羅志剛 楊歡 齊亮

(華南理工大學(xué) 食品與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

表面活性劑是一類重要的兩親性化合物，具有乳化、起泡等功能性質(zhì)。已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于日化、食品加工、農(nóng)業(yè)、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域[1]。表面活性劑通常采用化學(xué)方法制備，且大部分合成表面活性劑屬于石油化工產(chǎn)品，存在生物降解性差、易污染環(huán)境及消耗不可再生資源等問題[2]。隨著各工業(yè)領(lǐng)域?qū)Ρ砻婊钚詣┬枨蟮牟粩嘣黾蛹熬G色環(huán)?？沙掷m(xù)發(fā)展理念的增強(qiáng)，綠色表面活性劑受到了越來越多的關(guān)注，其中最具代表性的是生物表面活性劑。生物表面活性劑主要是指由微生物產(chǎn)生的具有表面活性的次生代謝物，常見的生物表面活性劑包括槐糖脂、鼠李糖脂、海藻糖、脂肽[3]等。生物表面活性劑具有良好的生物相容性、生物降解性高、毒性低、作用特異性強(qiáng)、抗菌活性高以及在極端條件下具有良好的表面活性等優(yōu)點(diǎn)[4]。

鼠李糖脂是目前研究最廣泛的生物表面活性劑，它主要由銅綠假單胞菌經(jīng)發(fā)酵而產(chǎn)生[5]，屬于糖脂類表面活性劑。鼠李糖脂的親水基團(tuán)一般由1-2個(gè)鼠李糖分子組成，疏水基團(tuán)由1-2個(gè)不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸分子組成[6]。鼠李糖脂具有多種功能特性，作為乳化劑、抗菌劑、發(fā)泡劑和潤濕劑[7- 9]被廣泛地應(yīng)用于生物修復(fù)、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品、日化等[10- 15]工業(yè)領(lǐng)域。

以銅綠假單胞菌1.104 52發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂為研究對象，通過超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析其組成成分，并測定其臨界膠束濃度(CMC)、乳化性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性及抗菌活性等功能性質(zhì)，從而探究鼠李糖脂用作表面活性劑的潛力，以期為鼠李糖脂在食品、日化、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

銅綠假單胞菌1.104 52(Pseudomonasaeruginosa)，源自中國普通微生物保藏中心；大腸桿菌ATCC25922(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌ATCC6538(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌ATCC10231(Candidaalbicans)，購自上海魯微科技有限公司。

十二烷基硫酸鈉(SDS)、氯化鈉、葡萄糖、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；牛肉膏、蛋白胨，環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn)；卡松，北京桑普生物化學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)；玉米油，金龍魚有限公司生產(chǎn)。

LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)菌；酵母膏胨葡萄糖(YPD)液體培養(yǎng)基及YPD固體培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米油60 g/L、硝酸鈉6.8 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、磷酸二氫鈉3.2 g/L、磷酸氫二鉀4.8 g/L、無水氯化鈣0.02 g/L、硫酸亞鐵0.024 g/L。

1.2 儀器設(shè)備

高壓滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)；震蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司生產(chǎn)；表面張力儀，德國 Dataphysics 公司生產(chǎn)；超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國Bruker公司生產(chǎn)；泡沫儀R- 2000，德國SITA公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鼠李糖脂的發(fā)酵生產(chǎn)與提取

將斜面保存的銅綠假單胞菌接種于LB培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h。然后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5%培養(yǎng)好的種子液，將發(fā)酵培養(yǎng)基置于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)72～96 h，最終得到鼠李糖脂發(fā)酵液。

鼠李糖脂的提取參考WITEK等[16]及朱零青[17]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。將發(fā)酵液離心(8 000 r/min，10 min)以去除菌體，然后收集上清液，并用 6 mol/L HCl將除菌發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)至2.0，于4 ℃ 條件下靜置過夜，離心(8 000 r/min，10 min)收集沉淀。沉淀用0.05 mol/L NaHCO3溶液懸浮沉淀3次，并離心(8 000 r/min，10 min)收集上清液。將上清液的pH值調(diào)節(jié)至2.0，靜置沉淀。最后用乙酸乙酯萃取所得沉淀，收集乙酸乙酯有機(jī)相，將有機(jī)相與pH值為8.0的磷酸鹽緩沖溶液混合，有機(jī)相中的鼠李糖脂富集于水相中，收集下層水相即得到鼠李糖脂溶液。

1.3.2 鼠李糖脂的組成成分測定

鼠李糖脂的組成成分測定參考Zhao等[18]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)對鼠李糖脂的組分進(jìn)行分離鑒定。LC分析條件為：采用250 mm×4.6 mm×5 μm C18反相柱進(jìn)行色譜分離。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取20 μL樣品注入液相色譜儀系統(tǒng)，用4 mmol/L的醋酸銨水溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，開始用40%乙腈洗脫4 min，20 min后乙腈濃度升至90%，液相色譜流速為0.4 mL/min，洗脫液直接用質(zhì)譜儀檢測，采用負(fù)離子模式，在100～1 000的質(zhì)荷比(m/z)范圍內(nèi)記錄質(zhì)譜。

1.3.3 鼠李糖脂臨界膠束濃度的測定

臨界膠束濃度(CMC)由表面張力法確定[19]。制備不同濃度(c，0～1 000 mg/L)的鼠李糖脂溶液，利用表面張力儀測定其表面張力(γ)，并繪制γ-lgc曲線，曲線的轉(zhuǎn)折點(diǎn)即為鼠李糖脂臨界膠束濃度(CMC)。以十二烷基硫酸鈉(SDS)作為對照。

1.3.4 鼠李糖脂乳化能力的測定

鼠李糖脂的乳化能力由乳化指數(shù)(E24)表示[20]。制備1 g/L的鼠李糖脂溶液，測定其乳化指數(shù)。將3 mL的疏水性有機(jī)物(大豆油、液體石蠟和正己烷)與3 mL的鼠李糖脂溶液混合，將混合液于8 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，然后靜置24 h并測量乳狀液層高度，根據(jù)式(1)計(jì)算乳化指數(shù)(E24)。以十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)和吐溫80作為對照。

(1)

其中，E24表示乳化指數(shù)，H為混和物總高度，h為乳化層高度。

1.3.5 鼠李糖脂泡沫性能的測定

泡沫性能可用起泡比和泡沫穩(wěn)定性表示，參考王健等[21]的方法并修改，用泡沫分析儀測定鼠李糖脂在純水和硬水中的起泡性及泡沫穩(wěn)定性，在泡沫分析儀的樣品玻璃罐中加入250 mL質(zhì)量濃度為2 g/L的鼠李糖脂溶液(分別用純水和硬水配制)，然后在1 000 r/min條件下攪拌5 min，每隔15 s記錄泡沫體積，攪拌停止后每隔30 s測定其泡沫體積。并用式(2)和(3)計(jì)算鼠李糖脂在純水和硬水中的起泡比和泡沫穩(wěn)定性[22]。以十二烷基苯磺酸鈉(SDS)作為對照。

(2)

(3)

其中，F(xiàn)為起泡比，S為泡沫穩(wěn)定性，V為試樣體積(250 mL)，V0為攪拌停止時(shí)的泡沫體積，V5 min為攪拌停止5 min后的泡沫體積。

1.3.6 鼠李糖脂穩(wěn)定性的測定

鼠李糖脂的穩(wěn)定性可以利用表面張力[23]和乳化能力[24]來評(píng)價(jià)。制備1 g/L的鼠李糖脂溶液，然后將其在不同的pH值(2、3、4、6、8、10、12、13、14)、不同的溫度(-20、4、25、40、60、80、100 ℃)及不同的NaCl質(zhì)量濃度(0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5、25.0、27.5、30.0 g/L)的條件下處理4 h后，測定其表面張力和乳化指數(shù)(用于測定乳化指數(shù)的疏水有機(jī)相為液體石蠟)，研究溫度穩(wěn)定性及NaCl穩(wěn)定性時(shí)采用自然pH(5.8)，以SDS作為對照。

1.3.7 鼠李糖脂抑菌活性的測定

(1)抑菌圈直徑的測定

采用瓊脂打孔法測定鼠李糖脂對試驗(yàn)菌株(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌)的抑菌圈直徑，具體操作方法參考Bharali等[25]的方法并進(jìn)行適當(dāng)修改，并以化學(xué)防腐劑卡松及天然防腐劑殼聚糖作為陽性對照，無菌水作為陰性對照，以對比相同濃度下鼠李糖脂的抗菌能力。此外，在試驗(yàn)瓊脂平板上打孔，向圓孔中分別注入20 μL不同濃度(3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg/mL)的鼠李糖脂溶液，以確定不同濃度鼠李糖脂溶液的抗菌能力。將平板分別在37 ℃(細(xì)菌)或28 ℃(真菌)條件下培養(yǎng)24 h，并使用透明公制尺測量觀察到的抑制圈直徑(mm)。

(2)最低抑菌濃度的測定

采用微量肉湯稀釋法[26]測定鼠李糖脂的最低抑菌濃度(MIC)，并以化學(xué)防腐劑卡松及天然防腐劑殼聚糖作陽性對照，培養(yǎng)基作陰性對照。將96孔板置于37 ℃(細(xì)菌)或28 ℃(真菌)下培養(yǎng)24 h并加以觀察，以不出現(xiàn)渾濁的最后一孔對應(yīng)的濃度即為相應(yīng)抑菌劑對供試菌的MIC值[27]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±誤差表示，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 鼠李糖脂組成成分分析

鼠李糖脂通常包括雙鼠李糖脂和單鼠李糖脂，鼠李糖脂的組成成分主要取決于發(fā)酵所用菌株及培養(yǎng)基條件，當(dāng)菌種及培養(yǎng)條件發(fā)生改變時(shí)，所得到的鼠李糖脂的組分及其相對含量也會(huì)隨之發(fā)生變化，從而導(dǎo)致不同組分構(gòu)成的鼠李糖脂在性質(zhì)上存在差異。據(jù)報(bào)道[28]，鼠李糖脂混合物一般由2-28種同系物組成。通過LC-MS對鼠李糖脂進(jìn)行組分測定及分析，其組成成分及相對含量見表1。

表1 鼠李糖脂同系物的結(jié)構(gòu)和相對含量Table 1 Structure and relative abundance of rhamnolipids homo-logues

表1中RhaCn和RhaCnCn為單鼠李糖脂，Rha-RhaCn和RhaRhaCnCn為雙鼠李糖脂(其中n代表8、10和12)。由表1可知，本研究利用銅綠假單胞菌1.104 52發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂產(chǎn)品主要由9種同系物組成，并且主要成分為雙鼠李糖脂，其相對含量為79.22%，雙鼠李糖脂中占比最大的是RhaRhaC10C10，其相對含量為50.71%。已有研究表明[19]，相較于單鼠李糖脂，雙鼠李糖脂具有更好的表面活性、乳化性及穩(wěn)定性。而該鼠李糖脂產(chǎn)品中含有將近80%的雙鼠李糖脂，因此，推測該鼠李糖脂會(huì)具有較好的理化性質(zhì)。

2.2 臨界膠束濃度的測定

CMC是指表面活性劑在溶劑中形成膠束的最小濃度，它是評(píng)估表面活性劑界面活性的重要參數(shù)，CMC越低，表明表面活性劑形成膠束所需的濃度就越低，其表面活性就越好，因此起到乳化和起泡等理化性質(zhì)所需的最小濃度越低[29]。由圖1(a)可知，當(dāng)鼠李糖脂溶液質(zhì)量濃度小于80 mg/L時(shí)，表面張力隨著鼠李糖脂溶液濃度的增加而降低，而當(dāng)鼠李糖脂溶液的質(zhì)量濃度大于80 mg/L時(shí)，表面張力趨于穩(wěn)定，不再隨著鼠李糖脂溶液濃度的升高而變化，說明該鼠李糖脂的CMC為80 mg/L。而從圖1(b)中可以看出，化學(xué)表面活性劑的SDS的CMC為600 mg/L。這表明本研究所制備的鼠李糖脂的表面活性優(yōu)于SDS。

(a)鼠李糖脂

(b)SDS圖1 鼠李糖脂及SDS的臨界膠束濃度Fig.1 Critical micelle concentration of rhamnolipids and SDS

2.3 鼠李糖脂的乳化能力

用液體石蠟、大豆油和正己烷3種疏水性有機(jī)物評(píng)價(jià)鼠李糖脂、SDS、吐溫80和CTAC 4種表面活性劑的乳化活性。從圖2中可以看出，鼠李糖脂對液體石蠟的乳化指數(shù)達(dá)到65.69%，優(yōu)于化學(xué)表面活性劑SDS、CTAC及乳化劑吐溫80。液體石蠟作為護(hù)膚品中常見的保濕劑、柔潤劑，鼠李糖脂對液體石蠟良好的乳化性表明其作為乳化劑在日化行業(yè)中具有很好的應(yīng)用前景。鼠李糖脂對大豆油的乳化指數(shù)為63.75%，與化學(xué)表面活性劑SDS相近且優(yōu)于乳化劑吐溫80及化學(xué)表面活性劑CTAC，表明其對食用油具有良好的乳化性。因此，鼠李糖脂作為清潔劑和乳化劑在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用前景。此外，鼠李糖脂對正己烷的乳化指數(shù)為52.54%，說明鼠李糖脂也能夠用于乳化有機(jī)溶劑，可以應(yīng)用于生物修復(fù)領(lǐng)域。

圖2 鼠李糖脂對不同疏水有機(jī)物的乳化活性Fig.2 Emulsification of rhamnolipids on different hydrophobic organic compounds

2.4 鼠李糖脂的泡沫性能

泡沫體積及起泡比可用于表征鼠李糖脂的起泡性，起泡比越大，鼠李糖脂的起泡性就越好[30]。從表2中可知，鼠李糖脂在純水和硬水中的起泡比分別為(287.86±0.83)%和(280.40±0.40)%。與相同濃度下的化學(xué)表面活性劑SDS相比，二者在純水中具有相近的起泡比，而在硬水中鼠李糖脂具有更高的起泡比。這表明該鼠李糖脂在硬水中具有更好的起泡性。靜置5 min后，鼠李糖脂溶液在純水中的泡沫體積由之前的718 mL變?yōu)?14 mL，其泡沫穩(wěn)定性為(99.44±0.14)%，與SDS相近，鼠李糖脂在硬水中的泡沫體積由之前的701 mL變?yōu)?97 mL，其泡沫穩(wěn)定性為(99.47±0.08)%，而SDS在硬水中的泡沫穩(wěn)定性為(96.83±0.34)%，說明鼠李糖脂在硬水中表現(xiàn)出更好的泡沫穩(wěn)定性。

表2 鼠李糖脂的起泡比與穩(wěn)泡性Table 2 Foaming ratio and foam stability of rhamnolipids

2.5 鼠李糖脂的穩(wěn)定性

由圖3(a)可知，在鼠李糖脂溶液的pH值為2～6時(shí)，其表面張力基本不變，而在pH 6～12的范圍內(nèi)，鼠李糖脂的表面張力整體略微上升，但鼠李糖脂溶液的表面張力在整個(gè)pH范圍內(nèi)始終在33 mN/m 以下，說明該鼠李糖脂樣品的表面活性受pH影響較小。此外，鼠李糖脂溶液的乳化指數(shù)在pH 2～6的范圍內(nèi)隨著pH增大而逐漸升高，而在pH 6～13的范圍內(nèi)乳化指數(shù)基本不變。當(dāng)pH為2時(shí)，鼠李糖脂溶液的乳化指數(shù)接近于0，這可能與鼠李糖脂在pH 2時(shí)溶解度最低有關(guān)。

(a)pH穩(wěn)定性

(b)氯化鈉穩(wěn)定性

(c)溫度穩(wěn)定性圖3 鼠李糖脂的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of rhamnolipids

由圖3(b)可知，在氯化鈉質(zhì)量濃度為0～30 g/L的測定范圍內(nèi)，鼠李糖脂溶液的表面張力未發(fā)生明顯變化，基本維持在28 mN/m左右，說明在氯化鈉質(zhì)量濃度低于30 g/L時(shí)，該鼠李糖脂產(chǎn)品的表面活性不受影響。此外，在氯化鈉質(zhì)量濃度為 0～25 g/L的范圍內(nèi)，鼠李糖脂的乳化指數(shù)相對較穩(wěn)定，說明在氯化鈉質(zhì)量濃度低于25 g/L時(shí)，鼠李糖脂具有很好的穩(wěn)定性。而當(dāng)氯化鈉質(zhì)量濃度超過25 g/L時(shí)，鼠李糖脂溶液的乳化指數(shù)出現(xiàn)急速下降，此時(shí)鼠李糖脂溶液的乳化活性在氯化鈉體系中受到了抑制。

由圖3(c)可知，該鼠李糖脂產(chǎn)品的表面活性及乳化活性在-20～121 ℃的溫度范圍內(nèi)基本保持不變，說明該鼠李糖脂產(chǎn)品具有耐受極端溫度的能力。鼠李糖脂在極端條件下保持較好的穩(wěn)定性可能與其復(fù)雜龐大的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[31]。鼠李糖脂對不同溫度、鹽度、pH的耐受性使其在極端復(fù)雜的環(huán)境中具有很好的應(yīng)用潛力，如修復(fù)被石油污染的土壤。

2.6 鼠李糖脂的抑菌活性

通過測量抑菌圈的直徑以及測定最低抑菌濃度(MIC)來表征本研究制備的鼠李糖脂對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和真菌(白色念珠菌)的抑菌效果。

2.6.1 抑菌圈直徑

10 mg/mL的鼠李糖脂溶液對不同菌種的抑菌圈直徑見表3。由表3可知，鼠李糖脂對3種供試菌均具有明顯的抑制作用，對3種供試菌的抑菌作用雖然弱于化學(xué)防腐劑卡松，但是優(yōu)于天然防腐劑殼聚糖。據(jù)吳海霞等[32]的研究，當(dāng)抑菌圈直徑在15～20 mm時(shí)，為供試菌對抑菌劑高度敏感，當(dāng)抑菌圈直徑大于20 mm時(shí)，為供試菌對抑菌劑極敏感。此外，從圖4中可以看出，各供試菌的抑菌圈直徑均隨著鼠李糖脂溶液濃度的升高而增大，這說明鼠李糖脂濃度越高，其對菌株的藥效和抗菌能力就越強(qiáng)。因此鼠李糖脂可以作為抗菌劑應(yīng)用于日化、食品等領(lǐng)域。

表3 鼠李糖脂對供試菌的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone of rhamnolipids on tested bacteria

圖4 不同鼠李糖脂濃度對供試菌的抑菌圈直徑Fig.4 Diameter of inhibition zone of rhamnolipids with different concentrations on the tested bacteria

2.6.2 鼠李糖脂的最低抑菌濃度

MIC是指能夠抑制微生物生長所需的最低抑菌劑濃度，MIC越小，說明其對供試菌的抑菌活性越強(qiáng)[33]。由表4可知，鼠李糖脂對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC與化學(xué)防腐劑卡松相比相差較小，而殼聚糖對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC最大，再次說明鼠李糖脂對供試菌的抗菌活性優(yōu)于天然抗菌劑殼聚糖。

表4 鼠李糖脂對供試菌的最低抑菌濃度Table 4 Minimal inhibitory concentration of rhamnolipids on tested bacteria

鼠李糖脂對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌所表現(xiàn)出來較高的抗菌活性與其結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。這可能是由于具有疏水性和親水性基團(tuán)的鼠李糖脂分子可以將其脂肪酸組分插入細(xì)胞膜，從而引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的顯著改變，鼠李糖脂較短的酰基尾部插入細(xì)胞膜也可能導(dǎo)致細(xì)胞骨架元素和質(zhì)膜之間的斷裂，使質(zhì)膜脫離細(xì)胞質(zhì)成分，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[26，34]，從而起到了抑菌的作用。

3 結(jié)論

本研究對銅綠假單胞菌1.104 52發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂的組成成分及性質(zhì)進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析。研究結(jié)果表明所生產(chǎn)的鼠李糖脂由9種同系物組成，以雙鼠李糖脂為主要成分，其臨界膠束濃度為80 mg/L，具有較好的表面活性。鼠李糖脂具有與化學(xué)表面活性劑SDS相近的乳化能力，對大豆油、液體石蠟、正己烷的乳化指數(shù)分別為63.75%、65.69%、52.54%。鼠李糖脂在純水和硬水中均表現(xiàn)出良好的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。此外，鼠李糖脂對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均具有較高的抑菌活性。