朱正球，楊芳，陳苓珊，吳意贇，王銀萍，馬學(xué)慧，沈碧瀟，黃輝

(1.江蘇省中醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 超聲醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029； 2.東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210096；3.江蘇省中醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 放射科，江蘇 南京 210029)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)。慢性炎癥貫穿于AS的發(fā)病全過程，其誘導(dǎo)的動脈管壁細(xì)胞外基質(zhì)彈性蛋白的彈性生成(elastogenesis，EG)功能紊亂，是動脈結(jié)構(gòu)重塑、彈性衰退及AS進(jìn)展的重要機(jī)制。大量研究[1]證實(shí)，EG合成彈性蛋白的前體物質(zhì)彈性蛋白原(tropoelastin，TE)在正常動脈細(xì)胞外基質(zhì)中含量極低；然而當(dāng)動脈EG功能紊亂時，TE可在細(xì)胞外基質(zhì)中及內(nèi)皮細(xì)胞表面大量蓄積。這一特征使得靶向TE的超聲微泡(microbubbles，MB)在理論上可實(shí)現(xiàn)活體狀態(tài)下實(shí)時評估動脈EG功能紊亂狀態(tài)。然而人體大動脈始終處于高速、高剪切力的血流狀態(tài)下，單靶向超聲微泡很難與動脈內(nèi)皮細(xì)胞及其間隙細(xì)胞外基質(zhì)上的靶分子實(shí)現(xiàn)有效結(jié)合。多聚唾液酸化路易斯X(polymeric sialyllewis X，P- SLex)是一種非抗體性的選擇素快速結(jié)合型配基，能與動脈內(nèi)皮細(xì)胞表面的P- 選擇素快速但不牢固地結(jié)合[2]。這為TE緩慢結(jié)合型配基形成牢固結(jié)合提供了必不可少的時間窗與機(jī)會。本研究欲構(gòu)建攜P- SLex和TE單抗的雙靶向超聲微泡，并體外驗(yàn)證其在高剪切力下的靶向黏附能力。

1 材料與方法

1.1 P- SLex、TE雙靶向微泡的構(gòu)建

按一定摩爾比取二棕櫚酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺生物素脂質(zhì)(均為Avanti公司，美國)溶液，均勻混合后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機(jī)溶劑，在形成的脂質(zhì)膜中加入磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，得脂質(zhì)混懸液，再填充六氟化硫氣體(≥99.99%，安徽強(qiáng)源氣體有限公司)，機(jī)械振蕩后加入親和素(Sigma- Aldrich公司，美國)混合，再分離純化后制備得到攜載生物素的空載微泡(MBC)。為制備靶向微泡，按照1×107個·ml-1微泡濃度加入3.0 μg的比例，分別加入P- SLex(GlycoNZ公司，新西蘭)、TE單克隆兔抗小鼠抗體(Bioss公司，中國)以及P- SLex∶TE抗體=1∶1的混合液體，均勻混合后離心分離取氣泡層樣品，即分別制備得到攜P- SLex的單靶向超聲微泡(MBP)、攜TE單抗的單靶向超聲微泡(MBT)以及攜P- SLex和TE單抗的雙靶向超聲微泡(MBPT)。

1.2 靶向微泡顯微表征、粒徑、Zeta電位和濃度檢測

將微泡溶液用PBS稀釋10倍后，取10 μl滴到載玻片上，采用熒光倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100, 日本)，在20倍物鏡下依次拍照觀察顯微表征(圖1)。取微泡溶液，使用PBS稀釋10倍后，取1.5 ml稀釋液加入到高靈敏度Zeta電位及粒度分析儀樣品池(Brookhaven 90Plus PALS，美國)中，測定其Zeta電位。在100 ml電解溶液中加入20 μl微泡分散液，使用顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及粒度分析儀(Multisizer 4e，貝克曼公司，美國)測定其平均粒徑和微泡濃度。

圖1 MBC(A)、MBP(B)、MBT(C)和MBPT(D)的顯微光鏡表征

1.3 靶向微泡體外高剪切力靶向黏附能力評價

35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿用甲醇漂洗后干燥，再用PBS分別配備1 μg·ml-1的小鼠P- 選擇素Fc段溶液(R&D公司，美國)和小鼠TE抗原溶液(Sigma- Aldrich公司，美國)，按1∶1比例混勻后，用移液器滴加 200 μl 在培養(yǎng)皿中央，4 ℃冰箱中放置12 h，用0.05%的PBS- 吐溫20溶液洗滌3遍，3%的Tris緩沖鹽溶液(TBS)-小牛血清白蛋白處理1 h，再用0.05%的PBS- 吐溫20溶液洗滌3遍后備用。

搭建好平行平板流動腔裝置(Glycotech31- 001，Circular Flow Chamber Kit Instructions，美國)，分別在0.6、2.0、4.0 dyn·cm-2(1.0 dyn·cm-2=0.1 N·m-1)的剪切應(yīng)力下注射微泡樣品(均約1×107個·ml-1)，進(jìn)行微泡結(jié)合實(shí)驗(yàn)評價。微泡注射6 min期間，使用20倍物鏡進(jìn)行視頻錄制(25幀·s-1)及定量分析(圖2)。

圖2 平行平板流動腔微泡結(jié)合實(shí)驗(yàn)，注射微泡0(A)、2(B)、4(C)、6 min(D)的微泡結(jié)合情況

再使用生理鹽水沖洗平行流動板，清洗完靜止但未結(jié)合的微泡；從0.1 dyn·cm-2剪切力開始進(jìn)行沖洗，每30 s增加1倍剪切力，至鏡下微泡完全解離或6 min 后達(dá)到409.6 dyn·cm-2，進(jìn)行微泡解離實(shí)驗(yàn)評價。沖洗過程使用顯微鏡(20倍物鏡)進(jìn)行視頻錄制(25幀·s-1)(圖3)，最后采用Image J軟件(NIH，美國)對視頻圖像進(jìn)行微泡計(jì)數(shù)及定量分析。

圖3 平行平板流動腔微氣泡解離實(shí)驗(yàn)，逐步增加剪切力下0(A)、2(B)、4(C)、6 min(D)的微泡解離情況

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同剪切力下同一微泡類型組間比較及同一剪切下不同微泡類型組間差異比較均采用單因素方差分析，再利用析因分析分析不同微泡類型及不同剪切力兩因素之間是否存在交互效應(yīng)，然后利用Bonferroni檢驗(yàn)比較兩兩組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微泡基本物理特征評價

普通光學(xué)顯微鏡下本研究的生物素化脂質(zhì)MB為透亮微氣泡(圖1)，分布均勻，平均粒徑約為0.722 μm，平均濃度為3.89×109個·ml-1。制備的MBC、MBP、MBT及MBPT 4種微泡形態(tài)類似，平均粒徑為0.699～0.869 μm，Zeta電位為-11.37～-3.98 mV，微泡濃度為1.60×109～6.11×109個·ml-1(表1)。

表1 MBC、MBP、MBT和MBPT的平均粒徑、Zeta電位及微泡濃度測定結(jié)果

2.2 微泡靶向黏附結(jié)合能力的體外評價

由低至高(0.6、2.0、4.0 dyn·cm-2)的3種剪切力作用下微泡的全程(6 min)結(jié)合數(shù)目MBPT分別是MBC的2.39、1.98及30.83倍，MBP的3.12、1.29及2.84倍，MBT的6.28、2.84及3.62倍(均P<0.001)(表2)。進(jìn)一步組內(nèi)兩兩比較證實(shí)，3種剪切力之間及4種微泡之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)，且4種微泡結(jié)合數(shù)目均隨著剪切力的增高而顯著減少(均P<0.001)(圖4、5)。不同微泡類型及不同剪切力兩因素對微泡結(jié)合數(shù)目的影響存在交互效應(yīng)(P<0.001)(表2)。

a與0.6 dyn·cm-2剪切力比較，P<0.001；b 與2.0 dyn·cm-2剪切力比較，P<0.001

表2 不同剪切應(yīng)力下的微泡結(jié)合數(shù)(6 min，n=3)

2.3 微泡靶向黏附解離能力的體外評價

在微泡解離實(shí)驗(yàn)中，MBC、MBT、MBP及MBPT的半數(shù)解離剪切應(yīng)力依次為(11.04±1.52)、(32.83±7.54)、(22.44±5.47)及(27.82±3.84)dyn·cm-2，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。在(30.62±8.68)dyn·cm-2的剪切應(yīng)力下，MBC即可達(dá)到完全解離，而MBT和MBP的完全解離剪切應(yīng)力分別為(111.27±15.37)及(77.14±21.88)dyn·cm-2，MBPT則為(104.23±23.92)dyn·cm-2，4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

a 與MBC比較，P<0.001；b 與MBP比較，P<0.001；c 與MBT比較，P<0.001

3 討 論

本研究利用TE的特異性單抗構(gòu)建靶向超聲微泡用于超聲分子成像，有望實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化在體評估TE及EG功能紊亂狀態(tài)。我們的體外研究已證實(shí)，單靶向TE的MBT超聲微泡能與平行流動板的TE抗原有效結(jié)合，且其結(jié)合可較空載微泡MBC耐受更強(qiáng)的剪切力沖擊。然而，人體大血管始終處于高速、高剪切力的血流環(huán)境下，單靶向TE的超聲微泡很難與動脈內(nèi)皮細(xì)胞及其間隙細(xì)胞外基質(zhì)上的靶分子實(shí)現(xiàn)持續(xù)的有效結(jié)合，進(jìn)而可能導(dǎo)致成像失敗[3]。本研究顯示，MBP的微泡結(jié)合總體數(shù)目顯著優(yōu)于MBC及MBT，但其與MBC一樣不能很好地耐受4.0 dyn·cm-2高剪切力的沖擊；相反，盡管MBT能較好耐受4.0 dyn·cm-2剪切力的沖擊且擁有較高的半數(shù)及完全解離剪切力，但是其微泡在長達(dá)6 min的持續(xù)結(jié)合中的總體數(shù)目較MBP及MBC顯著減少。這說明，靶向微泡表面的TE抗體確實(shí)能與動脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞表面的TE形成較為牢固的結(jié)合，可以耐受高剪切力的持續(xù)沖擊。但若沒有P- SLex與P- 選擇素之間快速且較不牢固的結(jié)合所爭取的時間窗，其最終的結(jié)合數(shù)目仍然不盡如人意。這同時也說明，單靶向微泡MBT或MBP可能都很難勝任未來實(shí)現(xiàn)活體狀態(tài)下的大血管EG功能紊亂成像，聯(lián)合二者的優(yōu)勢所構(gòu)建的雙靶向超聲微泡MBPT可能才是解決問題的關(guān)鍵。

前已述及，慢性炎癥狀態(tài)在AS和心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演了核心機(jī)制的角色[4]。處在炎癥狀態(tài)的動脈管壁內(nèi)皮細(xì)胞會在細(xì)胞膜表面高表達(dá)P- 選擇素，以便于白細(xì)胞通過P- 選擇素的相關(guān)受體與之快速結(jié)合并錨定在細(xì)胞表面，從而誘導(dǎo)管腔內(nèi)的白細(xì)胞進(jìn)入動脈管壁并發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)[5- 6]。正是利用這一特征，攜P- 選擇素的非抗體性配基P- SLex及TE單抗的雙靶向超聲微泡MBPT，本研究已證實(shí)其不僅可耐受4.0 dyn·cm-2的剪切力沖擊，還具有較高的半數(shù)解離剪切應(yīng)力及完全解離剪切應(yīng)力，特別是在高剪切力下結(jié)合數(shù)目分別為MBC的30.8倍、MBP的2.8倍及MBT的3.6倍。近期Ozawa等[7]已成功利用P- 選擇素配基及抗炎性分子單抗雙靶向微泡,在體外高剪切力下成功實(shí)現(xiàn)與靶分子的有效結(jié)合及體內(nèi)的超聲分子成像。然而迄今為止，利用超聲分子成像技術(shù)在體評估動脈EG功能紊亂尚未見報(bào)道，故本研究所構(gòu)建的雙靶向微泡MBPT有望在未來活體狀態(tài)的EG功能紊亂定量評估中發(fā)揮重要的可視化作用。

本研究具有一定的局限性，本研究為體外實(shí)驗(yàn)，且平行平板流動腔設(shè)備所需剪切力為生理鹽水沖擊構(gòu)建，與人體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境存在一定的差異，故靶向微泡黏附能力在未來還需進(jìn)一步動物實(shí)驗(yàn)體內(nèi)驗(yàn)證。

總之，本研究利用P- SLex及TE單抗構(gòu)建的雙靶向超聲微泡MBPT，在體外微泡結(jié)合及解離實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出區(qū)別于空載及單靶向微泡的黏附力和解離能力，能在較高剪切力下實(shí)現(xiàn)與靶分子的有效結(jié)合，有望在活體狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)大動脈的超聲分子影像學(xué)成像并實(shí)時動態(tài)評估EG功能紊亂狀態(tài)。