虞隨 姚立鋒 蘇翼 龐彤彤 嚴澤軍 劉厚先

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是指從原發(fā)實體瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落，侵襲進入外周血液循環(huán)的細胞，其具有原發(fā)灶腫瘤細胞相似的遺傳特性與抗原[1]。薈萃分析顯示外周血CTCs陽性與膀胱癌腫瘤分期、組織學分期、轉(zhuǎn)移和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，是腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的最直接因素[3]。另外，外周血中CTCs數(shù)量的改變要先于傳統(tǒng)影像學檢查的改變[4]，在膀胱癌診斷中具有潛在價值。傳統(tǒng)經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）被認為是治療非肌層浸潤性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）的“金標準”。但有研究發(fā)現(xiàn)在TURBT中，腫瘤細胞有經(jīng)血流播散的風險，而將膀胱腫瘤整體切除或許能解決這一問題[5]?；诖?，本研究對初發(fā)NMIBC患者采用經(jīng)尿道膀胱腫瘤整塊切除術(shù)（en bloc transurethral resection of bladder tumor，EBRT）治療，與同期行TURBT的患者進行比較，觀察兩種術(shù)式在腫瘤切除前后CTCs數(shù)量的變化差異，探討EBRT的臨床應用價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年8月至2020年7月寧波市第一醫(yī)院泌尿外科連續(xù)收治的擬行手術(shù)治療的57例初發(fā)NMIBC患者為研究對象，采用隨機數(shù)字表法分為兩組，分別行 EBRT（EBRT組）和 TURBT（TURBT組）治療。納入標準：（1）經(jīng)膀胱鏡檢查診斷為膀胱腫瘤患者；（2）影像學檢查提示膀胱肌層未受侵犯，無遠處轉(zhuǎn)移；（3）單個腫瘤直徑為l～4 cm；（4）腫瘤數(shù)量＜3個；（5）術(shù)前評估能耐受手術(shù)。排除標準：（1）腫瘤位于膀胱頸口和前壁；（2）既往接受過膀胱癌手術(shù)治療；（3）既往接受放、化療；（4）合并其他腫瘤。因患者情況在術(shù)中及術(shù)后與初期納入時可能存在差異，制定剔除標準：（1）術(shù)后病理提示非尿路上皮腫瘤或原位癌或腫瘤分期≥T2期；（2）術(shù)后因出血需再次手術(shù)止血；（3）因樣本采集、保存方法不規(guī)范等原因至CTCs檢測失敗；（4）因任何原因要求退出研究者。手術(shù)均由3位同組高年資醫(yī)師（10年以上NMIBC內(nèi)鏡治療經(jīng)驗）完成。本研究通過寧波市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批（批件號：2018-R069），所有患者均簽署知情同意書。

本研究共剔除患者9例，其中3例術(shù)后病理報告提示為尿路上皮內(nèi)翻性乳頭狀瘤，2例術(shù)后病理報告提示為肌層浸潤性膀胱癌（T2分期），1例術(shù)后24 h內(nèi)因出血再次行手術(shù)電凝止血，3例因樣本采集、保存方法不規(guī)范等原因致CTCs檢測失敗，最終本研究共納入48例患者，其中EBRT組27例，TURBT組21例。

1.2 治療方法

1.2.1 手術(shù)方法 EBRT組患者術(shù)前8～12 h常規(guī)禁食，待連續(xù)硬膜外麻醉效果滿意后采取膀胱截石位，進行常規(guī)消毒鋪巾，使用日本奧林巴斯F26等離子電切鏡，在雙極模式下進行切除手術(shù)。設定電切功率為200 W，電凝功率為120 W，患者術(shù)前均未行閉孔神經(jīng)阻滯，術(shù)中以0.9%氯化鈉溶液作為沖洗液。術(shù)中使用針狀電極電凝距腫瘤基底周邊1 cm處的膀胱黏膜層，以標記切除范圍；同時封閉基底周圍怒張的血管，以減少術(shù)中出血，保持術(shù)中視野清晰，以實現(xiàn)術(shù)中精準切割，避免損傷正常的膀胱黏膜。然后用電極的尖端插入黏膜層，將黏膜挑起與肌層分開，將腫瘤周圍的膀胱黏膜連同部分肌層完整地切除，腫瘤基底組織單獨送檢。術(shù)后更換環(huán)狀電極對創(chuàng)面進行徹底止血。腫瘤標本體積較小時可直接用0.9%氯化鈉溶液經(jīng)電切鏡鞘沖出或使用環(huán)狀電極勾出標本，若腫瘤標本體積較大，可以在完全封閉膀胱腫瘤周圍血供后，使用環(huán)狀電極在基底部縱向切開病灶，分為兩部分或兩部分以上，后再沿電切鏡鞘完整取出。TURBT組患者使用環(huán)狀電極，常規(guī)經(jīng)尿道將腫瘤逐層分片切除，直至露出膀胱壁肌層，腫瘤基底組織單獨送檢，并將距腫瘤周邊1.0 cm的瘤旁組織切除。腫瘤碎片較少時，可直接用0.9%氯化鈉溶液經(jīng)電切鏡鞘沖出或使用環(huán)狀電極勾出標本，若腫瘤碎片較多，使用ELLIK沖洗瓶完全沖出組織標本。

1.2.2 術(shù)后治療 所有患者術(shù)中及術(shù)后將輸液袋置于膀胱上方50 cm處，術(shù)后均留置F22三腔導尿管，行膀胱連續(xù)沖洗12～24 h。術(shù)后24 h內(nèi)均行吉西他濱1.0 g膀胱灌注化療。

1.3 CTCs檢測方式 兩組患者在術(shù)前和術(shù)后72 h，分別從外周靜脈中抽取3.2 ml血液樣本檢測CTCs。注意將患者前2 ml血液棄去，以避免靜脈穿刺過程中混入表皮細胞致CTCs計數(shù)呈假陽性，所有樣本均在4℃冰箱內(nèi)保存，24 h內(nèi)送檢處理。本研究采用中國萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司Cyttel技術(shù)富集CTCs，后續(xù)采用免疫熒光與原位雜交結(jié)合技術(shù)（immuno fluorescence in situ hybridizationt，imFISH）鑒定 CTCs。另外，本研究選擇同期健康志愿者血樣本10例，進行CTCs檢測。本研究將CTCs定義為同時滿足染色體超二倍體、CD45陰性、4',6-二脒基-2-苯基吲哚陽性的細胞。由2位實驗室檢驗人員進行CTCs計數(shù)，檢驗者對臨床病理數(shù)據(jù)不知情。CTCs陽性界定標準:患者外周血標本中CTCs檢測值≥2個/3.2 ml為陽性。

1.4 觀察指標 觀察并比較：（1）兩組患者的一般資料，包括性別、年齡、吸煙史、BMI、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤最大徑、術(shù)前CTCs陽性率等；（2）不同臨床特征患者術(shù)前外周血CTCs計數(shù)；（3）兩組患者手術(shù)前后外周血CTCs計數(shù)；（4）兩組患者預后情況；（5）復發(fā)患者與未復發(fā)患者術(shù)后CTCs計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內(nèi)術(shù)前、術(shù)后比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者性別、年齡、吸煙史、BMI、腫瘤分期、腫瘤分級、腫瘤最大徑、術(shù)前CTCs陽性率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。此外，本研究10位健康志愿者中均未檢測出外周血CTCs。

表1 兩組患者一般資料比較[例（%）]

2.2 不同臨床特征患者術(shù)前外周血CTCs計數(shù)比較不同年齡、性別、吸煙史、BMI和腫瘤最大徑患者術(shù)前CTCs計數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。T1分期患者術(shù)前外周血CTCs計數(shù)高于Ta分期患者（P＜0.05）。腫瘤分級為高級別的患者術(shù)前外周血CTCs計數(shù)高于低級別患者（P＜0.05）。見表2。

表2 不同臨床特征患者術(shù)前外周血CTCs計數(shù)比較

2.3 兩組患者手術(shù)前后外周血CTCs計數(shù)比較 術(shù)前兩組患者外周血CTCs計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），術(shù)后EBRT組患者外周血CTCs計數(shù)低于TURBT組（P＜0.05）。EBRT組患者術(shù)后CTCs水平與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而TURBT組患者術(shù)后CTCs計數(shù)高于術(shù)前（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者手術(shù)前后外周血CTCs計數(shù)比較（個/3.2 ml）

2.4 兩組患者預后情況比較 兩組患者術(shù)后隨訪12～26個月，中位隨訪時間22個月，EBRT組術(shù)后復發(fā)2例（分別在術(shù)后11、13個月復發(fā)），TURBT組術(shù)后復發(fā)3例（分別在術(shù)后3、6、7個月復發(fā)）。生存分析顯示，兩組患者1年無復發(fā)生存率比較差異無統(tǒng)計學意義（92.4%比 85.7%，P＜0.05），見圖 1。

圖1 兩組患者術(shù)后無復發(fā)生存曲線比較

2.5 復發(fā)患者與未復發(fā)患者術(shù)后CTCs計數(shù)比較術(shù)后復發(fā)的患者術(shù)后CTCs計數(shù)高于術(shù)后未復發(fā)患者[（12.00±4.80）個/3.2 ml比（6.30±4.25）個/3.2 ml，P＜0.05]。

3 討論

CTCs這一概念最早由Ashworth于1869提出[6]，其在1例癌癥患者的外周血中發(fā)現(xiàn)了某些細胞與腫瘤細胞相似。CTCs的形成過程非常復雜，通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，腫瘤細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、黏附分子及其骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降低黏附能力并增強可塑性后脫落入血，逃脫宿主免疫系統(tǒng)及避免血流剪切力；同時腫瘤細胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶通過增強腫瘤細胞遷移能力，使其在血液循環(huán)中擴散、遷移[7]。近年來，CTCs檢測因具有微創(chuàng)、快速、便捷、特異性高等優(yōu)點，并與腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、胃癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤臨床診療中發(fā)揮出越來越大的價值[8-10]。通過檢測CTCs，臨床可以追蹤膀胱癌患者的腫瘤細胞從早期原發(fā)病灶微轉(zhuǎn)移至晚期遠處轉(zhuǎn)移的全過程，目前該技術(shù)已經(jīng)在膀胱癌的診斷分期、選擇治療方案及評價預后中發(fā)揮了重要的作用[11]。

目前CTCs檢測方式超過50種，其中美國強生公司CellSearch系統(tǒng)是唯一標準化平臺，已獲得美國FDA批準[12]。該系統(tǒng)需要依賴上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗原陽性標記 CTCs，靈敏度較低。為避免這一不足，本研究采用了Cyttel技術(shù)，利用CD45磁珠抗體將白細胞吸附并去除，陰性富集全部特征的CTCs，排除傳統(tǒng)依賴于EpCAM抗原表達捕獲CTCs的局限性，可最大限度地獲取血液中的CTCs[13]。后續(xù)采用imFISH鑒別技術(shù)，通過判別染色體超二倍體性，同時偶聯(lián)血源性細胞標志物排除血源性異常細胞的干擾從而鑒別CTCs，較之傳統(tǒng)上皮標志物蛋白染色的 CTCs鑒別方法具有更高的靈敏度和特異度。本研究中患者術(shù)前CTCs陽性率為70.83%，與文獻報道相近[14]，且在10位健康志愿者中均未檢測出CTCs。然而該技術(shù)單次檢測成本較高，這也制約筆者團隊進行大樣本數(shù)據(jù)采集。

一項薈萃分析顯示，外周血CTCs陽性與膀胱癌腫瘤分期、組織學分期、轉(zhuǎn)移和局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示外周血中CTCs的存在是膀胱癌患者預后不良的獨立預測指標[2]?？姂碌萚15]在NMIBC患者中研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后CTCs計數(shù)≥5個/3.2 ml的患者復發(fā)及轉(zhuǎn)移風險均遠高于CTCs計數(shù)＜5個/3.2 ml的患者。而在本研究中，筆者觀察到在術(shù)后復發(fā)的5例患者中，術(shù)后CTCs均≥5個/3.2 ml，且這5例患者術(shù)后CTCs水平顯著高于術(shù)后未復發(fā)患者，提示了CTCs用于監(jiān)測膀胱癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移進展的價值。本研究所有患者術(shù)后24 h內(nèi)均行吉西他濱1.0 g膀胱灌注化療，并視患者疾病復發(fā)風險高低進行吉西他濱1.0 g膀胱灌注化療1～3年。

膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤之一[16]，其中NMIBC占75%以上[17]。雖然NMIBC被認為是一種非侵襲性腫瘤，但其復發(fā)風險高達78%，進展風險高達45%[18]。目前TURBT被認為是治療NMIBC的“金標準”，然而TURBT在切除腫瘤時需將腫瘤逐片切除，在碎片化過程中可能導致腫瘤擴散、種植轉(zhuǎn)移，與腫瘤手術(shù)的“無瘤原則”相悖。Engilbertsson等[5]在行TURBT術(shù)后發(fā)現(xiàn)患者CTCs計數(shù)升高，提示術(shù)中可能存在癌細胞入血。而在本研究中，TURBT組患者術(shù)后CTCs計數(shù)顯著高于術(shù)前，這與文獻報道結(jié)果相符。

EBRT相較于傳統(tǒng)開放膀胱部分切除術(shù)具有出血風險小，術(shù)后并發(fā)癥少等優(yōu)點，相較于TURBT術(shù)，可減少術(shù)中漂浮的腫瘤細胞數(shù)量并降低腫瘤再植的風險，更遵循“無瘤原則”。一項薈萃分析顯示接受EBRT治療患者的住院時間、置管時間、術(shù)中及術(shù)后并發(fā)癥和24個月復發(fā)率明顯低于接受TURBT治療的患者[19]。另外由于沒有頻繁使用電凝，EBRT術(shù)后完整切除的腫瘤標本有助于更準確地進行病理學分級和分期。本研究結(jié)果顯示，EBRT組患者術(shù)后CTCs計數(shù)與術(shù)前比較無統(tǒng)計學差異。組間比較，現(xiàn)TURBT組患者術(shù)后CTCs計數(shù)高于EBRT組，進一步提示了EBRT相比于TURBT能降低癌細胞入血的風險。

目前膀胱腫瘤的大小是EBRT的主要限制。大部分研究選擇最大徑≤3 cm的膀胱腫瘤行EBRT手術(shù)[20-22]。對于難以整塊取出的較大膀胱腫瘤，有學者提出可以在EBRT后沿基底部分塊切除膀胱腫瘤[23]，或先分段切除膀胱腫瘤外生部分，后整體切除腫瘤基底部[24]。歐洲泌尿外科協(xié)會共識中提出，即使對于最大徑＞3 cm的膀胱腫瘤，EBRT仍然是可行的，依舊能保留病理精確分期和腫瘤完整切除的優(yōu)點[25]。雖然EBRT術(shù)后腫瘤標本切碎后在膀胱內(nèi)留置時間較短，但仍可能存在癌細胞入血的風險。在本研究中，針對10例EBRT術(shù)中腫瘤較大無法將其從膀胱中完整取出的患者，筆者團隊使用環(huán)狀電極對創(chuàng)面徹底止血后，將腫瘤在基底部縱向切開分塊取出，術(shù)后CTCs數(shù)量增加與標本完整取出的17例相比無統(tǒng)計學差異。由于本研究樣本量相對較小，尚無法確定EBRT術(shù)中將腫瘤分塊取出膀胱是否會導致患者腫瘤種植及復發(fā)風險增加，下一步需要進一步擴大樣本量進行前瞻性研究。

在文獻報道中，EBRT組的2年復發(fā)率為10.0%，TURBT組的2年復發(fā)率為38.5%，兩者有統(tǒng)計學差異[26]。對于本研究所有患者，筆者團隊進行終身隨訪，每3個月復查泌尿系統(tǒng)彩色超聲、膀胱鏡等檢查。本研究發(fā)現(xiàn)兩組患者術(shù)后1年無復發(fā)生存率比較無統(tǒng)計學差異，術(shù)后復發(fā)患者二次手術(shù)后均無再次復發(fā)，這可能與本研究隨訪時間較短有關(guān)。對于復發(fā)患者，本次研究未進行CTCs再次檢測，后續(xù)有待進一步實驗研究CTCs與膀胱癌復發(fā)的關(guān)系。據(jù)文獻報道，CTCs和循環(huán)腫瘤DNA可能在預后和轉(zhuǎn)移評估中具有互補作用[27]。因此，兩者的共同檢測在未來膀胱癌的診療中或許能發(fā)揮更大的作用。后續(xù)筆者團隊將繼續(xù)隨訪觀察患者術(shù)后復發(fā)情況，進一步分析CTCs和循環(huán)腫瘤DNA與NMIBC預后及進展之間的關(guān)系。

綜上所述，與TURBT比較，EBRT治療NMIBC可以降低患者術(shù)后外周血中因膀胱腫瘤切除播散的CTCs數(shù)量，可能是治療NMIBC更為優(yōu)良的手術(shù)方式。當然，這需要后續(xù)進行多中心、大樣本的隨機對照研究進一步驗證。