孫悅萍，周 芹，徐利劍，任紅波，馬文瓊，張曉波，金海濤，陳國(guó)峰，劉 峰，董見(jiàn)南

（1黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，哈爾濱 150086；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150080；4農(nóng)業(yè)農(nóng)村部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

氯蟲(chóng)苯甲酰胺，是一種具有廣譜安全等優(yōu)勢(shì)的新型結(jié)構(gòu)鄰甲酰氨基苯甲酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，對(duì)鱗翅目等害蟲(chóng)的防治效果顯著，其作用于昆蟲(chóng)的機(jī)體功能，致使昆蟲(chóng)饑餓和死亡[1-2]。噻蟲(chóng)胺，是一種具有毒性低、長(zhǎng)持效期、無(wú)交互抗性等優(yōu)勢(shì)的新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，有較好的內(nèi)吸性、選擇性和滲透性，其作用于昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)，致使昆蟲(chóng)麻痹和死亡[3-4]。水稻是中國(guó)主要的糧食作物，為提高產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，減少病蟲(chóng)草害及環(huán)境污染等，合理選用低毒高效的農(nóng)藥成為選擇之一，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的復(fù)配使用能夠有效防治水稻上的二化螟和稻飛虱。

隨著氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的大面積使用，兩者在作物中的殘留及對(duì)環(huán)境的安全性備受關(guān)注。歐盟已規(guī)定氯蟲(chóng)苯甲酰胺在糙米中的農(nóng)藥殘留最大限量(MRL)值為0.4mg/kg，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定在谷物中的MRL值為0.02mg/kg[5]，中國(guó)GB 2763—2021中規(guī)定稻谷中氯蟲(chóng)苯甲酰胺及噻蟲(chóng)胺MRL值均為0.5mg/kg[6]，其中前者為臨時(shí)限量，但是還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。所以建立稻谷中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的測(cè)定方法迫在眉睫。

目前，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺分析方法主要包括氣相色譜法(GC-ECD)[7]、液相色譜法(HPLC)[8-9]及其液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[10-11]和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS/MS)等[12]。前處理凈化方法主要有液液萃取[13]、固相萃取(SPE)[14]和基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)(QuEChERS)[15-16]方法。宋文芳利用高效液相色譜法研究辣椒中氯蟲(chóng)苯甲酰胺的殘留量[9]，高效液相色譜具有普遍的選擇性，但是其前處理過(guò)程較復(fù)雜，且靈敏度較低。馮柳娟利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)研究大豆中氯蟲(chóng)苯甲酰胺的殘留量[12]，但是此方法分析檢測(cè)耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，與高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜比較前處理也過(guò)于復(fù)雜[8]。目前，對(duì)一些復(fù)雜基質(zhì)的前處理，QuEChERS法應(yīng)用較為廣泛，而且凈化效果也十分突出。選用QuEChERS法-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定糙米、稻殼及秸稈中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的殘留檢測(cè)分析技術(shù)未見(jiàn)報(bào)道。擬建立的檢測(cè)分析方法補(bǔ)充了這一領(lǐng)域的研究空白。本文優(yōu)化了QuEChERS前處理方法中的提取溶劑及凈化方法，考察了方法的線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、精密度及準(zhǔn)確度，建立的方法滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析要求，為在水稻上復(fù)配使用氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺提供相關(guān)可信的試驗(yàn)數(shù)據(jù)及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯蟲(chóng)苯甲酰胺（純度99%，上海市農(nóng)藥研究所）；噻蟲(chóng)胺（純度98.2%，沈陽(yáng)化工研究院）。乙腈、甲酸（色譜純）；N-丙基乙二胺（PSA，40～60mesh，艾杰爾公司）；十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm，艾杰爾公司）；石墨化炭黑（GCB，120-400Mesh，艾杰爾公司）；有機(jī)系濾膜（尼龍，0.22μm，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

美國(guó)Waters Xevo TQ-S液相色譜/三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；梅特勒電子天平；日本日立冷凍高速離心機(jī)；德國(guó)艾卡往復(fù)式振蕩器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取 稱(chēng)取樣品（糙米10.0 g，稻殼2.0 g，秸稈2.0 g），依次加入20m L蒸餾水、20m L乙腈，混勻后振蕩提取30m in，收集提取液，加入5 g氯化鈉，渦旋3min，以5000 r/m in離心3m in，上清液待凈化。

1.3.2 凈化 分別吸取1m L糙米、稻殼和秸稈的上層待凈化液，糙米待凈化液中加入25mg C18，稻殼和秸稈待凈化液中分別加入50 mg PSA，渦旋1 min，以10000 r/m in離心3m in，過(guò)0.22μm有機(jī)系濾膜，待液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取適量氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將氯蟲(chóng)苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐步稀釋配制成0.1、1、10、20、100 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，將噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐步稀釋配制成0.1、1、10、100、200、500 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流圖（圖1）。

圖1 氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)樣品總離子流圖(0.1mg/L)

1.5 儀器條件

1.5.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC? C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；進(jìn)樣體積：2μL；流動(dòng)相：乙腈（色譜），0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.5.2 質(zhì)譜分析條件 電噴霧正離子掃描(ESI+)，毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度150℃，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 檢測(cè)限、定量限和添加回收率的測(cè)定

農(nóng)藥殘留分析中的檢測(cè)限是利用3倍的信噪比(S/N)來(lái)確定的，利用10倍的信噪比作為方法的定量限。為了確定氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的檢測(cè)限，分別將氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1.0m L)逐漸稀釋?zhuān)钡铰认x(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的S/N比為3。

糙米、稻殼、秸稈中的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺定量限的確定，將0.01mg/L氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的工作溶液加標(biāo)至糙米、稻殼和秸稈中，按照1.3中描述的方法進(jìn)行提取、凈化和分析，逐級(jí)稀釋直至氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的S/N比為10。

分別在空白糙米、稻殼和秸稈樣品中添加3組濃度的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每組添加濃度重復(fù)5平行，按1.3試驗(yàn)方法處理各組回收樣品，按1.5測(cè)定分析后，計(jì)算各組回收樣品的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中，最常用的提取溶劑包括甲醇、乙腈、正己烷、乙酸乙酯等，根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)選擇合適的提取溶劑，利用“相似相溶”的原則，選擇能夠溶解目標(biāo)化合物最大或者最合適的溶劑。一般情況下，對(duì)于極性較小的農(nóng)藥，可以選用正己烷、石油醚等，極性稍強(qiáng)的農(nóng)藥通常選擇極性溶劑或者含水溶劑，如甲醇、乙腈等。

本實(shí)驗(yàn)中選擇最常用的甲醇和乙腈作為提取溶劑，分別考察了兩種溶劑的提取效果。使用氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至空白的糙米、稻殼、秸稈樣品中，使得上述3種基質(zhì)中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的含量均為0.1mg/kg。如圖2所示，使用甲醇對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的提取率在68.7%～88.4%之間，50%乙腈水的提取率在97.6%～99.7%之間，純乙腈對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的提取率在86.4%～91.6%之間。因此，50%乙腈水是提取糙米、稻殼和秸稈中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的最佳溶劑。

圖2 提取溶劑對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺提取率的影響

2.2 凈化方法的選擇

在糙米(10.0 g)、稻殼(2.0 g)、秸稈樣品(2.0 g)中加入氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使糙米、稻殼和秸稈空白樣品中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的濃度均為0.1mg/kg，根據(jù)2.1中選用的提取溶劑先后加入20m L的蒸餾水和20m L的分析純乙腈提取氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺，振蕩提取30m in后，在上述的提取液中加入5 g NaCl，振蕩鹽析后取1m L的上層有機(jī)相。在該提取溶劑中分別加入25、50、75和100mg的PSA、C18和GCB來(lái)確定最佳的凈化劑和種類(lèi)和使用量。結(jié)果表明，當(dāng)使用25～100mg的GCB來(lái)凈化糙米、稻殼和秸稈的1m L提取液時(shí)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺在糙米中的回收率在38.4%到88.4%之間，在稻殼中的回收率低于81.6%，而在秸稈中的回收率則為48.2%～87.4%，且隨著GCB使用量的增大，其回收率逐漸降低。而當(dāng)使用25～100mg PSA來(lái)凈化糙米、稻殼和秸稈的1m L提取液結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用75mg的PSA凈化糙米提取液時(shí)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的回收率最高，分別為95.2%和94.7%，使用50mg PSA凈化稻殼和秸稈提取液時(shí)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的回收率最高，在95.6%和99.4%之間。而當(dāng)使用25mg C18凈化糙米的提取液時(shí)糙米中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的回收率為96.8%～99.6%，而當(dāng)C18使用量逐漸增加時(shí)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的回收率逐漸降低，均低于88.4%。由此結(jié)果可見(jiàn)過(guò)量的C18凈化劑能夠吸附提取液中的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺。在兼顧糙米、稻殼和秸稈中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的添加回收率和使用凈化劑的成本，在本方法中選擇50mg PSA凈化稻殼和秸稈中的雜質(zhì)，而選擇25mg C18凈化糙米中的雜質(zhì)（表3）。

表3 提取溶液中凈化劑PSA，C18和GCB的優(yōu)化

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線(xiàn)性關(guān)系和檢出限 在1.5中的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件下，分別測(cè)定氯蟲(chóng)苯甲酰胺(0.1、1、10、20、100 μg/L)和噻蟲(chóng)胺(0.1、1、10、20、100、500 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，獲得氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺定性離子對(duì)的峰面積。以氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，定性離子的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(y)來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。氯蟲(chóng)苯甲酰胺在0.1～100μg/L線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性回歸方程為：y=25143x+13865，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9998；噻蟲(chóng)胺胺在0.1～500μg/L線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性回歸方程為：y=3357x+7819，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9998。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算，氯蟲(chóng)苯甲酰胺的檢出限為2.95×10-5ng，噻蟲(chóng)胺的檢出限為5.79×10-5ng。以低檔添加水平為準(zhǔn)，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺在糙米中的定量限均為0.005mg/kg，在稻殼和秸稈中的定量限均為0.025mg/kg（圖3）。

圖3 氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的線(xiàn)性關(guān)系

2.3.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度 氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定采用的是添加回收的方法，在空白的糙米樣品中添加濃度為0.005、0.01和0.2mg/kg的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在空白的稻殼和秸稈樣品中添加濃度為0.025、0.05和1.0mg/kg的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度重復(fù)5次，并利用1.3和1.5中優(yōu)化的分析方法進(jìn)行前處理和測(cè)定。通過(guò)計(jì)算空白糙米、稻殼和秸稈中3個(gè)添加水平的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以回收率來(lái)確定該方法的準(zhǔn)確度，而RSD來(lái)衡量該方法的精密度。糙米、稻殼和秸稈中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4。由測(cè)定結(jié)果可知，氯蟲(chóng)苯甲酰胺在糙米、稻殼和秸稈樣品中的加標(biāo)平均回收率為92.2%～105.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～10.1%之間；噻蟲(chóng)胺的平均回收率為83.2%～98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.3%。回收率和精密度均滿(mǎn)足檢測(cè)水稻基質(zhì)中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的方法要求。

表4 氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的添加回收率

3 討論與結(jié)論

目前對(duì)于同時(shí)測(cè)定水稻基質(zhì)中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法并未見(jiàn)報(bào)道，僅有兩種農(nóng)藥單獨(dú)的檢測(cè)方法，而隨著氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的復(fù)配農(nóng)藥的生成和施用，能夠同時(shí)測(cè)定上述兩種農(nóng)藥的分析方法便顯得尤為重要。本文利用QuEChERS前處理結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時(shí)測(cè)定氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺在水稻中的殘留分析方法，能夠滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的需要。創(chuàng)新點(diǎn)在于建立的方法能夠適用于水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺農(nóng)藥殘留的同時(shí)測(cè)定，分析方法前處理操作簡(jiǎn)單、節(jié)約了試驗(yàn)成本。

對(duì)于提取溶劑的選擇，目前，常見(jiàn)的用于農(nóng)藥殘留的提取溶劑有丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈、乙酸乙酯等[17-18]，考慮到氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的在各種溶劑中的溶解度不同，本研究選用了純甲醇、50%乙腈和純乙腈來(lái)優(yōu)化提取溶劑，通過(guò)上述3種溶劑在糙米、稻殼和秸稈中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的提取效果，來(lái)確定最合適的提取溶劑。由于農(nóng)藥施用后部分農(nóng)藥通過(guò)滲透、吸收等方式進(jìn)入到植物體內(nèi)，因此這部分的農(nóng)藥需要在加水的情況下才能夠更好的被有機(jī)溶劑提取出來(lái)，因?yàn)樵谒嬖诘那闆r下能夠?qū)⒓?xì)胞進(jìn)行軟化，增加細(xì)胞的通透性，使得有機(jī)溶劑能夠有效的進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，從而能夠提高有機(jī)溶劑對(duì)植物體內(nèi)農(nóng)藥的提取效率[19]，因此選擇50%乙腈水作為氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的提取溶劑。對(duì)于凈化劑的選擇，在QuEChERS前處理方法中，最常用的材料包括PSA、GCB、C18等[20]。PSA能夠有效的吸附農(nóng)藥殘留提取溶劑中的糖類(lèi)、有機(jī)酸以及脂肪酸等一些極性雜質(zhì)；C18吸附農(nóng)藥殘留提取液中脂質(zhì)、色素等一些非極性的雜質(zhì)；而GCB具有雙面性，最主要的凈化效果為吸附提取液中的色素等有色雜質(zhì)，但GCB對(duì)某些特殊的農(nóng)藥也有一定的吸附性[21-22]。對(duì)糙米而言，選用C18的凈化效果最好，且用量較低。在凈化劑PSA中存在兩個(gè)氨基，而這兩個(gè)氨基的結(jié)構(gòu)能夠有效的結(jié)合稻殼和秸稈中的糖類(lèi)、有機(jī)酸、色素和脂肪酸等極性的雜質(zhì)，而且PSA可以較好的凈化稻殼和稻桿中的雜質(zhì)且對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺沒(méi)有吸附的影響。本文建立的分析方法能夠同時(shí)準(zhǔn)確測(cè)定水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺殘留量，在提取方式上未進(jìn)行詳盡的比較試驗(yàn)，且未建立土壤基質(zhì)中氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的前處理和檢測(cè)方法，應(yīng)在完善提取方式及在土壤中的殘留量做相應(yīng)方法的試驗(yàn)。

氯蟲(chóng)苯甲酰胺在0.1～100μg/L、噻蟲(chóng)胺胺在0.1～500μg/L線(xiàn)性關(guān)系良好，在優(yōu)化條件的條件下氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺在糙米、稻殼和秸稈基質(zhì)中的平均回收率在83.2%～105.4%之間，變異系數(shù)為1.2%～10.1%，氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺的最低檢出限分別為2.95×10-5和5.79×10-5ng，在糙米基質(zhì)中的定量限為0.005mg/kg，在稻殼和秸稈中的定量限均為0.025mg/kg。本研究建立的分析方法能夠簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、快速有效的同時(shí)測(cè)定水稻糙米、稻殼和秸稈中的氯蟲(chóng)苯甲酰胺和噻蟲(chóng)胺，該方法完全能夠滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留分析要求，適用于大量水稻樣品的快速檢測(cè)，為政府監(jiān)管提供有效的檢測(cè)分析手段。