曾楠楠，蔣 明，文 華，田 娟，陸 星，吳 凡，喻麗娟

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 200120；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,武漢 430223)

羅非魚是一種著名的熱帶養(yǎng)殖魚類，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)量位居世界第二的淡水魚。羅非魚的生活適宜溫度為26～29 ℃。當(dāng)前溫度對羅非魚影響的研究大多集中在對其生長的影響上。關(guān)于溫度對羅非魚代謝機(jī)制的影響還未完全探明，需要進(jìn)一步研究。

作為后基因組時(shí)代的產(chǎn)物，代謝組學(xué)是對生物樣品多組分混合物的定量分析，重點(diǎn)是建立生命系統(tǒng)的病理生理刺激或遺傳改變的代謝反應(yīng)，來自體液或組織的大量小分子代謝物可被一步定量檢測。近年來，代謝組學(xué)平臺(tái)也應(yīng)用于魚類研究范疇，如ASAKURA等基于核磁共振的代謝組學(xué)方法評估了飼料類型對魚類-微生物共生生態(tài)系統(tǒng)中共代謝調(diào)節(jié)的影響；WEI等通過運(yùn)用NMR代謝組技術(shù)探討了魚粉的替代物對大鯪鲆(L.)的作用機(jī)制；蔣明等在對團(tuán)頭魴的探討中，運(yùn)用H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)揭示了微量元素鋅對其代謝的影響。在這些研究中，基于核磁共振的代謝組學(xué)方法被用于揭示營養(yǎng)與魚類代謝狀態(tài)的關(guān)系。與此同時(shí)，代謝組學(xué)也開始被用于探究溫度對魚類代謝機(jī)制的影響，如KULLGREN等利用基于H-NMR的代謝組學(xué)分析大西洋鮭魚()血漿的結(jié)果顯示，高溫誘導(dǎo)了谷氨酰胺，酪氨酸和苯丙氨酸的下降和脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)變。本研究應(yīng)用H-NMR組學(xué)方法檢測分析了在三種溫度條件下飼養(yǎng)8周后吉富羅非魚(，)的血清和肝臟代謝物，探究水溫對羅非魚生理代謝影響的作用機(jī)制,以期為羅非魚養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料與養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)魚購自廣西羅非魚國家級(jí)育種試驗(yàn)場，暫養(yǎng)2周后將大小均勻活潑健康的吉富羅非魚隨機(jī)分配至9個(gè)養(yǎng)殖桶中，每桶20尾。采用電加熱系統(tǒng)和水空調(diào)控溫，在22、28、34 ℃三個(gè)養(yǎng)殖水溫下，以試驗(yàn)飼料投喂初始平均體質(zhì)量為(38.75±0.61) g的吉富羅非魚8周。投喂的半純化飼料配方見表1，每日在8:30、12:30和16:30人工投喂3次，30 min內(nèi)表觀飽食投喂并記錄每日投喂量。將22、28和34 ℃溫度組分別標(biāo)記為低溫(LT)、適溫(MT)和高溫(HT)組。飼養(yǎng)期間pH 7.4～7.6，溶氧保持5.0 mg/L以上，自然光照周期，每日早上對循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行反沖洗，更換5%左右的新水，控制水溫波動(dòng)在1 ℃之內(nèi)，并清除養(yǎng)殖桶內(nèi)糞便。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)成分Tab.1 Formulation and proximate analysis of the experiment diet g/kg

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品制備和測定

8周的飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將魚禁食24 h，記錄每個(gè)養(yǎng)殖桶內(nèi)吉富羅非魚的尾數(shù)和終末體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)期間消耗的飼料質(zhì)量。在每個(gè)養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取3尾魚測量體重和體長，然后通過尾部靜脈抽取血樣存放于離心管，在常溫下靜置30 min后在離心機(jī)上離心(3 000 r/min，10 min)，將得到的血清凍存在-80 ℃冰箱中。常規(guī)解剖分離出三尾實(shí)驗(yàn)魚的內(nèi)臟和肝臟等稱其質(zhì)量，并將部分肝臟標(biāo)本凍存在液氮中。肝臟和血清的代謝產(chǎn)物均采用H-NMR代謝組方法定量和定性。

1.3 血清和肝臟1H-NMR代謝物檢測

將冷凍干燥的肝臟樣品粉末稱重50 mg并加入1 000 mL純水，渦旋1 min，使用4秒開/3秒關(guān)循環(huán)程序(8個(gè)循環(huán))(Sonic VX-130，USA)在冷水浴中進(jìn)行32秒超聲提取。將樣品離心(4 ℃，13 000 r/min)15 min后，將水膜轉(zhuǎn)移到0.5 mL 3 kDa超濾膜離心過濾器(Millipore，USA)中離心(4 ℃，13 000 r/min)45 min后收集濾液。取450 μL澄清透明濾液放于新編號(hào)的2 mL離心管，加入50 μL DSS試劑(Anachro，Canada)后渦旋10秒，然后在4 ℃、13 000 r/min條件下離心2 min。將480 μL上清液置于5 mm的核磁共振管中(Norell，USA)。使用AV600MHz光譜儀收集光譜(采集參數(shù)見表2)。利用2D-1H、1H-NOESY脈沖序列的第一個(gè)增量獲得H-NMR數(shù)據(jù)并抑制溶劑信號(hào)。實(shí)驗(yàn)分析了混合時(shí)間100 ms以及990 ms的預(yù)飽和度。在25 ℃下收集光譜并在15 min內(nèi)共掃描128次。血清樣品解凍后無需加純水，渦旋30秒后離心(4 ℃，13 000 r/min)2 min，取上清液700 μL于超濾膜離心過濾離心(4 ℃，13 000 r/min)65 min收集濾液，而后的采集步驟與肝臟樣品一致。

表2 核磁數(shù)據(jù)采集參數(shù)Tab.2 Acquisition parameters and data of 1H-NMR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析方法

本實(shí)驗(yàn)使用Chenomx NMR suit軟件，把H-NMR自由感應(yīng)衰減(FID)信號(hào)導(dǎo)入后開始傅里葉變換、相位調(diào)整和基線校正。DSS峰值(0.0 ppm)為所有光譜化學(xué)位秱標(biāo)準(zhǔn)，開始反卷積操作，調(diào)整色譜峰峰形(CSI)。按照H-NMR光譜信號(hào)的峰形、化學(xué)位秱、耦合裂分、半峰寬等有效信息，依據(jù)譜峰面積和DSS濃度，聯(lián)合Chenomx自帶數(shù)據(jù)庫對實(shí)驗(yàn)樣本的光譜信號(hào)一一進(jìn)行比較分析，得到樣本中差異的代謝產(chǎn)物和相應(yīng)的絕對密度。將得到的代謝物和它們的絕對濃度含量傳到EXCEL表格中，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)變量矩陣。這個(gè)變量矩陣即是后面進(jìn)行PCA和PLS-DA分析的數(shù)據(jù)來源。主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA)是運(yùn)用R語言分別通過PCA方法Bioconductor package和PLS package進(jìn)行分析，并通過ggplot2 package來實(shí)現(xiàn)可視化。

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，在SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中運(yùn)用單因素方差分析(ANOVA)和Tukey′s檢驗(yàn)確定結(jié)果的差異顯著性，當(dāng)<0.05時(shí)，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對實(shí)驗(yàn)魚生長性能的影響

不同溫度條件下飼養(yǎng)8周后吉富羅非魚的生長性能和飼料利用率見表3?？梢钥闯?，養(yǎng)殖水溫顯著影響實(shí)驗(yàn)魚的終末體質(zhì)量、增重率和飼料系數(shù)。其中28 ℃條件下的實(shí)驗(yàn)魚的生長表現(xiàn)最好，顯著優(yōu)于22 ℃，與34 ℃的實(shí)驗(yàn)魚無顯著差異；飼料系數(shù)在22 ℃條件下出現(xiàn)最大值且顯著高于其他兩組，而另外兩組之間無明顯差異。養(yǎng)殖水溫對實(shí)驗(yàn)魚的肝體指數(shù)(HIS)也有顯著影響，MT組的肝體比明顯高于其余兩組，而LT和HT組之間無顯著差異；三組實(shí)驗(yàn)魚的臟體比(VSI)之間均無顯著差異。

表3 吉富羅非魚不同溫度下生長表現(xiàn)Tab.3 Growth performance of O.niloticus at different temperatures

2.2 樣本代謝物譜圖及代謝物種類

將實(shí)驗(yàn)中肝臟和血清樣本的譜圖信號(hào)按照Chenomx 軟件數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析，獲得的代謝物分別45種(見圖1)和47種(見圖2)。除僅肝臟中含有4-氨基丁酸酯、煙酸、泛酸、牛磺酸、尿素等16種代謝物和血清中含有的精氨酸、二甲胺、乙醇、甲酸酯、甘氨酸、異丁酸酯、T-甲基組氨酸、丙酮酸、肌氨酸、三甲胺N-氧化物、肌醇和反式-4-羥基-L-脯氨酸等17種代謝物外，實(shí)驗(yàn)中大部分定量和定性的代謝物在肝臟和血清之間是相同的，共有代謝物包括14種氨基酸及其衍生物，2種胺和胺化合物，5種有機(jī)酸，6種核酸組分，2種糖類(葡萄糖、甘露糖等)和1種其他組分(泛酸等)。醇類(乙醇、肌醇)代謝物僅在血清中檢測出。

圖1 吉富羅非魚肝臟樣本信號(hào)歸屬片段Fig.1 Signal assignment spectrum of liver from O.niloticus

圖2 吉富羅非魚血清樣本信號(hào)歸屬片段Fig.2 Signal assignment spectrum of serum from O.niloticus

2.3 血清PLS-DA和VIP分析

2.3.1 PLS-DA和PLS載荷分析

圖3A1為實(shí)驗(yàn)魚血清樣本的PLS-DA結(jié)果圖，如圖所示，同組實(shí)驗(yàn)樣本聚集在一起，這表明同組內(nèi)樣本的重復(fù)性可靠，變異較??；三組樣本在主成分2方向上有分開的趨勢，可推測主成分2方向上三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中血清樣本的代謝輪廓有差異；而在主成分1方向上所有實(shí)驗(yàn)組未分離，表明實(shí)驗(yàn)魚在主成分1方向上代謝輪廓相似。圖3A2為血清樣本PLS載荷圖，可以看出：葡萄糖、乳酸、丙氨酸等代謝物在區(qū)分不同樣本間中發(fā)揮了重要作用。

圖3 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚血清樣本1H-NMR光譜得到的PLS-DA得分圖(A1)和PLS-DA載荷圖(A2)Fig.3 PLS-DA score plot (A1) and loading plot (A2) derived from 1H-NMR spectra of serum of O.niloticus

2.3.2 VIP差異代謝物分析

圖4B1為三組實(shí)驗(yàn)魚血清樣本VIP得分圖，如圖所示，血清中第一重要差異代謝物為乳酸，剩余14種差異代謝物依次為脯氨酸、葡萄糖、檸檬酸、反式-4-羥基、乙醇、肌酸、亮氨酸、甜菜堿、纈氨酸、谷氨酰胺、三甲胺、甘露糖、酪氨酸和肌酐。對PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物進(jìn)行ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，血清中脯氨酸的濃度在三組間差異顯著(圖3-4B2)。HT組的血清檸檬酸、乙醇、甜菜堿、谷氨酰胺、三甲胺和肌酐顯著高于其他兩組；LT組的血清中除乳酸、脯氨酸、葡萄糖、反式-4-羥基、肌酸、亮氨酸和纈氨酸高于其他兩組外，其余代謝物濃度均顯著低于其他兩組；而MT組血清中的甘露糖和酪氨酸濃度顯著高于其他兩組(見表4)。

圖4 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚血清樣本1H-NMR光譜得到的VIP得分圖(B1)和PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物的ANOVA分析圖(B2)Fig .4 VIP score plot (B1) and ANOVA analysis chart (B2) of metabolites with VIP value greater than 1 obtained by PLS-DA analysis derived from 1H-NMR spectra of blunt snout bream of O.niloticus

表4 血清差異代謝物列表及濃度Tab.4 List and concentration of serum differential metabolites mmol/L

2.4 肝臟PLS-DA和VIP分析

2.4.1 PLS-DA和PLS載荷分析

圖5C1為肝臟樣本PLS-DA得分圖，結(jié)果顯示，同組實(shí)驗(yàn)樣本聚集在一起，表明平行樣本間重復(fù)度高，變異較??；而LT組和另外兩組的實(shí)驗(yàn)樣本在主成分1方向上顯示分離，表明在此方向上LT組實(shí)驗(yàn)魚的代謝輪廓與其他兩組較為不同；在主成分2方向上，實(shí)驗(yàn)樣本基本相近，表明在該方向上三組實(shí)驗(yàn)魚的代謝輪廓較為相似。圖5C2為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組肝臟樣本PLS載荷圖，可以看出：葡萄糖、麥芽糖等代謝物在樣本間的區(qū)分中做出了重要貢獻(xiàn)。

圖5 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚肝臟樣本1H-NMR光譜得到的PLS-DA得分圖(C1)和PLS-DA載荷圖(C2)Fig.5 PLS-DA score plot (C1) and loading plot (C2) derived from 1H-NMR spectra of liver tissue of O.niloticus

2.4.2 VIP差異代謝物分析

圖6D1為三組實(shí)驗(yàn)魚肝臟樣本VIP圖，如圖所示，肝臟中第一重要的差異代謝物為麥芽糖，剩余14種主要差異代謝物均為氨基酸及氨基酸衍生物。對三組代謝物進(jìn)行ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物除麥芽糖外，其余代謝物濃度各組間差異均顯著(圖6D2)。LT組的肝臟中15種差異代謝物濃度均高于其他兩組；MT組的肝臟中除麥芽糖、谷氨酸鹽、賴氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、?；撬岷吞K氨酸濃度高于HT組外，其余差異代謝物濃度均低于HT組(見表5)。

圖6 來自LT、MT和HT組之間的吉富羅非魚肝臟樣本1 H NMR光譜得到的VIP得分圖(D1)和PLS-DA分析得到的VIP值大于1的代謝物的ANOVA分析圖(D2)Fig.6 VIP score plot (D1) and ANOVA analysis chart (D2) of metabolites with VIP value greater than 1 obtained by PLS-DA analysis derived from 1H-NMR spectra of liver tissue of O.niloticus

3.1 水溫對吉富羅非魚肝臟代謝組的影響

在肝臟組織中，LT、MT和HT組的15種主要差異代謝物中，有13種是氨基酸或者氨基酸代謝中間物，這充分說明溫度對吉富羅非魚氨基酸代謝具有顯著的影響。類似地，ZHAO等指出高溫應(yīng)激吉富羅非魚，主要影響的是其氨基酸代謝通路。與MT組相比較，HT組和LT組實(shí)驗(yàn)魚中的亮氨酸、精氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等8種氨基酸的濃度明顯升高，其中亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸為支鏈氨基酸(BCAA)，BCAA可通過擴(kuò)大TCA(三羧酸循環(huán))中間體(anaplerosis)和進(jìn)入糖異生等途徑來促進(jìn)能量代謝，其余5種氨基酸也均可通過生糖促進(jìn)TCA循環(huán)。這意味著高溫和低溫條件下吉富羅非魚體內(nèi)氨基酸會(huì)通過代謝生成葡萄糖產(chǎn)生能量，進(jìn)而降低氨基酸利用率。而關(guān)于實(shí)驗(yàn)魚肝臟中?；撬岬暮浚琇T組中濃度最高、MT組次之，HT組中濃度最低，這表明溫度會(huì)顯著影響魚體肝臟中?；撬岽x。

由賓石玉等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)水溫降至15 ℃，埃及尼羅羅非魚肝臟、脾臟開始出現(xiàn)溶解的現(xiàn)象；TASCI等研究發(fā)現(xiàn)喂食?；撬峥梢愿纳剖蟮母螕p傷和肝臟纖維化。由此可以推斷LT組?；撬釢舛蕊@著升高可能是一種響應(yīng)機(jī)制，因?yàn)殚L時(shí)間的低溫環(huán)境導(dǎo)致吉富羅非魚的肝臟受損。同時(shí)，LT組中麥芽糖、谷氨酰胺、谷氨酸濃度也最高，MT組次之，HT組最低。谷氨酰胺通過谷氨酸可作為TCA循環(huán)中間體α-酮戊二酸的前體。LT組中麥芽糖、谷氨酰胺和谷氨酸的升高進(jìn)一步證實(shí)在低溫條件下吉富羅非魚糖代謝會(huì)增強(qiáng)且能量升高。且與前面低溫導(dǎo)致吉富羅非魚肝臟受損的假設(shè)一致，LT組谷氨酰胺含量顯著升高可提高機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)肝臟及免疫細(xì)胞以維持肝臟的正常功能。肝臟組織代謝物的結(jié)果表明溫度顯著影響吉富羅非魚的氨基酸代謝和糖代謝通路，低溫條件下吉富羅非魚生長受限可能是由于不適宜的飼養(yǎng)溫度會(huì)其降低對氨基酸的利用率；代謝組結(jié)果表明HT組條件下飼養(yǎng)的吉富羅非魚的體內(nèi)生理代謝具有顯著變化，但HT組實(shí)驗(yàn)魚的生長速度和飼料利用率雖與MT組無顯著差異，可能是由于實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖時(shí)間較短還未反映到其表型上。

3.2 水溫對吉富羅非魚血清代謝組的影響

在血清中，LT、MT和HT組的第1差異物是乳酸。LT組實(shí)驗(yàn)魚中乳酸濃度最高，HT組次之，MT組最低。血液中乳酸含量升高代表可能血液循環(huán)代謝有障礙。LT組中除乳酸外，葡萄糖、脯氨酸、反式-4-羥基、肌酸的含量也明顯上升。血清中葡萄糖含量升高，意味著糖酵解增加并會(huì)影響某些氨基酸的代謝(如蘇氨酸和酪氨酸)，這與肝臟中代謝組得到的結(jié)果(低溫條件下吉富羅非魚糖代謝會(huì)增強(qiáng)且能量升高)相統(tǒng)一。過量的葡萄糖可以通過新的脂肪生成(DNL)作為糖原或脂肪酸儲(chǔ)存在肝臟中，也可以作為磷酸肌酸儲(chǔ)存，用于再生ATP的能量儲(chǔ)備。具有細(xì)胞能量穿梭功能的肌酸是維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵組成部分。LT組魚中觀察到高肌酸水平可能是對低溫壓力的代謝反應(yīng)，也可以解釋低溫條件下吉富羅非魚增長率較低的原因。脯氨酸屬于與抗感染相關(guān)的精氨酸和脯氨酸代謝，ZHAO等發(fā)現(xiàn)添加2 mg外源脯氨酸可使高溫條件下吉富羅非魚的死亡率由81%降至45%，而添加L-蘇氨酸和L-天冬氨酸則未能提高存活率，表明脯氨酸與增強(qiáng)抗感染能力進(jìn)而促進(jìn)適應(yīng)非適宜溫度有密切關(guān)系，這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果是一致的。

HT組中甜菜堿、谷氨酰胺、三甲胺和肌酐顯著高于其他兩組，而MT組高于LT組。有研究發(fā)現(xiàn)，鼠中添加甜菜堿后血漿中低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯含量升高；且有研究表明甜菜堿可以促進(jìn)脂肪分解及脂肪酸氧化。三甲胺(TMA)是膽堿的代謝產(chǎn)物，可以作為蛋白質(zhì)在高溫下的穩(wěn)定劑。由以上研究我們可以假設(shè)增加的TMA水平來源于膽堿代謝，是對高溫的適應(yīng)性反應(yīng)，則血清中甜菜堿和三甲胺含量升高說明高溫對脂質(zhì)代謝、膽堿代謝也有一定的影響。

4 結(jié)論

綜上所述可見，低溫條件下，吉富羅非魚糖代謝增強(qiáng)，氨基酸的利用率降低，進(jìn)而影響羅非魚的生長速度和飼料利用率；高溫條件下飼養(yǎng)的吉富羅非魚體內(nèi)脯氨酸、三甲胺和甜菜堿等代謝物濃度升高，很可能是對高溫的適應(yīng)性反應(yīng)，飼料中添加甜菜堿、脯氨酸、三甲胺等可能會(huì)增強(qiáng)羅非魚在高溫條件下的抵抗力。