黃紅寶，何應(yīng)會，黃欣，孫開道，秦波，黃耀恒

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002）

冬青屬（Ilex）隸屬冬青科（Aquifoliaceae），包含近700 個(gè)種[1]，屬下有3 個(gè)亞屬，即冬青亞屬（Subgen.Ilex），多核冬青亞屬（Subgen.Byronia）和落葉冬青亞屬（Subgen.Prinos）。其中冬青亞屬包含的種較多，因而其又被劃分為若干個(gè)組，而每組下面又被劃分為若干個(gè)系[2]。中國分布有豐富的冬青亞屬植物資源，有研究表明在中國范圍內(nèi)已被發(fā)現(xiàn)和鑒別的冬青亞屬植物超過200 種[3，4]。由于近緣種在形態(tài)上的高度相似性，僅僅依靠形態(tài)特征去鑒別它們是困難且容易引起混亂的。近些年，基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)在大量植物中得以應(yīng)用。相較于核基因組，葉綠體基因組多為母系遺傳，具有結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定、進(jìn)化速率適中等特點(diǎn)，能較好的提供物種進(jìn)化信息[5]。同時(shí)，隨著越來越多的植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)被提交到NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)的充實(shí)將進(jìn)一步增強(qiáng)葉綠體基因組比較方法的科學(xué)性和真實(shí)性。

鐵冬青（Ilex rotunda）又名救必應(yīng)、熊膽木等，原產(chǎn)廣西、廣東、福建、浙江等地，為冬青科常綠喬木或灌木[2]。鐵冬青具有多種應(yīng)用價(jià)值：一是材用價(jià)值，它的木材結(jié)構(gòu)緊密，具有香氣，可用作制作器具；二是觀賞價(jià)值，鐵冬青成熟植株枝繁葉茂、樹型美觀，可用作行道樹和庭蔭樹，在結(jié)果期還可營造“滿樹紅果”的景觀；三是藥用價(jià)值，它的莖皮、根葉可入藥，在臨床上常應(yīng)用于抗炎抑菌、抗血栓等。為了明確鐵冬青的系統(tǒng)進(jìn)化地位，本研究通過高通量測序獲得了鐵冬青葉綠體基因組的完整序列，分析其基本特征，并通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹最終確定鐵冬青的系統(tǒng)位置，其研究結(jié)果可為冬青科種質(zhì)資源的鑒定，葉綠體基因組的利用及后續(xù)研究等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為鐵冬青，植株位于廣西壯族自治區(qū)桂林市全州縣（26°09’N，110°51’E）。2021 年11月采集新鮮的嫩葉，用餐巾紙擦拭表面后，放入硅膠中干燥保存。剪取鐵冬青的枝葉制作憑證標(biāo)本（編號為TDQ20211107），并保存于廣西林業(yè)科學(xué)研究院標(biāo)本館中。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 提取及測序

將干燥后的樣品使用改良的CTAB 法[6]提取鐵冬青基因組總DNA，質(zhì)檢合格后，采用Illumina Novaseq 6000 測序平臺測序其葉綠體基因組。

1.2.2 葉綠體基因組組裝和注釋

經(jīng)測序得到Raw reads 數(shù)據(jù)后，利用NGS QC Tool-Kit 軟件[7]過濾低質(zhì)量序列，獲得Clean reads數(shù)據(jù)；使用SPAdes 軟件[8]進(jìn)行從頭組裝得到葉綠體全基因組；使用PGA 工具[9]注釋基因組；最后利用OGDRAW[10]軟件繪制基因組物理圖譜。

1.2.3 葉綠體基因組特征分析

利用MISA 軟件[11]對鐵冬青葉綠體基因組進(jìn)行SSR 位點(diǎn)分析，核苷酸重復(fù)次數(shù)依次設(shè)置為：8、5、4、3、3、3，兩個(gè)SSR 位點(diǎn)間最小長度為100 bp，其余保持默認(rèn)值。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載總計(jì)34 個(gè)物種的葉綠體基因組，其中31 個(gè)物種來自冬青科（Aquifoliaceae），2 個(gè)物種來自青莢葉科（Helwingiaceae），1 個(gè)物種來自毛柴木科（Pennantiaceae），物種拉丁名及葉綠體基因組登錄號詳見表1。利用BLASTn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）從每個(gè)物種的葉綠體基因組中挑選68 個(gè)共有的同源蛋白基因，并使用MAFFT 軟件[12]比對氨基酸序列；接著利用PhyloSuite 軟件ModelFinder 選擇TVM+F+I+G4 模型[13]；最后使用IQtree 2.0 構(gòu)建最大似然（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹[14]，Bootstrap 的值為1000，并選擇Pennantia cunninghamii（NC_049 885.1）作為外類群。

表1 34 個(gè)物種拉丁名及葉綠體基因組登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組基本特征

通過高通量測序和葉綠體基因組物理圖譜構(gòu)建的結(jié)果顯示，鐵冬青葉綠體全基因組為共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)狀分子（圖1），全長157，778 bp，其中IRS（Inverted repeats）長度為26，124 bp，LSC（Large single copy）長度為87，092 bp，SSC（Small single copy）長度為18，438 bp，全基因組GC 含量為37.70%（表2）；共編碼131 個(gè)基因，其中蛋白編碼基因86 個(gè)、rRNA 基因8 個(gè)、tRNA 基因37 個(gè)（表3）。獲得的鐵冬青葉綠體全基因組序列已上傳至NCBI，序列號為OL396585。

表2 鐵冬青葉綠體基因組基本特征

表3 鐵冬青葉綠體全基因組序列的特征值

圖1 鐵冬青葉綠體基因組物理圖譜

2.2 SSR 特征分析

在鐵冬青葉綠體基因組中共檢測到131 個(gè)SSR，其中大多數(shù)為單核苷SSR，共120 個(gè)（占91.60%），其中A/T 重復(fù)117 個(gè)，C/G 重復(fù)3 個(gè)；二核苷酸SSR 4 個(gè)（占3.05%），為AT/AT 重復(fù)；三核苷酸SSR 1 個(gè)（占0.76%），為AAT/ATT 重復(fù)；四核苷酸SSR 4 個(gè)（占3.05%），其中AAAG/CTTT 重復(fù)1 個(gè)，AAAT/ATTT 重復(fù)3 個(gè)；六核苷酸SSR 2 個(gè)（占1.53%），均為AATACT/AGTATT 重復(fù)（表4）。

表4 鐵冬青葉綠體全基因組SSR 信息

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于34 個(gè)物種葉綠體基因組共有的同源蛋白（68 個(gè)）信息，構(gòu)建了最大似然（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹。聚類結(jié)果顯示（圖2），本研究的鐵冬青測試樣品（OL396585）與已在NCBI 公開發(fā)表的鐵冬青（MT764244.1）聚在一起，支持率為100%；且鐵冬青隸屬于冬青亞屬單序冬青組（Sect.Lioprinus），與毛冬青（I.pubescens，KX462467.1）和網(wǎng)脈多脈冬青（I.polyneura，KX462468.1）親緣關(guān)系較近。

圖2 基于葉綠體基因組同源蛋白的34 個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

本研究的鐵冬青樣品葉綠體全基因組長度為157，778 bp，與在NCBI 上已發(fā)表的鐵冬青其他樣品葉綠體基因組NC_056200.1（157743 bp）、MZ561473.1（157776 bp）、MT764244.1（157 780 bp）長度接近，同一物種4 個(gè)不同樣品的葉綠體全基因組長度差異范圍為2～37 bp；不同樣品基因組長度上的差異可能是由于不同地理種源的遺傳差異引起的。

SSR 標(biāo)記具有共顯性和高多態(tài)性[15]，已作為一種可靠的分子標(biāo)記被應(yīng)用于植物群體遺傳學(xué)[16]、種質(zhì)鑒別[17]、遺傳圖譜構(gòu)建[18，19]等研究中。本研究分析鑒定出鐵冬青葉綠體全基因組種共含有131 個(gè)SSR，其中單核苷SSR 的數(shù)量為120 個(gè)，占總數(shù)的91.60%。豐富的SSR 位點(diǎn)可用于后續(xù)開發(fā)高多態(tài)性的SSR 標(biāo)記引物，并作為鐵冬青種內(nèi)遺傳多樣性研究和物種鑒別的工具。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹能將分子數(shù)據(jù)應(yīng)用于研究物種間發(fā)育關(guān)系。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，本研究的鐵冬青測試樣品與NCBI 上已發(fā)表的鐵冬青MT764244.1 聚在一起（支持率為100%），表明物種鑒別及其鑒別方法正確；其中鐵冬青與近緣種毛冬青和網(wǎng)脈多脈冬青（I.polyneura）聚在一起，表明它們具有較近的親緣關(guān)系和類似的物種起源，這與Chen 等[2]利用葉綠體基因組全長序列研究所得出的結(jié)論一致。研究結(jié)果進(jìn)一步確定了鐵冬青的系統(tǒng)位置，同時(shí)也印證了基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析方法的可行性和可靠性。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果進(jìn)一步顯示，30 個(gè)冬青科植物分為分支Ⅰ和分支Ⅱ兩大支（Clade），分支Ⅰ含有14 個(gè)物種，包括9 個(gè)傳統(tǒng)分類方法的冬青亞屬（Subgen.Ilex）物種及5 個(gè)“未確定（Uncertain）”物種；分支Ⅱ含有16 個(gè)物種，包括11 個(gè)傳統(tǒng)分類方法的冬青亞屬物種和5 個(gè)落葉冬青亞屬（Subgen.Prinos）物種；即同屬于冬青亞屬的物種在系統(tǒng)發(fā)育樹中分屬于不同的兩大分支（Clade）?？梢?，基于冬青科葉綠體基因組的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與傳統(tǒng)的分類研究結(jié)果出現(xiàn)了不一致的情況；而在Alexandra 等利用分子標(biāo)記開展的冬青科系統(tǒng)發(fā)育研究中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果[20]，其具體的原因有待于深入研究。