李建鳳 趙佳楨* 沈義媛 關(guān)淑文 韓思雨 熊本海 王 夢 楚康康 方洛云 童津津** 蔣林樹**

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.首農(nóng)集團，北京 100192)

奶牛由于采食后瘤胃發(fā)生厭氧發(fā)酵，運動和產(chǎn)奶等代謝產(chǎn)熱增加，當(dāng)代謝產(chǎn)熱超過自身的散熱能力時就會造成奶牛熱應(yīng)激。尤其在夏天，外界溫度和濕度制約了奶牛自身體表的散熱，會加劇奶牛熱應(yīng)激的發(fā)生。熱應(yīng)激會造成機體的氧化應(yīng)激，體內(nèi)過氧化物增加，膜系統(tǒng)損傷，免疫力降低[1]；同時奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells，BMECs)中熱休克蛋白的mRNA表達增強，影響B(tài)MECs活性和凋亡，進而影響奶牛乳腺的健康狀況[2-4]。當(dāng)奶牛消耗過多的能量來調(diào)節(jié)體溫時產(chǎn)奶的能量就減少，極大降低了奶牛的生產(chǎn)效益。目前緩解熱應(yīng)激的措施主要有培育耐熱品種、牛舍防暑降溫、調(diào)整飼糧組成和使用抗熱應(yīng)激添加劑等[5]。有研究表明，植物提取物對奶?？篃釕?yīng)激兼有藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的作用，緩解熱應(yīng)激反應(yīng)的同時，還有無殘留和無污染的優(yōu)點，是奶牛抗熱應(yīng)激的一個新途徑[6]。吳德峰等[7]也發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合中草藥添加劑有抗熱應(yīng)激作用，同時提高奶牛的產(chǎn)奶性能。目前研究者已從不同的植物中分離出多種類黃酮，并證明其具有顯著的藥理活性[8]。竹葉黃酮(bamboo leaf flavonoids，BLF)分子質(zhì)量小，成本較低，具有提高奶牛生產(chǎn)性能和抗氧化能力的作用[9]，所以可將其運用于緩解奶牛熱應(yīng)激。

BLF結(jié)構(gòu)中的內(nèi)鄰位酚羥基極易被氧化，從而降低自由基的產(chǎn)生，加快自由基的清除，發(fā)揮抗氧化的效果[10]。核因子紅細胞相關(guān)因子2(Nrf2)是自身抗氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)因子，Nrf2信號通路是目前最重要的抗氧化通路，通路激活劑和抗氧化劑的開發(fā)對于緩解氧化應(yīng)激損傷、提高生產(chǎn)性能具有重要的意義[11]。此外，據(jù)報道Nrf2是活性氧(ROS)在細胞中的主要傳感器，過量的ROS會導(dǎo)致Nrf2的連續(xù)激活并在細胞核中積累，啟動下游參與抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號通路是機體抵抗內(nèi)環(huán)境氧化和化學(xué)刺激的一條重要的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。BLF能夠干預(yù)上調(diào)Nrf2基因的表達，以啟動抗氧化防御系統(tǒng)抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕HepG2細胞的損傷。然而，BLF是否對熱應(yīng)激引起B(yǎng)MECs的損傷具有保護作用尚未明確。因此，本研究將通過對熱應(yīng)激BMECs添加BLF，探究其對BMECs的影響及其作用機制，以期為BLF在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BMECs由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室惠贈；竹葉選購自陜西某天然制品有限公司，BLF參照張英[13]的方法由本實驗室采用熱回流法自行提取，提取效率1%～3%，總黃酮含量為20%～26%；DMEM/F12培養(yǎng)基(11995065,11765054)、澳洲胎牛血清(FBS,10099141)、青霉素/鏈霉素溶液(Pen Strep,15140-122)、Hank’s 平衡鹽溶液(HBSS,14175095)、0.25%胰蛋白酶-二氨基乙烷四乙酸(EDTA)(25200056)購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購自北京沃比森科技有限公司；ROS檢測試劑盒(S0033S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性定量測定試劑盒(E1020)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(ZP327-1)購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒(A001-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒(A005-1-2)、丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)試劑盒(M34652)購自Thermo公司；總RNA提取試劑盒[Pure Link RNA小量試劑盒(12183018A)]購自賽默飛公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ購自日本TaKaRa公司。熱休克蛋白70(HSP70)抗體(sc-32239)購美國Santa Cruze公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)-抗熒光淬滅封片液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

將BMECs置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%，進行細胞傳代，傳至3～5代，然后更換含有不同濃度的(0、1、5和10 μg/mL)BLF的DMEM/F-12(含有10% FBS)培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)12 h后，于42 ℃細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，恢復(fù)12 h，收集樣本檢測。將不添加BLF、37 ℃處理的BMECs設(shè)為對照組，不添加BLF、42 ℃處理的BMECs設(shè)為熱應(yīng)激組，以添加不同濃度的BLF(1、5、10 μg/mL)、42 ℃處理的BMECs設(shè)為試驗組，每組3個重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 LDH法檢測BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷的保護作用

96孔板中以每孔200 μL接種BMECs的懸浮液，當(dāng)細胞密度達到80%時，吸出完全培養(yǎng)液，用不含雙抗的D’Hanks緩沖液洗2遍，按分組分別加入150 μL含有不同濃度(0、1、5和10 μg/mL)的BLF細胞培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h后，42 ℃熱應(yīng)激1 h，恢復(fù)12 h。加入15 μL LDH檢測液，孵育2 h，在450 nm處測定吸光度值。

1.3.2 AnnexinV-FITC法檢測BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs凋亡的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理后，按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，200 μL含有5 μL Annexin V-FITC的結(jié)合緩沖液在室溫和黑暗條件下染色20 min，在4 ℃的黑暗中再染色15 min，然后加入10 μL PI，用流式細胞儀進行檢測。

1.3.3 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后ROS含量的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理后，加入二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)，在37 ℃孵育30 min后，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。然后用流式細胞儀檢測20 000個細胞的2′,7′-二氯熒光素(DCF)熒光分布，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.3.4 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后MMP水平的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行處理和培養(yǎng)后，按照JC-1 MMP水平分析試劑盒進行操作。加入JC-1染料工作液，37 ℃孵育30 min，之后在37 ℃下用10 μmol/L的細胞凋亡誘導(dǎo)劑(CCCP)處理細胞30 min，再用JC-1染料工作液于37 ℃孵育30 min后，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的JC-1染料，使用流式細胞儀在530 nm處測量MMP水平。

1.3.5 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后抗氧化酶活性的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)、處理后，按照T-SOD、GSH-Px和MDA試劑盒說明，使用酶標(biāo)儀分別在532、550和412 nm的吸收波長下測定MDA、T-SOD和GSH-Px的吸光度，并計算MDA含量及T-SOD和GSH-Px活性。

1.3.6 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷中HSP70蛋白表達的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行細胞爬片培養(yǎng)處理后，吸取上清液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，晾干后貼于載玻片上，用PBS沖洗，加入2%牛血清白蛋白(BSA)封閉抗原30 min；滴加用PBS稀釋(1∶100)的一抗，4 ℃孵育過夜；次日用PBS沖洗3次，滴加用PBS稀釋(1∶1 000)的FITC標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗，37 ℃避光孵育60 min；PBS沖洗3次，滴加DAPI-抗熒光淬滅封片液，通過Leica TCS SP8X激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.7 BLF對熱應(yīng)激BMECs內(nèi)凋亡相關(guān)基因及Nrf2通路相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)、處理和分組。每孔加入總RNA提取試劑Trizol 500 μL，吹打均勻，轉(zhuǎn)移到EP管中；加0.1 mL的氯仿，混勻，4 ℃靜置2 min，12 000 r/min離心15 min；取上層無色水相加入到另一EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；4 ℃，離心棄上清，75%的乙醇洗滌2次；離心5 min去上清，室溫干燥3～5 min；加50 μL DEPC水溶解，獲得總RNA，-80 ℃下保存。取出適量RNA，用Nanodrop分光光度計檢測吸光度(OD)值，分析RNA的純度與濃度，OD260/OD280的值在1.8～2.0可用于后續(xù)試驗分析。依據(jù)TAKARA BIO NIC cDNA試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用的基因引物序列見表1。看家基因為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，采用-2△△Ct計算目的基因的mRNA相對表達量。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

續(xù)表1基因GenesGenBank登錄號GenBank accession No.引物序列Primer sequences (5′—3′)熱休克蛋白70HSP70NM_203322.2F:CGTGCTCATCTTTGATCTGGR:TGGCTGATGTCCTTCTTGTG熱休克蛋白90HSP90 NM_001079637.1F: CCAAGTCTGGCACTAAAGR: GAAGACTCCCAAGCATAC兔抗人單克隆抗體BaxNM_173894.1F: TGGACATTGGACTTCCTTCGR:CCAGCCACAAAGATGGTCACB淋巴細胞瘤/白血病-2Bcl-2NM_001166486.1F:GGATGACCGAGTACCTGAACCR:GCCCAGATAGGCACCCAG半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3Caspase-3BC123503F:AAGCCATGGTGAAGAAGGAAR:GGCAGGCCTGAATAATGAAA環(huán)氧合酶-2COX-2NM_174445F:TCCACCAACTTATAATGTGCACR:GGCAGTCATCAGGCACAGGA核因子紅細胞相關(guān)因子2Nrf2NM_001011678.2F:AGGACATGGATTTGATTGACR:TACCTGGGAGTAGTTGGCA 血紅素加氧酶-1HO-1NM_001014912.1F:GGCAGCAAGGTGCAAGAR:GAAGGAAGCCAGCCAAGAG硫氧化還原蛋白還原酶1Txnrd1NM_174625.3F:GTGTTCACGACTCTGTCGGTR:CTGCCTTCCACGAATCACCT NADPH-醌氧化還原酶1NQO1NM_001034535.1F:GGTGCTCATAGGGGAGTTCG R:GGGAGTGTGCCCAATGCTAT 半胱氨酸攝取轉(zhuǎn)運蛋白xCTXM_002694373.2F:GATACAAACGCCCAGATATGC R:TGATGAAGCCAATCCCTGTA

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010進行初步整理分析，然后用SPSS 21.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)及多重比較。試驗結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，其中P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 LDH法檢測BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷的保護作用

LDH是存在于細胞質(zhì)的重要酶類，當(dāng)細胞膜受到損傷后會被釋放胞外。本試驗通過檢測LDH釋放率來反映BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷的保護作用。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，高溫作用于BMECs發(fā)生熱應(yīng)激損傷后，LDH釋放率顯著增強(P<0.05)(圖1)。當(dāng)發(fā)生熱應(yīng)激損傷的BMECs組中，添加1、5、10 μg/mL BLF后，與熱應(yīng)激組相比，LDH釋放率顯著降低(P<0.05)，其中5 μg/mL BLF組的LDH的釋放率最低，由此表明BLF抑制了LDH釋放，對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞損傷具有保護作用。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value bars with different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化 損傷后釋放LDH的影響Fig.1 Effects of BLF on LDH release of BMECs induced by heat stress after oxidative damage

2.2 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs凋亡的影響

Annexin V和PI雙重染色將細胞分為3類：活細胞(Annexin V 和 PI 陰性)、早期凋亡細胞(Annexin V 陽性，PI 陰性)和晚期凋亡/壞死細胞(Annexin V 和 PI 陽性)(圖2-A)。熱應(yīng)激損傷后，BMECs的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率極顯著升高(P<0.01)。與對照組相比，在42 ℃條件下細胞凋亡率極顯著提高(P<0.01)；添加5、10 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，當(dāng)熱應(yīng)激發(fā)生時，可極顯著降低細胞早期凋亡率和晩期凋亡/壞死率(P<0.01)(圖2-B)。在熱應(yīng)激條件下，添加1、5和10 μg/mL的BLF，與對照組相比，細胞總凋亡率無顯著差異(P>0.05)，表明BLF可以減少熱應(yīng)激造成的BMECs的凋亡。

A圖為流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染結(jié)果；B圖為BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs凋亡的影響。Figure A showed the results of Annexin V/PI double staining by flow cytometry; Figure B showed the effects of BLF on apoptosis by heat stress induced injury of BMECs.圖2 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs凋亡的影響Fig.2 Effects of BLF on apoptosis of BMECs induced by heat stress

2.3 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后ROS含量的影響

由圖3可知，與對照組相比，熱應(yīng)激組中ROS含量極顯著增加(P<0.01)，但添加1、5和10 μg/mL濃度BLF可極顯著減少細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.01)；值得注意的是5和10 μg/mL的BLF組間，細胞內(nèi)的ROS含量無顯著差異(P>0.05)。由此可見，BLF可減少熱應(yīng)激情況下BMECs內(nèi)產(chǎn)生ROS，抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生的氧化損傷。

圖3 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后ROS含量的影響Fig.3 Effects of BLF on ROS content of BMECs induced by heat stress after oxidative damage

2.4 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后MMP水平的影響

如圖4所示，與對照組相比，熱應(yīng)激組的BMECs內(nèi)MMP水平顯著增加(P<0.05)。但在熱應(yīng)激條件下，添加1、5、10 μg/mL的BLF與BMECs共培養(yǎng)，可顯著降低MMP水平(P<0.05)，其中添加5 μg/mL的BLF保護作用最好。

2.5 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，與對照組相比，熱應(yīng)激組中的T-SOD和GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)， MDA的含量顯著升高(P<0.05)；與熱應(yīng)激組相比，添加BLF后，T-SOD和GSH-Px的活性顯著升高(P<0.05)，MDA的含量顯著降低(P<0.05)。由此可見，BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷具有保護作用，而且5 μg/mL的BLF組與其他組相比，效果更好。

圖5 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的BMECs的抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effects of BLF on antioxidant enzyme activity of BMECs induced by heat stress

2.6 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷中HSP70蛋白表達的影響

應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察HSP70蛋白表達的變化(圖6)，與對照組相比，F(xiàn)ITC(綠色熒光)標(biāo)記的HSP70在熱應(yīng)激組中熒光強度較強，而添加BLF處理后，HSP70的熒光強度介于對照組與熱應(yīng)激組之間。結(jié)果表明，BLF處理可以保護由熱應(yīng)激引起的細胞損傷。

2.7 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后凋亡相關(guān)基因及Nrf2信號通路中相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響

由表2可知，與對照組相比，熱應(yīng)激組中的熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)、HSP70和熱休克蛋白90(HSP90)的mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01)。與熱應(yīng)激組相比，添加1、5和10 μg/mL的BLF后，HSF1、HSP70和HSP90的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)，表明BLF可以抑制BMECs內(nèi)熱休克蛋白相關(guān)基因的表達從而減輕機體的熱應(yīng)激反應(yīng)。此外，與對照組相比，熱應(yīng)激組中兔抗人單克隆抗體(Bax)、Bax/B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bax/Bcl-2)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相對表達量顯著增加(P<0.05)，而Bcl-2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。與熱應(yīng)激組相比，添加BLF后，Bax、Bax/Bcl-2、COX-2和Caspase-3的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，由此可見，BLF對凋亡相關(guān)基因的表達具有一定的抑制作用。此外，我們又檢測了BLF對Nrf2信號通路中相關(guān)調(diào)節(jié)基因mRNA相對表達量的影響。與對照組相比，熱應(yīng)激組中的Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)、半胱氨酸攝取轉(zhuǎn)運蛋白(xCT)、硫氧化還原蛋白還原酶1(Txnrd1)和NADPH-醌氧化還原酶1(NQO1)的mRNA相對表達量極顯著降低(P<0.01)。與熱應(yīng)激組相比，添加1、5和10 μg/mL的BLF均能極顯著上調(diào)Nrf2、HO-1、xCT、Txnrd1和NQO1的mRNA相對表達量(P<0.01)，而且極顯著高于對照組(P<0.01)。由此可見，BLF通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子和Nrf2信號通路中相關(guān)基因的表達，從而對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的BMECs氧化損傷具有保護作用。

表2 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后相關(guān)基因mRNA相對表達量的影響Table 2 Effects of BLF on mRNA relative expression level of related genes of BMECs induced by heat stress after oxidative damage

3 討 論

熱應(yīng)激會誘導(dǎo)細胞發(fā)生多種變化，包括細胞和膜結(jié)構(gòu)在形態(tài)和功能上的改變及蛋白質(zhì)合成、DNA和RNA的聚合、轉(zhuǎn)錄和翻譯受到抑制等，導(dǎo)致細胞功能發(fā)生異常，最終影響生物性能[14]。而且，熱應(yīng)激還會打破機體的氧化平衡狀態(tài)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生過多自由基，引起機體抗氧化機能紊亂[15]。近年來，黃酮類物質(zhì)因具有較強的抗氧化活性，且與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的依賴關(guān)系，可以對BMECs產(chǎn)生抗氧化的保護作用[16-17]而受到了廣泛關(guān)注。據(jù)報道，BLF具有多種生理功能，除抗氧化作用以外，還兼具抗菌、抑菌的功效和一定的營養(yǎng)保健作用，尤其在奶牛生產(chǎn)中，BLF可以通過改善BMECs的活性提高奶牛產(chǎn)奶量、乳脂率及乳蛋白含量[14,18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和熱應(yīng)激組相比，添加1、5、10 μg/mL的BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的BMECs中T-SOD和GSH-Px活性均有提高，而MDA的含量有所下降，這與馮磊等[19]研究結(jié)果相一致，表明BLF具有明顯降低脂質(zhì)過氧化、升高SOD和GSH-Px活性的作用。因此，本研究結(jié)果為BLF改善熱應(yīng)激損傷作用提供了理論依據(jù)。

A圖為流式細胞儀檢測MMP的結(jié)果(FITC-A，綠色熒光；PE-A，紅色熒光)；B圖為BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后MMP水平的影響。Figure A showed the results of MMP by flow cytometry (FITC-A, green fluorescence; PE-A, red fluorescence); Figure B showed the effects of BLF on MMP level of BMECs induced by heat stress after oxidative damage.圖4 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷后MMP水平的影響Fig.4 Effects of BLF on MMP level of BMECs induced by heat stress after oxidative damage

熱應(yīng)激是重要的誘導(dǎo)細胞凋亡的應(yīng)激因素之一，細胞在受到熱應(yīng)激時更容易發(fā)生凋亡[20-22]。Zou等[23]報道熱應(yīng)激處理BMECs 1 h后，細胞存活率降低，細胞凋亡及壞死率顯著增加。這與本試驗結(jié)果相一致，熱應(yīng)激損傷后的BMECs凋亡率顯著升高；但當(dāng)添加1、5、10 μg/mL BLF后，細胞早期調(diào)亡率和總凋亡率均下降；值得注意的是，添加5 μg/mL BLF時，熱應(yīng)激損傷的BMECs的早期凋亡率與正常組無顯著差異。由此可見，BLF對熱應(yīng)激表現(xiàn)了抗性，提高了相對細胞存活率對BMECs的保護作用。此外，有研究表明處于熱應(yīng)激狀態(tài)下的動物，機體內(nèi)MDA和ROS的含量顯著上升，而SOD和GSH-Px的活性顯著下降[24-26]。本團隊前期研究結(jié)果表明，在奶牛生產(chǎn)中飼喂BLF提取物后，可顯著提高奶牛血清中SOD活性，降低ROS和MDA的含量[27]。在本試驗中時，添加BLF可顯著降低熱應(yīng)激損傷發(fā)生時SOD活性和MDA的含量，表明BLF對BMECs熱應(yīng)激損傷發(fā)生時具有保護作用，而且5 μg/mL的BLF效果最好。據(jù)報道，MMP水平不僅在細胞凋亡過程中顯著降低[28-32]，而且過量的ROS的產(chǎn)生會破壞呼吸鏈，增加質(zhì)子的線粒體通透性，從而導(dǎo)致MMP水平的下降[29,31]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加BLF顯著降低熱應(yīng)激后BMECs的ROS含量和MMP水平，其中5 μg/mL的BLF效果最好，進一步證明了BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化損傷具有保護作用。

DAPI：4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 4′,6-diamidino-2-phenylindole；FITC：異硫氰酸熒光素 fluorescein isothiocyanate；Merged：合并。圖6 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)的BMECs中HSP70蛋白表達的影響Fig.6 Effects of BLF on HSP70 protein expression of BMECs induced by heat stress

此外，大量研究結(jié)果表明，細胞凋亡的信號調(diào)控與Bcl-2家族、Caspase家族和線粒體密切相關(guān)[33-35]。線粒體內(nèi)有許多凋亡信號聚集用于控制細胞凋亡，特別是Bcl-2家族蛋白中的Bax在線粒體凋亡調(diào)控中又起著關(guān)鍵作用。而且，據(jù)報道，Bax/Bcl-2的比值升高會誘導(dǎo)Caspase-3的裂解和表達量增多，從而引起細胞發(fā)生凋亡[36]。在本研究中，熱應(yīng)激損傷使BMECs凋亡相關(guān)基因Bax、Bax/Bcl-2、COX-2和Caspase-3的mRNA相對表達量均升高，而Bcl-2的mRNA相對表達量降低；但是，對熱應(yīng)激的BMECs中添加BLF后，細胞內(nèi)BaxmRNA相對表達量和Bax/Bcl-2的比值都有所降低，且5 μg/mL的BLF效果最好。由此我們推測，這些變化可能都是通過抑制Caspase信號通路的激活從而降低細胞凋亡率，但具體的調(diào)控機制有待進一步的研究。據(jù)報道，HSP表達的增加可以保護細胞免受各種損傷，尤其是在耐熱性方面[32]，其中HSP70是家族中高度誘導(dǎo)的HSP[37]，HSP90是抵抗熱應(yīng)激的主要防御蛋白[38-39]。本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加BLF后，在熱應(yīng)激條件下BMECs中的HSF1、HSP70和HSP90的mRNA相對表達量降低，表明BLF預(yù)處理既可以通過誘導(dǎo)HSF1、HSP70和HS90基因的表達來增加細胞的耐熱性，又可顯著降低熱應(yīng)激BMECs的凋亡率、ROS含量及MMP水平，證明BLF可抑制細胞凋亡，對處于熱應(yīng)激狀態(tài)下的BMECs具有保護作用。

Nrf2是體內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)抗氧化相關(guān)基因的表達[40]。據(jù)報道，Nrf2/HO-1級聯(lián)反應(yīng)對病理生理過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有顯著的抑制效果，當(dāng)Nrf2/HO-1表達上調(diào)時，ROS和促炎因子含量等顯著減少[41]。值得注意的是，竹葉中的主要生物活性成分是以異葒草苷、葒草苷、異牡荊苷和牡荊苷為代表的C-糖苷黃酮類化合物[42-44]，具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、增強免疫力和預(yù)防退行性疾病等生物學(xué)功效[45]。而且有研究顯示，牡荊苷和葒草苷均能夠減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)，表明牡荊苷和葒草苷通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激在抗ALI中發(fā)揮重要作用，這可能與上調(diào)Nrf2信號通路基因表達密切相關(guān)[46-47]。Yu等[48]的研究表明，BLF能夠上調(diào)Nrf2、HO-1、醌氧化還原酶1(NQO1)基因的表達，從而啟動抗氧化防御反應(yīng)，以對抗氧化應(yīng)激。與本研究結(jié)果相一致，隨著熱應(yīng)激發(fā)生導(dǎo)致ROS的聚集引起Nrf2的積累并促進其核轉(zhuǎn)位，BLF啟動了參與抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵事件的基因的轉(zhuǎn)錄，通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制ROS生成，從而抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的BMECs氧化應(yīng)激損傷，使機體內(nèi)最終達到氧化和抗氧化反應(yīng)的平衡(圖7)。

BLF：竹葉黃酮 bamboo leaf flavonoids;Bax：兔抗人單克隆抗體BCL2-associated X rabbit anti-human monoclonal antibody BCL2-associated X；Bcl-2：B淋巴細胞瘤/白血病-2 B-cell lymphoma-2; Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 cysteine aspartate protease-3; COX-2:環(huán)氧合酶-2 cyclooxygenase-2; ROS:活性氧reactive oxygen species; mTOR:哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin; S6K1:核糖體p70S6 ribosome p70S6; EIF-4EBP1:真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein; CyclinD1:細胞周期素D1; HSF1:熱休克轉(zhuǎn)錄因子1 heat shock transcription factor 1; HSP70:熱休克蛋白70 heat shock protein 70; HSP90:熱休克蛋白90 heat shock protein 90; Nrf2:核因子紅細胞相關(guān)因子2 nuclear factor erythroid 2 related factor 2; HO-1:血紅素加氧酶-1 hemeoxygenase-1; xCT:半胱氨酸攝取轉(zhuǎn)運蛋白cysteine uptake transporter; NQO-1:NADPH-醌氧化還原酶1 NADPH-quinone oxidoreductase 1; Txnrd1:硫氧化還原蛋白還原酶1 thioredoxin reductase 1。圖7 BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷的保護作用概略圖Fig.7 Graphical effects of BLF protective function on oxidative damage of BMECs induced by heat stress

4 結(jié) 論

添加BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs的氧化損傷，可抑制ROS生成、減少細胞凋亡和線粒體損傷。添加不同濃度的BLF上調(diào)Nrf2、HO-1、xCT、Txnrd1和NQO1的mRNA相對表達量，可通過Nrf2信號通路的調(diào)節(jié)有效減輕熱應(yīng)激對BMECs的氧化損傷，且添加5 μg/mL BLF對熱應(yīng)激誘導(dǎo)BMECs氧化損傷的保護效果最好。