鄭哲浩， 禹 宸， 邱林燕， 江蘇萱， 吳曉蓉， 毛曉銳， 包陳潔， 韓曉祥， 修麗麗

(浙江工商大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系，杭州 310018)

紫蘇(PerillafrutescensL. Britton)是唇形科(Labiatae)紫蘇屬一年生短日草本植物，又名赤蘇、紅蘇、香蘇等，是國(guó)家衛(wèi)生部首批頒布的藥食兩用中藥之一[1]。紫蘇種植地區(qū)廣泛，美國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家對(duì)紫蘇已經(jīng)達(dá)到了商業(yè)化規(guī)模的栽培與利用。紫蘇葉精油是紫蘇葉經(jīng)提取后的揮發(fā)性油狀液體，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌、抗抑郁、降血壓等多種活性[2-4]，在食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。氣候、環(huán)境、品種、產(chǎn)地和提取方法的不同，紫蘇精油的化學(xué)組成成分和含量也大有不同，從而影響了紫蘇精油的生物活性和應(yīng)用[5]。

傳統(tǒng)的精油提取法主要是水蒸汽蒸餾法，此方法雖然綠色安全且操作簡(jiǎn)單，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低、耗能高等缺點(diǎn)[6]。隨后開發(fā)的許多提取技術(shù)，如超聲波輔助提取法[7]、微波輔助提取法[8，9]、酶輔助提取法[10,11]、超臨界CO2提取法[12,13]等廣泛應(yīng)用到功能因子提取研究中，其中微波和超聲波輔助提取法因操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)高效、綠色無污染、對(duì)設(shè)備和操作的要求低而受到關(guān)注。近年來，微波-超聲波協(xié)同輔助提取技術(shù)得到快速發(fā)展，該技術(shù)是將微波和超聲波結(jié)合，利用了微波的穿透效應(yīng)和超聲波的空化作用共同作用于提取物，提高提取效率，特別應(yīng)用于不穩(wěn)定天然產(chǎn)物提取[14-16]。郭玲玲等[14]在固定超聲功率的條件下，優(yōu)化微波-超聲波協(xié)同輔助提取紫蘇黃酮工藝，在較短提取時(shí)間和較低提取溫度下，得到較好的紫蘇黃酮提取率。王穎等[15]優(yōu)化了超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取白胡椒精油，研究發(fā)現(xiàn)利用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取精油效率顯著優(yōu)于常規(guī)提取方法。應(yīng)瑞峰等[16]對(duì)比研究了傳統(tǒng)熱水提取法與超聲波微波復(fù)合輔助提取法對(duì)桑黃多糖提取率的影響，結(jié)果表明，協(xié)同提取法有效提高了提取率，多糖得率最高達(dá)到10.6%。本實(shí)驗(yàn)采用微波-超聲波協(xié)同方式輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油，優(yōu)化提取工藝，并對(duì)精油的組成成分以及抑菌活性進(jìn)行研究，研究成果為紫蘇精油的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

干紫蘇葉：選自廣西南寧的新鮮紫蘇葉，洗凈烘干，粉碎為40目，備用。NaCl、Na2SO4、石油醚、無水乙醇等(均為AR)。LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(均為BR)。

800Y多功能粉碎機(jī)，XH-300A微波-超聲波組合萃取儀，7890A-5975C安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2 紫蘇精油提取

1.2.1 微波輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油

稱取40目篩紫蘇葉粉末40 g置于圓底燒瓶中，加入適量的3%NaCl溶液，將其置于微波-超聲波組合萃取儀中，改變微波操作條件優(yōu)化紫蘇精油提取工藝，同時(shí)利用蒸餾萃取法提取精油6 h。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Benhnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波提取工藝。提取結(jié)束后用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，過濾，旋蒸，得紫蘇精油，進(jìn)而計(jì)算紫蘇精油提取率。

紫蘇精油提取率=(紫蘇精油質(zhì)量/紫蘇葉粉末質(zhì)量)×100%

1.2.2 微波-超聲波輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油

在微波優(yōu)化條件，即料液比1∶6，微波功率933 W條件下，在微波-超聲波組合萃取儀中改變超聲條件優(yōu)化紫蘇精油提取工藝。單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波-超聲波輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油。

1.3 紫蘇精油GC-MS分析

在7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(DB-WAX色譜柱，60 m×0.25 mm×0.5 μm)上對(duì)紫蘇精油組成進(jìn)行分析，獲得GC-MS分析總離子流圖。通過人工圖譜解析及NISTl4譜庫(kù)檢索定性，并利用面積歸一法定量分析各成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。GC-MS分析條件：進(jìn)樣口溫度240 ℃，進(jìn)樣量0.2 μL，分流比為100∶1，恒流模式，柱流速1 mL/min；初始柱溫30 ℃，保持10 min，以2 ℃/min升到240 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件為離子源EI，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)量數(shù)掃描范圍33～500 amu。

1.4 紫蘇精油抑菌活性測(cè)定

菌株處理：將供試菌劃線平板培養(yǎng)進(jìn)行活化。然后挑取單菌落接種到適量的LB肉湯中搖床二次活化，用生理鹽水配制菌懸液，菌落數(shù)約為1×106CFU/mL，搖勻。

精油樣品處理：紫蘇精油和無水乙醇體積比1∶1混合成精油樣品，無水乙醇作為助溶劑使精油更易與液體培養(yǎng)基混合，達(dá)到最佳抑菌效果。

MBC(最小殺菌濃度)測(cè)定：采用二倍稀釋法，即肉湯稀釋法測(cè)定紫蘇精油最小殺菌濃度。取滅菌試管按每組7支進(jìn)行分組，向每組第1支試管中加入精油樣品和肉湯，試管混合物體積8 mL，精油體積比20 μL/mL，混勻后依次取4 mL移入下一管進(jìn)行梯度稀釋至第5號(hào)試管。1～5號(hào)試管精油體積比分別為20、10、5、2.5、1.25 μL/mL，分別向各試管加入菌懸液。第6號(hào)試管加液體培養(yǎng)基和菌液，作為對(duì)照；第7號(hào)試管加液體培養(yǎng)基、菌液和無水乙醇，作為乙醇對(duì)照。搖床恒溫培養(yǎng)24 h，生理鹽水稀釋，取100 μL涂布平板培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)皿中無明顯菌落生長(zhǎng)最小樣品體積比定義為樣品對(duì)供試菌的MBC。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

響應(yīng)面分析采用軟件Design-Expert 6.0.5，其他分析采用Excel、Origin 2018和SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及顯著性分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫蘇精油提取工藝確定

2.1.1 微波輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可見，當(dāng)料液比從1∶4增加到1∶6時(shí)，紫蘇精油提取率顯著增加；當(dāng)料液比為1∶6時(shí)，紫蘇精油提取率達(dá)最大值為1.91%；進(jìn)一步增加料液比，即增加溶劑使用量，紫蘇精油提取率降低，這是因?yàn)槿軇┝康脑黾?，精油與溶劑接觸面積增大，傳質(zhì)速度提高，提取率增加；而溶劑量過大，精油會(huì)在溶劑中部分溶解，導(dǎo)致提取率較低[17]。從提取效率，提取成本等方面綜合考慮，將1∶6作為最佳提取料液比。

圖1 微波輔助不同提取條件對(duì)紫蘇精油提取率的影響

由圖1可見，紫蘇精油提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為6 min時(shí)，紫蘇精油提取率最大。進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間，紫蘇精油提取率下降。微波快速、均勻的加熱功能，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行破碎從而加速溶劑對(duì)精油的溶解和滲透，使紫蘇精油快速釋放，提高精油含量。而過長(zhǎng)的提取時(shí)間，不僅增加雜質(zhì)的溶出量，使產(chǎn)品分離困難，同時(shí)也造成設(shè)備損耗，增加維護(hù)成本。因此，確定提取時(shí)間為6 min。

由圖1可知，隨微波功率的增加，紫蘇精油提取率增加，當(dāng)微波功率為900 W時(shí)，紫蘇精油提取率最高，為2.1 %。繼續(xù)增加提取功率，紫蘇精油提取率下降。適當(dāng)?shù)奈⒉üβ氏?，微波作用引起的極性振蕩使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂，從而促進(jìn)紫蘇精油浸出到溶劑中，但微波功率過高，易產(chǎn)生局部過熱現(xiàn)象，導(dǎo)致紫蘇精油揮發(fā)及分解。從提取效率、節(jié)能和安全角度考慮，選用微波900 W進(jìn)行紫蘇精油提取。

由圖1可見，紫蘇精油提取率隨提取溫度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，紫蘇精油提取率達(dá)最大值為2.1 %；繼續(xù)增加提取溫度，紫蘇精油提取率下降。提取溫度的升高增加了溶劑分子的活性，提高了擴(kuò)散系數(shù)，同時(shí)也增加紫蘇精油的溶解度，提高傳質(zhì)效率。但溫度過高會(huì)使紫蘇精油不穩(wěn)定，易揮發(fā)分解，從而降低紫蘇精油提取率。因此選擇60 ℃進(jìn)行提取工藝研究。

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取紫蘇精油工藝

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以紫蘇精油提取率為指標(biāo)，選取微波溫度、微波功率、微波時(shí)間這3個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)曲面分析方法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，選用料液比為1∶6。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 微波輔助提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，所得響應(yīng)面二次回歸方程方差分析見表3。由此可得二次回歸方程為：

Y=2.09+0.1A+0.074B+0.041C-0.22A2-0.14B2-0.1C2+0.035AB+0.015AC+0.032BC

表2 微波輔助提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 微波輔助提取響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

由方差分析表3可知，模型F值為78.49，遠(yuǎn)大于分布表中的F值，且模型P值極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)的擬合效果相近，能夠較好的反映精油提取率與因素之間的關(guān)系。相關(guān)系數(shù)R2為0.990 2，模型校正系數(shù)R2為0.977 6，兩者大致相同，說明該模型在可允許接受范圍內(nèi)。除微波溫度與微波時(shí)間的交互項(xiàng)不顯著外，其他作用均顯著。同時(shí)由表中數(shù)據(jù)可見，影響精油提取率的優(yōu)先條件是微波溫度(A)>微波功率(B)>微波時(shí)間(C)。

結(jié)合二次回歸模型數(shù)學(xué)分析結(jié)果，微波提取紫蘇葉精油的最佳工藝參數(shù)為：微波溫度62.65 ℃，微波功率932.84 W，微波時(shí)間6.28 min，在此條件下蘇葉精油提取率的預(yù)測(cè)值為2.169%。鑒于實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將上述工藝參數(shù)修正為：微波溫度63 ℃，微波功率933 W，微波時(shí)間6.5 min，該條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，所得紫蘇精油平均提取率為2.11%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)基本一致，說明該模型具可靠性。

2.1.3 微波-超聲波輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油單因素實(shí)驗(yàn)

在該微波優(yōu)化條件，即料液比1∶6，微波功率933 W條件下，考察超聲時(shí)間、超聲溫度及超聲功率對(duì)紫蘇精油提取率的影響，結(jié)果見圖2。紫蘇精油提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加，在4 min時(shí)達(dá)到最大值為2.29%。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，紫蘇精油提取率下降。微波、超聲波共同作用的結(jié)果使得較少時(shí)間下即可獲得較大量紫蘇精油提取率。紫蘇精油提取率隨提取溫度的增加同樣呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。提取溫度的升高，溶劑分子活性增加，提取率增加，但溫度過高會(huì)使紫蘇精油不穩(wěn)定，易揮發(fā)分解，導(dǎo)致精油提取率下降。紫蘇精油提取率隨著超聲波功率的增加而呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在微波-超聲波功率933～250 W的條件下，紫蘇精油提取率為2.3%，相較于單個(gè)微波作用，紫蘇精油提取率進(jìn)一步增加。而過高的超聲波功率也會(huì)導(dǎo)致紫蘇精油的破壞，因此選擇超聲波功率250 W進(jìn)行提取研究。

圖2 微波-超聲波輔助不同提取條件對(duì)紫蘇精油提取率的影響

2.1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波輔助提取紫蘇精油工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲波輔助提取紫蘇精油工藝。選取超聲波功率、微波-超聲溫度、微波-超聲時(shí)間這3個(gè)因素，采用三因素三水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表4。料液比為1∶6，微波功率933 W。

表4 微波-超聲波輔助提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

響應(yīng)曲面法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，所得二次回歸方程方差分析見表6。由此可得二次回歸方程為：

Y=2.30-0.058D+0.056E+0.1H-0.35D2-0.2E2-0.1H2+0.03DE-0.035DH-0.028EH

表5 微波-超聲波輔助提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 微波-超聲波輔助提取的響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

由表6方程分析表可得，該模型P值極顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，同時(shí)F值(228.93)遠(yuǎn)大于分布表中的F值(6.71)，說明回歸方程模型可用于紫蘇精油提取的優(yōu)化。相關(guān)系數(shù)R2為0.996 6，模型校正系數(shù)R2為0.992 3，說明模型的擬合度和可信度較高。H、D2、E2和H2對(duì)精油提取率有極顯著影響；D、E、DE、DH以及EH對(duì)精油提取率有顯著影響。

結(jié)合二次回歸模型數(shù)學(xué)分析結(jié)果，微波-超聲波提取紫蘇精油的最佳工藝參數(shù)為：超聲功率244.84 W，微波-超聲溫度50.49 ℃，微波-超聲時(shí)間4.49 min，在此條件下紫蘇精油提取率預(yù)測(cè)值為2.381%。鑒于實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將工藝參數(shù)修正為：超聲功率245 W，微波-超聲溫度50 ℃，微波-超聲時(shí)間4.5 min，3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得紫蘇精油平均提取率為2.34%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)基本一致，說明該模型具可靠性。優(yōu)化后的提取率2.34%遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)提取率0.2%～1.0%[18,19]，說明本研究對(duì)紫蘇精油的提取具有一定的指導(dǎo)意義。

2.2 GC-MS分析

采用GC-MS對(duì)提取的紫蘇精油進(jìn)行成分分析，結(jié)果如表7。GC-MS一共鑒定出46種化合物，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的組分為紫蘇醛(33.88%)，β-石竹烯(16.96%)，反式-α-檸檬烯(9.93%)，洋芹腦(6.26%)，2-丁酰呋喃(4.86%)，D-檸檬烯(3.70%)，trans-Shisool(3.17%)。精油中紫蘇醛的含量較高，可以認(rèn)定該精油為紫蘇醛型精油，紫蘇醛和檸檬烯約占了精油成分的50%，它們是紫蘇香味的主要來源，也是紫蘇精油的主要活性成分。

表7 紫蘇精油的GC-MS鑒定結(jié)果

2.3 紫蘇精油的抑菌活性

圖3是紫蘇精油抑菌活性圖。紫蘇精油對(duì)3種菌都具有較好的抑制作用，從抑菌趨勢(shì)可以看出紫蘇精油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用要高于大腸桿菌和希瓦氏菌。精油的抑菌方式一般有2種，一是破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使得細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，刺激細(xì)胞自溶，導(dǎo)致細(xì)菌死亡；二是精油小分子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，影響細(xì)菌的生理活動(dòng)，使其死亡。紫蘇精油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌活性比革蘭氏陰性菌更好，這可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌的外膜有脂多糖，可以提供親水性表面，同時(shí)能夠阻止大分子和疏水性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞[20]，從而對(duì)紫蘇精油具有相對(duì)抗性，結(jié)論與許澤文等[21]關(guān)于檸檬草精油抑菌的研究結(jié)果相一致。艾薇等[22]關(guān)于山姜精油的抑菌也得到了相似結(jié)論，發(fā)現(xiàn)山姜精油對(duì)大腸桿菌的MBC為12.5 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄桿菌的MBC為6.25 mg/mL。從GC-MS分析可知紫蘇精油中主要成分為紫蘇醛和檸檬烯，兩者具有協(xié)同抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，因此精油具有較好的抑菌效果[23]。當(dāng)紫蘇精油體積比為10 μL/mL的時(shí)候，3種菌的細(xì)菌總數(shù)(TVC)都為零，說明這3種菌已經(jīng)被完全殺死，因此可認(rèn)為紫蘇精油對(duì)這3種菌的MBC為10 μL/mL。

注：小寫字母不同表示顯著差異(P<0.05)。圖3 紫蘇精油的抑菌作用

3 結(jié)論

本研究利用微波-超聲波協(xié)同輔助同時(shí)蒸餾萃取法提取紫蘇精油，所獲最佳提取工藝為：料液比1∶6，微波功率933 W，超聲功率245 W，微波-超聲溫度50 ℃，微波-超聲時(shí)間4.5 min。該條件下，紫蘇精油提取率為2.34%。紫蘇精油GC-MS分析表明，其主要含有紫蘇醛(33.88%)、β-石竹烯(16.96%)、反式-α-檸檬烯(9.93%)、洋芹腦(6.26%)、2-丁酰呋喃(4.86%)、D-檸檬烯(3.70%)，trans-Shisool(3.17%)等。抑菌實(shí)驗(yàn)表明紫蘇精油對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和腐敗希瓦氏菌都具有較好的抑菌效果，MBC都為10 μL/mL。