劉暢 黃演林 汪安石 張彥 丁紅珂 曾玉坤 劉淵 劉玲 吳菁 尹愛華

耳聾是人類常見的疾病之一，與遺傳因素密切相關［1?2］。據(jù)報道，約50%的語前聾與遺傳因素有關，且遺傳因素在許多遲發(fā)性進行性聽力下降、年齡相關性耳聾的發(fā)生中也發(fā)揮著不可忽視的作用［1?4］。明確致病基因變異、闡明分子致病機制，可為臨床診斷、治療和預防提供重要依據(jù)［3?5］。迄今為止，超過200 個綜合征性（syndromic hearing loos，SHL）和非綜合征性耳聾（non?syndromic hearing loss，NSHL）基因被發(fā)現(xiàn)（http：//deafnessvariationda?tabase.org）［3?4］。在中國耳聾人群中，較常見的致聾基因包括GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12S rRNA基因，約占耳聾病例的30%～40%［5］。高度的遺傳異質性給耳聾的分子診斷帶來巨大的挑戰(zhàn)。耳聾基因的變異類型多樣，包括點變異、小片段插入缺失（Indel）、拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV）、結構變異（Structural variation，SV）等，單一檢測技術難以奏效［6］。目前，用于遺傳性耳聾診斷的方法主要包括基因芯片、基因Sanger 測序以及基于下一代測序（next?generation sequencing，NGS）技術的目標耳聾基因靶向捕獲測序、全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）及全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）等［7?8］。Sanger 測序在包括GJB2、SLC26A4等較常見的致聾基因檢測中發(fā)揮著重要作用，同時對于可產(chǎn)生特征性臨床表型的少數(shù)基因的檢測也具有一定意義［3］。在充分考慮檢測效能、檢測成本、檢測時間等因素的前提下，本單位制定了一套階梯式基因診斷策略，并將其應用于耳聾患者分子診斷的臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2020年12月廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心226 例耳聾患者進行基因診斷。納入的人群均為感音神經(jīng)性耳聾或混合性耳聾患者，排除單純的傳導性耳聾患者。對入組耳聾患者進行病史收集及體格檢查，包括詳細的過往病史、耳聾家族史、聽力學檢查情況、發(fā)病年齡及誘因、感染史、氨基糖苷類藥物接觸史等。226例耳聾患者中男134 例、女92 例（男女比例1.5∶1），其中語前聾（發(fā)病年齡≤3 歲）203 例（89.8%）、語后聾23 例（10.2%），有耳聾家族史12 例（5.3%）、無耳聾家族史209 例（92.5%）、耳聾家族史不詳5 例（2.2%），有氨基糖苷類藥物接觸史11例（4.9%）、無氨基糖苷類藥物接觸史209 例（92.5%）、氨基糖苷類藥物接觸史不詳6例（2.7%）?；颊呗犃p失程度如下：輕度2 例（0.9%）、中度16 例（7.1%）、重度129 例（57.1%）、極重度例40例（17.7%）、聽力損失程度不詳39 例（17.2%）。本研究經(jīng)院倫理委員會審核通過。受檢者（監(jiān)護人）充分知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 階梯式基因診斷策略

本研究根據(jù)廣東省聾病診療的基本情況，綜合考慮各項實驗技術的檢測效力、檢測時間與檢測成本，設計了一套適合廣東地區(qū)實際情況的聾病階梯式基因診斷策略。見圖1。階梯式診斷策略第一階梯基因診斷采用微陣列芯片法對受檢者進 行GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體DNA 12S rRNA基因上的中國人群耳聾基因變異熱點檢測。第二階梯基因診斷用于第一階梯基因診斷未檢出或僅檢出單個常染色體隱形遺傳致病變異的病患，采用Sanger 測序法對受檢者進行GJB2基因、SLC26A4基因等中國人群中較常見的耳聾基因測序。對于可產(chǎn)生特征性臨床表型的少數(shù)基因，因其臨床表型對耳聾基因的檢測具有指向性，也常應用候選基因篩選的策略在第二階梯基因診斷中進行分子遺傳學診斷。第三階梯基因診斷主要用于第一、二階梯基因診斷未檢出或檢出結果不能解釋表型的耳聾病患，但對于由表型判斷為非GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體DNA 12S rRNA基因變異致聾患者、部分綜合征性耳聾患者、有急切產(chǎn)前診斷需求等檢測時間窗較短的耳聾患者可直接接受高通量測序檢測。

圖1 階梯式耳聾基因診斷策略Figure 1 A stepwise approach for the genetic diagnosis of hearing loss

1.3 第一檢測階梯——微陣列芯片法

采集受檢者外周血2 mL，提取基因組DNA。使用微陣列芯片法晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（北京博奧生物有限公司，國食藥監(jiān)械（準）字2009 第3400725）對受檢者進行GJB2基因c.35 del G、c.176_191 del 16bp、c.235 del C、c.299_300 del AT，GJB3基因c.538 C>T，SLC26A4基因c.2168 A>G、c.919_2 A>G，線粒體DNA 12S rRNA基因m.1494 C>T、m.1555 A>G 中國人群耳聾基因變異熱點篩查。根據(jù)試劑盒說明書，通過多重不對稱等位基因特異性PCR 擴增獲得大量單鏈DNA，PCR 產(chǎn)物變性后與芯片雜交，芯片洗滌后經(jīng)晶芯LuxScan 10K?B 微陣列芯片掃描儀（北京博奧生物有限公司）掃描成像并使用配套軟件進行結果判讀［9］。

1.4 第二檢測階梯——Sanger 測序法

對GJB2、SLC26A4等基因編碼區(qū)及側翼序列使用巢式聚合酶鏈式反應擴增，引物序列及PCR反應條件參見文獻［10?11］，擴增產(chǎn)物送廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。DNA 測序結果用Mutation Surveyor 軟件（SoftGenetics，State Col?lege，PA）與NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的參考序列進行序列比對與分析。

1.5 第三檢測階梯——全外顯子組測序法

質檢合格的基因組DNA 經(jīng)超聲破碎儀打斷、末端修復、擴增、純化等操作制備測序文庫，采用特異性的捕獲探針（Roche NimbleGen，Madison，WI）雜交富集目標區(qū)域的DNA 序列，目標區(qū)域包括OMIM 相關的約5 000 個靶基因的全部外顯子區(qū)及上下游各30 bp 內(nèi)含子區(qū)和已知的深度內(nèi)含子區(qū)變異，隨后在Illumina NovaSeq 6000 平臺上進行二代測序。使用NextGENe 軟件將測序Reads與人的參考基因組（GRCh37/hg19）進行序列比對。單個核苷酸變異（SNV/indels）分析方法為：通過變異的人群頻率數(shù)據(jù)庫（ExAC、gnomAD、1000 genomes 等）對高頻變異進行過濾，參考dbSNP、OMIM、ClinVar、Varsome、HGMD、LOVD、Deaf?ness Variation Database 等多種數(shù)據(jù)庫對致病變異位點進行評估，應用Varsome 網(wǎng)站及pliceAI 軟件（BayesDel_addAF、DANN、DEOGEN2、EIGEN、FATHMM?MKL、M?CAP、MVP、MutationAssessor、MutationTaster、REVEL、SIFT 及GERP）等對變異的保守性和致病性進行預測［11?12］。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學學會（American College of Medical Genet?ics，ACMG）指南對點變異和拷貝數(shù)變異的致病性進行分類（PMID：25741868）。

2 結果

2.1 第一檢測階梯——微陣列芯片法

165 例耳聾患者接受了第一階梯基因診斷，28例檢出芯片所包含的變異熱點。其中，12 例為GJB2基因、SLC26A4基因致病變異的純合或復合雜合形式，基因型可解釋臨床表型。1 例攜帶線粒體DNA 12S rRNA基因m.1494 C>T 同質性變異、1 例攜帶線粒體DNA 12S rRNA基因m.1555 A>G同質性變異，與其接觸氨基糖苷類藥物后出現(xiàn)聽力損失的病史符合。另有14 例攜帶GJB2基因、SLC26A4基因上芯片所包含的單等位基因致病變異，進入第二檢測階梯。

2.2 第二檢測階梯——Sanger 測序法

檢出24 例GJB2基因、SLC26A4基因致病變異的純合或復合雜合形式，其中14 例為GJB2基因致病變異的純合或復合雜合子、10 例為SLC26A4基因致病變異的純合或復合雜合子，基因型可解釋臨床表型。另有21 例攜帶GJB2基因、SLC26A4基因致病變異的雜合形式，建議進入第三檢測階梯。

2.3 第三檢測階梯——全外顯子組測序法

共95 個耳聾病患接受了外顯子組測序檢測，38 例明確了分子診斷，診斷率為40%。38 例明確分子診斷的病例中14 例系由GJB2基因、SLC26A4基因變異致聾。余24 例明確分子診斷病例的致病變異分布于15 個基因，其中7 個遵循常染色體隱性遺傳模式、8 個遵循常染色體顯性遺傳模式，見圖2。

圖2 確診病例的耳聾基因變異譜Figure 2 Genetic spectrum of diagnosed patients with hearing loss

3 討論

本研究根據(jù)廣東省聾病診療的基本情況，綜合考慮各項實驗技術的檢測效力、檢測時間與檢測成本，設計了一套適合廣東地區(qū)實際情況的聾病的階梯式基因診斷策略。階梯式診斷策略第一階梯基因診斷采用微陣列芯片法對受檢者進行GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體DNA 12S rRNA基因上的9 個中國人群耳聾基因變異熱點檢測，檢測成本為335 元、報告時間為一周。本研究通過第一階梯基因檢測為14 例病患明確分子診斷（診斷率8.5%），并為另外14例病患提示了變異基因。第二階梯基因診斷采用Sanger 測序法對受檢者進行GJB2、SLC26A4等中國人群中較常見的耳聾基因編碼區(qū)及側翼序列測定，檢測成本為450 元、報告時間為一至三周。本研究結果提示另外21 例攜帶GJB2、SLC26A4基因編碼區(qū)雜合性致病變異。第一、二階梯基因診斷未檢出或檢出結果不能解釋表型的34 耳聾病患，進入第三檢測階梯，外顯子組測序為其中11 例明確了分子診斷，診斷率32.4%。由于外顯子組測序的成本高達3 360元、報告時間為四周，93例經(jīng)第一、二階梯基因檢測未能明確診斷的耳聾病患選擇退出研究。另有61例由表型判斷為非GJB2、GJB3、SLC26A4或線粒體DNA 12S rRNA基因變異致聾患者、部分綜合征性耳聾患者、有急切產(chǎn)前診斷需求等檢測時間窗較短的耳聾患者選擇直接接受全外顯子組測序檢測，其中27例明確了分子診斷，診斷率44.3%。這27例直接接受全外顯子組測序檢測而明確診斷的病例中14例系由GJB2基因、SLC26A4基因變異致聾（占比51.9%），這部分病例本可通過第一、二階梯基因檢測進行診斷，但由于有急切產(chǎn)前診斷需求檢測時間窗較短等個人原因而選擇直接接受外顯子組測序檢測。所有微陣列芯片法及外顯子組測序法檢出的致病變異、疑似致病變異及意義不明的基因變異均通過Sanger測序法進行驗證，符合率100%。對于有條件的患者家庭，進行家系驗證。

本研究中第一、二階梯基因診斷的檢測成本為785 元、報告時間為二至四周，診斷率23.0%，第三階梯基因診斷的檢測成本為3 360 元、報告時間為四周，可額外提高32.4%的診斷率。而直接選擇外顯子組測序則檢測成本為3 360 元、報告時間為四周，診斷率44.3%。可見，通過階梯式基因診斷策略，從中國人群耳聾基因變異熱點入手，到GJB2、SLC26A4等常見耳聾基因編碼區(qū)及側翼序列測定，再擴大范圍到全外顯子測序，呈分層遞進式檢測，更為經(jīng)濟。但對于有急切產(chǎn)前診斷需求等檢測時間窗較短的耳聾患者，直接選擇外顯子組測序檢測更為高效。因而，在現(xiàn)行醫(yī)保政策下，綜合考慮各項實驗技術的檢測效力、檢測時間與檢測成本，結合廣東省聾病診療的臨床實踐情況，本研究認為階梯基因診斷策略是有意義的，有保留的必要，而根據(jù)實際情況有部分患者可直接選擇外顯子組測序檢測。明確耳聾患者分子診斷有助于提高病人管理、改善患者預后、規(guī)范遺傳咨詢及進行再發(fā)風險評估，具有十分重要的臨床意義［4，12］。