閆 戈，顧 晨,3，王承鑫，李世平，魏萬(wàn)紅,2,3

(1.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院行為生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州225009；3.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

克氏原螯蝦()屬于甲殼綱十足目，是世界淡水螯蝦最重要的養(yǎng)殖品種，占螯蝦總產(chǎn)量的70%～80%。隨著人工農(nóng)業(yè)區(qū)的迅速擴(kuò)大，因養(yǎng)殖過(guò)程中缺乏科學(xué)管理經(jīng)驗(yàn)、疏于病害防治等經(jīng)常會(huì)造成克氏原螯蝦病害頻繁發(fā)生，其中副溶血弧菌()、弗氏檸檬酸桿菌()、嗜水氣單胞菌()和鰻鱺愛(ài)德華氏菌()是重要的病原菌。目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中主要使用抗生素控制這些病害的暴發(fā)，但抗生素的濫用往往會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物病原體耐藥性增強(qiáng)、藥品殘留過(guò)高、水體污染等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙克氏原螯蝦養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此尋找一種安全高效的抗生素替代品成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)。

眾多的研究表明，藥用植物作為免疫增強(qiáng)劑能增加宿主免疫系統(tǒng)的抗菌、抗病毒作用，草藥、香料、海藻、草藥提取化合物和植物衍生產(chǎn)品中含有酚類、多酚類、生物堿、醌類、萜類、凝集素和多肽化合物，它們中的許多成分是抗生素和其他合成化合物的有效替代品，可以作為益生元與其他免疫興奮劑混合使用。芡實(shí)(，EF)屬于睡蓮科芡屬，果實(shí)中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多種必需氨基酸和人體所需的礦物質(zhì)元素,以及大量的多酚類、甾醇類及黃酮類等抗氧化性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，芡實(shí)殼乙醇提取物(EFSS)中的酚類化合物具有強(qiáng)抗氧化性、高自由基清除能力以及抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，它能夠抑制痤瘡丙酸桿菌()和表皮葡萄球菌()的生長(zhǎng)，也對(duì)嗜水氣單胞菌、溫和氣胞菌()等水生動(dòng)物常見(jiàn)致病菌具有良好的抑菌性。但有關(guān)芡實(shí)是否能夠提高水生動(dòng)物的生長(zhǎng)免疫的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)克氏原螯蝦飼喂含有不同濃度芡實(shí)乙醇提取物飼料后，測(cè)定克氏原螯蝦生長(zhǎng)、免疫指標(biāo)的變化，探討芡實(shí)提取物作為一種新型的免疫增強(qiáng)劑來(lái)替代抗生素的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將揚(yáng)州里下河農(nóng)科所養(yǎng)殖基地的克氏原螯蝦帶回?fù)P州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室，選取體格健壯、大小均一的蝦，在模擬生態(tài)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)一周后轉(zhuǎn)移至16個(gè)水族箱中，每個(gè)水族箱投放平均規(guī)格為(13.6±2.7) g的健康克氏原螯蝦20只，光照周期為12L∶12D，室溫為(22±1) ℃，pH為7.0±1.2，溶解氧≥6.0 mg/L，24 h不間斷供氧。

1.2 方法

1.2.1 芡實(shí)提取物的制備

實(shí)驗(yàn)植物芡實(shí)采自于高郵湖，陰干后于烘箱中50 ℃烘烤2～3 h，剪成小段，粉碎機(jī)打碎成粉末，于密封袋內(nèi)密封保存。稱取1 000 g植物粉末，按照1∶10的比例用乙醇浸泡24 h后抽濾，收集濾液，抽濾后的濾渣繼續(xù)浸泡24 h后再抽濾，收集濾液，如此反復(fù)3～4次，最后合并濾液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至粘稠狀，烘干備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)飼料的制備

實(shí)驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼料為新鄉(xiāng)市華畜商貿(mào)有限公司生產(chǎn)的龍蝦飼料，其營(yíng)養(yǎng)成分為：粗蛋白質(zhì)28%，粗脂肪3%，粗纖維8%，總磷1.2%，粗灰分18%，賴氨酸1.5%～3%，水分12%。將芡實(shí)乙醇提取物按照0、5、10、20 g/kg添加到磨成粉末的成品飼料中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蟛捎蔑暳现屏C(jī)加工成粒徑為2.0 mm的沉水性飼料。

1.2.3 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)按照飼喂飼料芡實(shí)提取物的添加濃度分為對(duì)照組(0 g/kg，A組)、0.5%芡實(shí)組(5 g/kg，B組)、1%芡實(shí)組(10 g/kg，C組)和2%芡實(shí)組(20 g/kg，D組)。每組4個(gè)水族箱，每個(gè)水族箱20只克氏原螯蝦。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組投喂相應(yīng)的飼料，每天投飼量為克氏原螯蝦體重的3%～5%，可根據(jù)生長(zhǎng)情況適當(dāng)調(diào)整，以2 h內(nèi)吃完為宜。每天投喂兩次，上、下午各一次，每次飼喂前都要清除殘餌和糞便。養(yǎng)殖周期為28 d。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前和結(jié)束后，對(duì)各組克氏原螯蝦稱重，并計(jì)算增重率(WGR，%)和特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)。計(jì)算公式如下：

=100%×(-)；

=100%×(ln-ln)；

式中：為第天末均重，為第0天初始均重，為實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

1.2.4 攻毒實(shí)驗(yàn)

攻毒實(shí)驗(yàn)使用的嗜水氣單胞菌是由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所提供，參考Jiang等的實(shí)驗(yàn)方法計(jì)算該菌株24 h內(nèi)克氏原螯蝦半致死菌液濃度為2.4×10CFU/mL。在養(yǎng)殖28 d后，每個(gè)處理組隨機(jī)選取20只克氏原螯蝦進(jìn)行攻毒，分別用一次性注射器在克氏原螯蝦的第三腹節(jié)基部注射2.4×10CFU/mL嗜水氣單胞菌菌液0.1 mL，然后放入缸中繼續(xù)飼養(yǎng)，攻毒后不再投喂飼料，每隔12 h觀察記錄死亡結(jié)果，持續(xù)3 d后計(jì)算攻毒后的存活率。

1.2.5 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)樣品采集

飼喂28 d后，各組克氏原螯蝦禁食24 h，從每個(gè)處理組中隨機(jī)抽取10只克氏原螯蝦用冰包埋10 min，保持低溫麻醉。用1 mL注射器從圍心腔抽取血淋巴，采集之后用4 ℃離心機(jī)離心(5 000 r/min)10 min，取上清液(血清)，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。然后在無(wú)菌條件下摘取肝胰腺，不同樣本在取樣間隔用75%酒精擦拭取樣器具。

1.2.6 血清、肝胰腺中免疫相關(guān)酶活的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行血清超氧化物歧化酶(SOD)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)和肝胰腺中SOD、過(guò)氧化氫酶(CAT)的測(cè)定，總蛋白的測(cè)定采用丙烯酸丁酯(BCA)法。血清中PO酶活的測(cè)定參考Ye等的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)監(jiān)測(cè)L-3，4-二羥基苯丙氨酸的多巴胺能生成速率，用分光光度法測(cè)量酚氧化酶(PO)活性。為了確保吸光度在0.1～1.0，將3 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH6.0)，100 μL L-DOPA(0.01 mol/L)和100 μL血清完全混合，于25 ℃水浴中靜置10 min，在490 nm波長(zhǎng)下每隔2 min測(cè)定10 min的光密度(OD)。一個(gè)酶活力單位定義為每毫升血清每分鐘增加0.001吸光度。

1.2.7 免疫相關(guān)基因的表達(dá)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)親環(huán)素A基因()、肽過(guò)氧化物酶基因()、抗菌肽基因()和18S rRNA在克氏原螯蝦肝胰腺組織中的表達(dá)情況。引物由上海生物工程公司合成(表1)，目的片段在100～200 bp。使用RNAiso Plus試劑從蝦的肝胰腺組織中提取總RNA，隨后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和顯微分光光度法測(cè)定RNA質(zhì)量，選擇/穩(wěn)定在1.9～2.0的RNA，用0.1%DEPC將RNA濃度調(diào)整至(1 000±100) μg/μL備用。使用HiScript RT Super Mix試劑盒(南京Vazyme有限公司，中國(guó))逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。使用SYBR Green I熒光試劑盒(南京Vazyme有限公司，中國(guó))通過(guò)real-time PCR(Applied Biosystems 7300 real-time PCR System，USA)檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)體系20.0 μL：10 μL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL Primer F(10 μmol/L)，0.4 μL Primer R(10 μmol/L)，1 μL cDNA，8.2 μL ddHO。

表1 目的基因CypA、GPxs、Astacidin和內(nèi)參基因18S rRNA的引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene CypA、GPxs、Astacidin and housekeeping gene 18S rRNA

將96孔板在大型冷凍離心機(jī)上1 000 r/min(4 ℃)離心1 min后，放入RT-qPCR(7500)儀器進(jìn)行反應(yīng)，程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)平行。

本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔ法測(cè)定克氏原螯蝦免疫相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量，設(shè)為對(duì)照組樣品管家基因的值，為對(duì)照組樣品目的基因的值；為處理組樣品管家基因的值，為處理組樣品目的基因的值。則處理組和對(duì)照組基因表達(dá)水平的比值可用公式2-ΔΔ進(jìn)行計(jì)算：

ΔΔ=(-)-(-)，目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔ。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，差異水平為(<0.05)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)的形式表示。

2 結(jié)果和分析

2.1 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)發(fā)育的影響

表2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.5%芡實(shí)提取物處理組克氏原螯蝦的生長(zhǎng)速度較快，而1%和2%芡實(shí)提取物組生長(zhǎng)速度較慢；各實(shí)驗(yàn)組的克氏原螯蝦終末質(zhì)量、增重率、特定生長(zhǎng)率不存在顯著性差異。

表2 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Effects of EF extracts on growth performance of P.clarkii

2.2 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦抗氧化酶及免疫相關(guān)酶活性的影響

表3可知，2%芡實(shí)組血清中的SOD活性顯著高于對(duì)照組，0.5%芡實(shí)組血清中的ACP和AKP活性顯著高于對(duì)照組，而1%芡實(shí)組和2%芡實(shí)組血清中的ACP活性顯著低于對(duì)照組。血清中的PO活性在不同處理組間沒(méi)有顯著差異。表4可知，0.5%芡實(shí)組的肝胰腺中的ACP活性顯著高于對(duì)照組，肝胰腺中的SOD、CAT、AKP的活性在不同處理組間均沒(méi)有顯著差異。

表3 各組克氏原螯蝦的血清生化指標(biāo)Tab.3 The values of the blood biochemical parameters in the P.clarkii in different treatments

表4 各組克氏原螯蝦的肝胰腺生化指標(biāo)Tab.4 The values of the hepatopancreas biochemical parameters in the P.clarkii in different treatments

2.3 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺免疫基因表達(dá)的影響

圖1可知，2%芡實(shí)組克氏原螯蝦肝胰腺中mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和1%芡實(shí)組，而0.5%芡實(shí)組和1%芡實(shí)組相對(duì)于對(duì)照組無(wú)顯著差異。2%芡實(shí)組mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而0.5%芡實(shí)組和1%芡實(shí)組相對(duì)于對(duì)照組同樣無(wú)顯著差異。mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各處理組之間均無(wú)顯著差異，但各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組。

圖1 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦肝胰腺組織中免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.1 Effects of EF extracts on the expression of immune-related genes in hepatopancreas tissue of crayfish“*”代表與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)

2.4 嗜水氣單胞菌感染克氏原螯蝦存活率的變化

對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒，72 h后對(duì)照組和0.5%、1%、2%芡實(shí)提取物組的存活率分別為25%、40%、25%、30%(圖2)，各實(shí)驗(yàn)組之間的存活率沒(méi)有顯著差異。

圖2 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦嗜水氣單胞菌攻毒后存活率的影響Fig.2 Effects of EF extracts on antioxidant capacity of crayfish

3 討論

3.1 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)和嗜水氣單胞菌感染的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼料中添加一定量的芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。Bilen等研究黃櫨對(duì)虹鱒()的免疫刺激作用結(jié)果與本研究一致，結(jié)果顯示黃櫨對(duì)虹鱒生長(zhǎng)速度和平均體重?zé)o顯著影響。研究表明，多種中草藥提取物通過(guò)抑制病原微生物感染，提高免疫酶活性和抗氧化水平，降低氧化應(yīng)激，可間接提高飼料效率，提高水生動(dòng)物生長(zhǎng)性能。胡文攀等在淇河鯽()基礎(chǔ)飼料中添加懷山藥皮，發(fā)現(xiàn)其能提高淇河鯽的生長(zhǎng)率和增重率，但效果不顯著。這與本研究芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦無(wú)明顯促進(jìn)生長(zhǎng)作用的結(jié)果相似。

藥用植物除了可以提高機(jī)體的免疫功能外，另外一個(gè)重要作用就是它所含的活性成分對(duì)致病菌的殺滅作用。葛家琪的實(shí)驗(yàn)也已證明芡實(shí)提取物對(duì)包括嗜水氣單胞菌在內(nèi)的幾種水產(chǎn)致病菌的抑菌效果。馮琪元等發(fā)現(xiàn)添加復(fù)方中草藥可提高虹鱒感染魯氏耶爾森菌()后的存活率。嗜水氣單胞菌攻毒實(shí)驗(yàn)顯示，添加芡實(shí)提取物飼料組對(duì)克氏原螯蝦攻毒后的存活率與對(duì)照組沒(méi)有顯著影響。在本研究中，我們只選擇了最短的有效時(shí)間來(lái)確定芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)和嗜水氣單胞菌感染后的影響，而關(guān)于克氏原螯蝦在不同時(shí)間點(diǎn)的變化仍需要進(jìn)一步研究。

3.2 芡實(shí)提取物對(duì)克氏原螯蝦抗氧化作用和免疫作用的影響

抗氧化酶是抵抗活性氧損傷的第一道防線，超氧化物歧化酶(SOD)活性可以清除過(guò)量的活性氧，保護(hù)機(jī)體免受活性氧的傷害。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方中草藥可以通過(guò)增強(qiáng)尼羅羅非魚()血清SOD活力，提高其非特異性免疫力。陳蓉等研究表明芡實(shí)的水提醇沉物和脂溶性物質(zhì)都具有較好的清除自由基的作用。Wu等發(fā)現(xiàn)，芡實(shí)多糖具有增強(qiáng)總抗氧化能力(T-AOC)，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性的作用，本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。大多數(shù)甲殼類動(dòng)物缺乏真正的自適應(yīng)免疫系統(tǒng)，主要依靠非特異性免疫，如細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。本研究同時(shí)測(cè)定了兩種氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物SOD和CAT的活性，結(jié)果顯示飼料中添加2%濃度的芡實(shí)提取物可提高克氏原螯蝦血清中SOD的活性，表明芡實(shí)提取物可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少抗氧化損傷。甲殼類動(dòng)物的體液免疫主要依賴于酚氧化酶(PO)、AKP和ACP等酶類，AKP在魚蝦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用中發(fā)揮著重要作用，有助于提高魚蝦的抗病能力；ACP是巨噬細(xì)胞中溶酶體的標(biāo)記酶，與物質(zhì)代謝密切相關(guān)，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，可被外源性物質(zhì)誘導(dǎo)。相關(guān)研究表明，應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑后，各種生物體內(nèi)ACP、AKP的活性均有類似的提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加0.5%濃度的芡實(shí)提取物可以提高克氏原螯蝦肝胰腺中ACP和血清中ACP、AKP的活性，而添加1%、2%濃度的芡實(shí)提取物則會(huì)降低血清中ACP的活性，說(shuō)明適量濃度的芡實(shí)提取物可以促進(jìn)機(jī)體的體液免疫，增強(qiáng)其非特異性免疫。

CypA是環(huán)孢素A(cyclosporine A，CSA)的主要胞內(nèi)受體，是一種有效的免疫抑制藥物，可以與過(guò)氧化物還原蛋白相互作用，激活過(guò)氧化物酶活性。在本研究中，添加2%的芡實(shí)提取物組的CypA mRNA表達(dá)水平顯著升高。有研究表明，CypA在斑節(jié)對(duì)蝦()、斑點(diǎn)叉尾鮰()等水生動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。GPx在吞噬和生理代謝過(guò)程中迅速產(chǎn)生的脂質(zhì)和過(guò)氧化氫的解毒中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)伴隨著谷胱甘肽的氧化，可以將有毒過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能不受過(guò)氧化物的干擾和破壞；GPx在早期卵巢中特異性表達(dá)，可能在防止卵母細(xì)胞氧化損傷并因此在甲殼類動(dòng)物繁殖中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，添加2%的芡實(shí)提取物組的mRNA表達(dá)水平顯著升高。Astacidin是克氏原螯蝦中的另一種抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)，它參與抗菌免疫反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)添加芡實(shí)提取物組的mRNA表達(dá)水平均高于對(duì)照組，這與南美白對(duì)蝦和印度明對(duì)蝦()的研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，飼料中添加適量濃度芡實(shí)提取物可以增強(qiáng)克氏原螯蝦的抗氧化酶和免疫相關(guān)酶的活性，促進(jìn)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高其非特異性免疫力。