郭 影，梁 婷，王學(xué)忠

研究[1]表明，硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)在慢性腎病患者中觀察到的心血管疾病進程中起促進作用。體外實驗證實了IS通過增強氧化應(yīng)激上調(diào)心肌細胞的自噬水平[2]。但是，尚不清楚IS誘導(dǎo)的心肌細胞自噬水平的更深層機制。解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)位于線粒體內(nèi)膜，在心肌組織中廣泛表達[3]。研究[4]表明UCP2可以通過抑制活氧性生成來保護心肌細胞免受氧化應(yīng)激引起的凋亡和過度自噬。據(jù)報道[5]，miRNA-22(miR-22)在心臟中高度表達，并作為心臟重塑的重要調(diào)節(jié)劑。然而，miR-22是否通過UCP2保護心肌細胞免受IS誘導(dǎo)的凋亡和過度自噬尚不清楚。該研究探討miR-22在調(diào)節(jié)IS誘導(dǎo)的心肌細胞自噬作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 10%胎牛血清購自美國HyClone公司；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基購自美國Thermo Scientific公司；3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑、硫酸吲哚酚均購自美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)測量試劑盒購自美國Promega公司；miR-22模擬物(mimic-miR-22)、miR-22抑制劑(anti-miR-22)和UCP2過表達物(LeUCP2)均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、MicroRNA qRT-PCR Sybr Green檢測試劑盒、SYBR RT-PCR試劑盒均購自日本Takara Biochemical公司；裂解緩沖液購自美國Roche Applied Science公司；PVDF膜購自美國Merck Millipore公司；p-62抗體、LC3Ⅰ/Ⅱ抗體、UCP2抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、caspase-3抗體和β-actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體購自美國Abcam公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)檢測試劑盒購自美國BD Biosciences公司；Quik突變株試劑盒購自德國Stratagene公司；pmiRGLO載體購自美國Promega公司。

1.1.2儀器 FL-600酶標儀購自美國BioTek公司；實時PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystems公司；利用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)購自上海Tanon公司；BD FACSDiva Software v7.0購自美國Becton-Dickinson公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)人心肌母細胞H9c2購自美國ATCC公司，將其培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基。

1.3 細胞增殖測定使用MTT來檢測細胞的活力。將H9c2接種在96孔板中，然后暴露于連續(xù)濃度的IS(100、250、500、1 000 μmol/L)中48 h。在另一個實驗中，將H9c2與500 μmol/L IS孵育24、48、72 h。用IS處理后，將20 μl MTT工作溶液(5 mg MTT/ml溶于磷酸鹽緩沖液，PBS)添加到每個孔中，并在37 ℃下孵育5 h。棄上清液，將沉淀用150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解10 min。使用FL-600酶標儀在570 nm波長處檢測吸光度。為了驗證數(shù)據(jù)，每個測定進行了3次。

1.4 細胞毒性的測定為了分析IS對H9c2的細胞毒性作用，使用LDH測量試劑盒測定細胞釋放的LDH。具體操作為：將H9c2接種在96孔板中，然后暴露于連續(xù)濃度的IS(100、250、500、1 000 μmol/L)中48 h。吸取50 μl上清液轉(zhuǎn)移至96孔酶法測定板，向每個孔加入50 μl重組底物混合物。蓋住平板，在室溫下避光孵育30 min。最后，加入停止液，并用FL-600酶標儀在490 nm處記錄吸光度。實驗進行了3次以驗證結(jié)果。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的H9c2細胞，以5×104個/孔接種于24孔板，用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑，分別將mimic-miR-22(50 nmol/L)、anti-miR-22(100 nmol/L)和LeUCP2(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細胞。加入亂碼miR-22或空慢病毒載體作為對照。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞并進行以下測定。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)和實時定量PCR使用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細胞中分離了總RNA。為了量化miR-22 miRNA的表達，使用針對特定miRNA的特殊莖環(huán)引物合成cDNA，然后使用MicroRNA qRT-PCR Sybr Green檢測試劑盒和7500序列檢測實時PCR系統(tǒng)確定miRNA表達水平。比較Ct(閾值周期)值用于量化miRNA表達水平。為了量化UCP2 mRNA的表達，使用SYBR RT-PCR試劑盒合成cDNA并進行RT-PCR分析。U6和β-actin分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)部對照。miRNA和mRNA表達水平以相對于對應(yīng)對照樣品表達水平的倍數(shù)變化表示，并使用2-ΔΔCt方法計算。實驗使用引物如下：miR-22引物，正向5′-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3′和反向5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；大鼠U6引物，正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin引物，正向5′-CGACCACACACAGAGGGAGAT-3′和反向5′-GCCGATTCACACCGAGTA-3′；UCP2引物，正向5′-TGC TGAGCTGGTGACCTATG-3′和反向5′-CCAGGGCAG AGTTCATGTAT-3′。

1.7 Western blot分析用PBS清洗細胞，并在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冰冷裂解緩沖液中裂解細胞。然后在12 000 r/min下4 ℃離心10 min。在10% SDS-PAGE凝膠上分離等量的細胞裂解物(20 μg)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。這些膜在TBST中用5%吐溫-20在室溫下阻斷2 h，然后將p-62抗體(1 ∶1 000)、LC3Ⅰ/Ⅱ抗體(1 ∶800)、UCP2抗體(1 ∶800)、Bcl-2抗體(1 ∶2 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、caspase-3抗體(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)第一抗體與膜在4 ℃孵育過夜。次日，在室溫下用辣根過氧化物酶結(jié)合的第二抗體孵育1 h。利用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)對抗體復(fù)合物進行了可視化和定量分析。用相對密度法測定靶蛋白表達水平，并將其標準化為β-actin對應(yīng)的條帶。

1.8 流式細胞儀分析使用膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)檢測試劑盒對細胞進行了染色，并通過流式細胞儀分析細胞存活情況。首先，使用胰蛋白酶消化細胞(6×105個)，然后將細胞在室溫下于黑暗中重懸于100 μl含5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI的結(jié)合緩沖液中10 min，然后將400 μl結(jié)合緩沖液添加至混合物中。在停止反應(yīng)后1 h內(nèi)通過流式細胞術(shù)分析細胞。使用BD FACSDiva Software v7.0評估流式細胞儀數(shù)據(jù)。每組共計數(shù)10 000個細胞進行統(tǒng)計分析，每次評估重復(fù)3次。

1.9 雙熒光素酶報告分析使用引物5′-AAACGGACTCGCAGCGAGCTCCAG-3′和5′-CGACTCTAGA CTAGATACATGACTCTAACATTTGCC-3′通過PCR擴增含有推定的miR-22靶位點的UCP2的野生型(WT)3′非翻譯區(qū)(3′UTR-WT)的片段。同時通過使用Quik突變株試劑盒對pGL3-UCP2-3′ UTR載體上帶有的miR-22靶點序列中的seed sequence序列進行點突變。隨后，將包含UCP2的3′UTR-WT或3′UTR-MUT(突變型)片段插入緊鄰熒光素酶基因序列下游的pmiRGLO載體中。在報告分析中，該研究用熒光素酶報告構(gòu)建物和mimic-miR-22、anti-miR-22或陰性對照miRNAs共轉(zhuǎn)染了H9c2細胞。轉(zhuǎn)染后48 h，裂解細胞，用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性。熒光素酶活性水平被標準化為腎素?zé)晒馑孛富钚运健?/p>

2 結(jié)果

2.1 IS對H9c2細胞增殖、毒性和自噬的影響MTT分析結(jié)果顯示，IS可以劑量依賴性地抑制H9c2的增殖(圖1A)，并且隨著暴露的時間的延長，由500 μmol/L IS誘導(dǎo)的H9c2增殖的抑制作用增加(圖1B)。同時，用500 μmol/L或1 000 μmol/L IS處理48 h可增加H9c2中LDH的釋放(圖1C)。此外，Western blot分析顯示，IS可以劑量依賴性地降低H9c2細胞中p62的表達(F=16.137，P<0.001)，并促進LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化(F=28.424，P<0.001，圖1D、E)。

圖1 IS對H9c2細胞增殖、毒性和自噬的影響A：MTT法檢測不同濃度IS對H9c2細胞增殖的影響；B：MTT法檢測IS不同處理時間對H9c2細胞增殖的影響；C：不同濃度IS對H9c2細胞毒性的影響；D、E：不同濃度IS對H9c2細胞p62蛋白表達及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的Western blot結(jié)果和定量數(shù)據(jù)；與對照組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001

2.2 miR-22對IS誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡的影響為了檢查miR-22對IS處理過的心肌細胞的作用，研究通過用miR-22模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染H9c2細胞來誘導(dǎo)miR-22過表達和敲低。轉(zhuǎn)染效率如圖2A、B所示，與對照組相比，miR-22模擬組中的miR-22水平升高(P<0.001)，而miR-22抑制劑組中的miR-22水平降低(P<0.001)。在暴露于IS條件下，與接受對照處理的H9c2細胞相比，IS組的存活H9c2細胞數(shù)量減少(t=4.614，P=0.006)，而凋亡和壞死細胞的數(shù)量卻增加了(t=4.526、4.638，P=0.007、0.006)。用miR-22模擬物治療可減少壞死和凋亡細胞的百分比(t=3.142、3.315，P=0.037、0.034)，而用miR-22抑制劑治療可進一步增加凋亡和壞死細胞的百分比(t=6.753、6.841，P<0.001)(圖2 C、D)。

圖2 miR-22對IS處理過的心肌細胞的作用A、 B：qRT-PCR分析miR-22模擬物、miR-22抑制劑或相應(yīng)的陰性對照(n=3)轉(zhuǎn)染的H9c2細胞中miR-22表達；與對照組比較：***P<0.001；C、D：流式細胞術(shù)分析顯示miR-22對H9c2細胞壞死、凋亡和存活的影響(n=3)；與正常組比較：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001；與IS組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3 miR-22對IS誘導(dǎo)的自噬的影響Western blot分析顯示，在暴露于IS條件下，miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的H9c2細胞與相應(yīng)的陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比具有更低的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值(t=8.259，P<0.001)，p62蛋白表達提高(t=2.716，P=0.043)(圖3A、B)；而miR-22抑制劑則產(chǎn)生了相反的結(jié)果(t=4.329，P=0.005；p62：t=4.473，P=0.004)(圖3C、D)。

圖3 miR-22對IS誘導(dǎo)自噬的影響 A、 B：miR-22模擬物對H9c2細胞p62蛋白表達及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的Western blot結(jié)果和定量數(shù)據(jù)；C、D：miR-22抑制物對H9c2細胞p62蛋白表達及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的Western blot結(jié)果和定量數(shù)據(jù)；1:正常組;2:IS組;3:mimic-miR-22-IS組;4:mimic-NC+IS組；5：anti-miR-22-IS組;6:anti-NC+IS組；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與mimic-NC+IS或anti-NC+IS組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001

2.4 miR-22靶向UCP2qRT-PCR和Western blot分析表明，在暴露于IS條件下，miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的H9c2細胞與相應(yīng)的陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比具有更高的UCP2 mRNA和蛋白表達(t=4.437、4.614，P=0.007、0.005)；而miR-22抑制劑則產(chǎn)生了相反的結(jié)果(t=3.572、4.533，P=0.025、0.005)。為了證實miR-22與UCP2之間的關(guān)系，研究進行了雙重?zé)晒馑孛笀蟾婊驒z測。結(jié)果顯示，在UCP2 3′UTR WT組中，與陰性對照轉(zhuǎn)染細胞相比，miR-22模擬轉(zhuǎn)染的細胞中標準化螢光素酶活性水平增加(t=7.843，P<0.001)，而在抑制劑轉(zhuǎn)染的細胞中則降低(t=4.823，P=0.003)。但是在UCP2 3′UTR MUT組中，用miR-22模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染后的熒光素酶構(gòu)建體的活性水平較陰性對照未發(fā)生變化。見圖4。

圖4 miR-22靶向UCP2A、 B：qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染miR-22模擬物、miR-22抑制劑或相應(yīng)陰性對照后48 h的H9c2細胞中UCP2 mRNA表達水平；C～F：miR-22模擬物、miR-22抑制劑對H9c2細胞中UCP2蛋白表達的Western blot結(jié)果和定量數(shù)據(jù)；與mimic-NC+IS或anti-NC+IS組比較：*P<0.05，**P<0.01；G：miR-22在UCP2的WT 3′UTR和MUT 3′UTR中的預(yù)測結(jié)合位點；H、I：雙熒光素酶報告基因測定miR-22模擬物和miR-22抑制劑轉(zhuǎn)染的H9c2細胞中的熒光素酶活性水平；1:正常組;2:IS組;3:mimic-miR-22-IS組;4:mimic-NC+IS組；5：anti-miR-22-IS組;6:anti-NC+IS組；與mimic-NC或anti-NC組比較：△△P<0.01；與mimic-miR-22+UCP2 3′UTR或anti-miR-22+UCP2 3′UTR組比較：##P<0.01，###P<0.001

2.5 UCP2介導(dǎo)miR-22在IS刺激H9c2細胞中的保護作用Western blot分析結(jié)果見圖5所示，LeUCP2轉(zhuǎn)染的H9c2細胞中UCP2表達水平明顯升高，表明LeUCP2轉(zhuǎn)染的效率很高。與空慢病毒載體對照相比，LeUCP2轉(zhuǎn)染導(dǎo)致暴露于IS的H9c2細胞或miR-22抑制劑轉(zhuǎn)染的H9c2細胞中Bcl-2/Bax比率和p62表達增加(tLeUCP2=7.162、4.673，P<0.001、0.005；tanti-miR-22=7.514、3.614，P<0.001、0.019)以及cleaved-caspase3和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值降低(tLeUCP2=3.044、2.836，P=0.024、0.030；tanti-miR-22=3.173、4.388，P=0.024、0.009)。

圖5 UCP2介導(dǎo)miR-22在IS刺激H9c2細胞中的作用A、 B：Western blot分析LeUCP2對暴露于IS的H9c2細胞中UCP2、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達；C、D：Western blot分析LeUCP2對暴露于IS且接受miR-22抑制劑轉(zhuǎn)染的H9c2細胞中UCP2、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3、p62、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達；1：LeUCP2+IS組；2：Le-NC+IS組；3：LeUCP2+IS+ anti-miR-22組；4：Le-NC+IS+anti-miR-22組；與Le-NC+IS或Le-NC+IS+anti-miR-22組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3 討論

尿毒癥性心肌病是慢性腎病最常見的并發(fā)癥，其病死率較高。MicroRNA是目前有關(guān)心血管疾病的研究重點。該研究表明，miR-22上調(diào)可通過抑制細胞凋亡和過度自噬來保護心肌細胞免受IS誘導(dǎo)的損傷。機理研究[5]表明，miR-22直接靶向UCP2，UCP2過表達保護心肌細胞免受凋亡和過度自噬。該研究揭示了誘導(dǎo)性心肌病的潛在機制。

據(jù)報道[6-7]，miR-22在幾種癌癥中異常表達，并且其在這些癌癥中的作用已得到廣泛研究。研究[8]表明miR-22與多種心肌疾病有關(guān)，miR-22通過直接靶向TNNI3K抑制心肌肥大。Li et al[9]研究表明，miR-22通過靶向p38α調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的心肌細胞自噬和凋亡。在其他研究中，Yang et al[10]揭示了miR-22抑制了缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌壞死和炎癥，因此，有利于損傷后的心肌修復(fù)。該研究旨在通過模擬體內(nèi)尿毒癥微環(huán)境，闡明在IS刺激下miR-22對心肌細胞凋亡和自噬的影響。有研究[11]顯示，尿毒癥患者的血清IS水平升高了約50倍，而慢性腎病患者的血清IS最高濃度可超過500 μmol/L。通常將100～1 000 μmol/L范圍內(nèi)的IS濃度用于體外研究[12]。因此，該研究也選擇此IS濃度范圍來進行體外實驗。結(jié)果顯示，在IS刺激下，miR-22通過抑制細胞凋亡和自噬促進細胞存活。

研究[13]表明，位于線粒體內(nèi)膜中的UCP2通過抑制活氧性生成和抑制氧化應(yīng)激而對心血管系統(tǒng)具有保護作用。此外，UCP2抑制會降低細胞內(nèi)NAD+和ATP的水平，最終導(dǎo)致細胞功能障礙和死亡[14]。雖然UCP2在心血管疾病中的作用已得到廣泛研究，但是，UCP2是否會影響尿毒癥性心肌病發(fā)病過程中的自噬過程尚不清楚。以往在線數(shù)據(jù)庫進行的MicroRNA靶基因預(yù)測研究[15]已表明miR-22可以靶向UCP2。因此，該研究選擇UCP2作為miR-22調(diào)控IS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡和過度自噬中的靶標，結(jié)果顯示，上調(diào)miR-22可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平上提高UCP2表達，而下調(diào)miR-22可以降低UCP2表達。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果證實miR-22與UCP2相互作用。此外，該研究表明通過用慢病毒預(yù)處理H9c2心肌細胞來上調(diào)UCP2可以減輕IS誘導(dǎo)的細胞凋亡和過度自噬。結(jié)果表明，LeUCP2對H9c2心肌細胞存活具有有利影響。研究還表明LeUCP2消除了miR-22抑制劑對IS誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞的促凋亡和自噬作用。因此，UCP2可能是miR-22的下游效應(yīng)物，并可能介導(dǎo)miR-22對IS誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的作用。