程中，具有水解酶酶活力的蛋白質(zhì)來自GH5、GH9、GH10等糖苷水解酶家族。五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 或M2 撒施處理后土壤微生物的多糖裂解酶和碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)豐度增加，不同CAZy的占比發(fā)生較大變化。CAZy基因豐度增加有利于加速玉米田土壤中木質(zhì)纖維素的降解過程并改善土壤生物酶活性。土壤生物酶檢測也證實這一結(jié)論，五谷豐素浸種聯(lián)合菌劑M1 或M2 撒施顯著增加土壤中堿性磷酸酶、脲酶、蛋白酶、多酚氧化酶活性（待發(fā)表）。ARGs引起的微生物耐藥性是人類面臨的最緊迫的問題之一，糞肥施用等舉措加速了土壤環(huán)境中ARGs 的擴(kuò)散和傳播[50-51]。土壤中ARGs 的分布與微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對土壤ARGs 組成的影響最大，其中擬桿菌門和厚壁菌門之間關(guān)系最為密切[52]。土壤養(yǎng)分和土壤中基因水平轉(zhuǎn)移也是主要影響因素[53]。谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 或M2 撒施處理后土壤中桿菌肽和四環(huán)素基因豐度下降。由此推測，生物菌劑處理土壤可以降低土壤中桿菌肽和四環(huán)素的污染，有利于土壤健康。

4 結(jié)論

（1）五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 和M2 增加玉米田土壤細(xì)菌的變形菌門、放線菌門和厚壁菌門豐度，降低酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門豐度，增加土壤古菌的奇古菌門和廣古菌門豐度，降低土壤真菌的子囊菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門豐度。

（2）五谷豐素浸種聯(lián)合微生物菌劑M1 和M2 降低玉米田土壤的芽單胞菌屬豐度，增加芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類諾卡氏菌屬、鏈霉菌屬、亞硝化球菌屬、硝化螺菌屬和氨氧化古菌屬豐度。

（3）生物菌劑施用增加玉米田土壤微生物的多糖裂解酶和碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)基因豐度，降低桿菌肽和四環(huán)素基因豐度，增加氟喹諾酮、氯霉素、氨基糖苷和β-內(nèi)酰胺類等抗生素抗性基因豐度。

（4）生物菌劑施用可以增加玉米田土壤中氨氧化微生物（AOA 和AOB）和亞硝酸鹽氧化微生物（NOB）的基因豐度，提高土壤硝化微生物參與氮素循環(huán)的能力，增加土壤氮營養(yǎng)水平。