顧海龍，蔡迎春，楊智景，唐文喬，馮亞明

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院泰州農(nóng)科所，江蘇泰州 225300；2.上海海洋大學，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用省部共建教育部重點實驗室，上海 201306)

長春鳊()隸屬鯉科(Cyprinidae)鳊屬()，俗稱長身鳊、草鳊等，常見于中國各大水系,在長江主要分布于中下游干、支流及其附屬湖泊，是長江中下游重要的經(jīng)濟魚類和捕撈對象之一。與大多數(shù)魚類一樣，人工養(yǎng)殖的長春鳊無法自行繁殖，需注射外源性催產(chǎn)激素誘導其產(chǎn)卵，但親魚的應激反應較大。魚類親本因注射催產(chǎn)劑而產(chǎn)生強烈應激的現(xiàn)象在刀鱭()等其他魚類的人工繁殖中也常有發(fā)生，但這一現(xiàn)象尚未得到很多學者的關(guān)注和研究。

下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI軸)是魚類最重要的應激調(diào)控軸。機體受到應激后，下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，刺激垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，進而誘導腎上腺釋放糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素。糖皮質(zhì)激素主要為皮質(zhì)醇，具有調(diào)節(jié)糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的功能，可影響葡萄糖的合成和利用、脂肪的動員及蛋白質(zhì)的合成；鹽皮質(zhì)激素主要為醛固酮，直接參與腎臟調(diào)節(jié)水鹽代謝，保鈉排鉀，維持血壓平衡。催乳素是脊椎動物腺垂體分泌的單鏈多肽類激素，與促腎上腺皮質(zhì)激素、生長激素并稱為應激反應中腺垂體分泌的三大激素。本研究以雌性長春鳊為研究對象，分析親本注射絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A)、馬來地歐酮(DOM)及它們的混合制劑后，催乳素、皮質(zhì)醇及總蛋白、血漿滲透壓、血糖等血液生化指標的變化情況，探索親魚對不同催產(chǎn)激素的應激反應，為長春鳊人工催產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗地點位于江蘇省靖江市濱江水產(chǎn)良種場人工繁殖車間，實驗水溫25～28 ℃，實驗用水為曝氣5 d以上的自來水，實驗期間不投喂。親魚為該良種場自繁培育的長江第三代雌性2齡長春鳊，經(jīng)抽樣解剖，注射前卵巢均已發(fā)育至Ⅳ期末。親魚大小相近，體長(37.3±1.5) cm，體重(1 109.6±78.8) g。

1.2 實驗設計

實驗魚按分組分別飼養(yǎng)于50 m的室內(nèi)水泥池，每組設三個平行，每個平行有30尾實驗魚。對照組為注射催產(chǎn)激素前隨機選擇的9尾魚。4個處理組按照常規(guī)生產(chǎn)中使用的催產(chǎn)劑和注射劑量，處理組在水體中分別快速注射(1)HCG：500 IU/kg；(2)DOM：2.5 mg/kg；(3)LHRH-A：5 μg/kg；(4)HCG+DOM+LHRH-A=(500 IU+2.5 mg+5 μg)/kg(下稱混合組“ALL”)。催產(chǎn)劑購自寧波第二激素廠，注射液用0.75%的生理鹽水配制。分別在激素注射后的0.5 h(注射初期)、8 h(效應初期)、14 h(效應末期)、20 h(產(chǎn)后恢復期)取樣，每個實驗池隨機取實驗魚3尾，稱量體長、體重等基礎數(shù)據(jù)后，尾靜脈取血。同一個實驗池的3尾魚血液合并為一個樣，血液置于2 mL離心管中，檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，靜置30 min后，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，所得血漿置于-20 ℃凍存待測。

1.3 樣品測定

皮質(zhì)醇、雌二醇、催乳素使用放射免疫法檢測(西安核儀器廠，XH6080)，其標準品及樣本(100 μL)加標記物抗體后，37 ℃分別溫育45 min(皮質(zhì)醇)、2 h(雌二醇)、20 h(催乳素)，加分離劑15 min，3 800 r/min離心15 min，繪制標準曲線，依據(jù)曲線計算待測物濃度。血糖(葡萄糖氧化酶法)、總蛋白(雙縮脲法)、甘油三酯(GPO-PAP法)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(丙氨酸底物法)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(天門冬氨酸底物法)、乳酸(比色法)、K(四苯硼鈉比濁法)、Na(焦銻酸鉀比濁法)、Cl(硫氰酸汞法)均使用東芝120全自動生化分析儀檢測。血漿滲透壓使用雅培干式便攜式血氣分析儀i-stat300G檢測，先測血氣HCO，后用Cl聯(lián)合檢測滲透壓。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 25.0軟件進行One-way ANOVA單因素方差分析；Qiime 2軟件進行主成分(PCA)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同催產(chǎn)激素對長春鳊催乳素和雌二醇的影響

注射催產(chǎn)劑后長春鳊血液中催乳素和17 β-雌二醇水平的變化見表1和圖1。整體上，注射催產(chǎn)劑使催乳素水平降低(如圖1-a)，雌二醇水平升高(如圖1-b)。注射后0.5 h和8 h，LHRH-A組及混合組催乳素水平顯著低于對照組；注射后14 h，除混合組外，其余組催乳素水平均顯著低于對照組，注射后20 h，所有組催乳素水平均顯著低于對照組。LHRH-A組雌二醇水平在注射后8 h達到峰值[(481.05±103.73) pg/mL]，且顯著高于對照組和其他三組，說明LHRH-A效應時間最短?；旌辖M雌二醇水平在注射后14 h達到峰值[(258.19±33.78) pg/mL]，注射后20 h，所有組雌二醇水平回落至相似水平，但均顯著高于對照組，說明所有催產(chǎn)劑均能有效誘導卵子成熟。

表1 注射催產(chǎn)劑后長春鳊血液中催乳素和17 β-雌二醇水平的變化

圖1 注射催產(chǎn)劑后催乳素(PRL)、雌二醇(E2)水平的變化情況

2.2 不同催產(chǎn)激素對長春鳊皮質(zhì)醇及代謝的影響

注射催產(chǎn)劑后長春鳊皮質(zhì)醇和血糖、乳酸、TP、ALT、AST含量變化情況列入表2和圖2。由圖2-a可知，皮質(zhì)醇水平在注射后8 h和20 h時各組差異較大。混合組的皮質(zhì)醇水平在注射后8 h后上升至峰值[(881.56±11.85) ng/mL]，此后一直高于其余三組；HCG組皮質(zhì)醇水平注射后20 h顯著上升至峰值[(743.16±94.79) ng/mL]；LHRH-A組則在此時顯著降低至(281.86±27.27) ng/mL。皮質(zhì)醇和血糖是指示應激的重要指標，且糖皮質(zhì)醇具有加速糖類和脂類代謝的作用。HCG組與DOM組的皮質(zhì)醇和血糖變化比較一致，兩組的血糖在0.5 h時顯著上升(圖2-b)；甘油三酯的含量在0.5 h和20 h差異較大，0.5 h時除混合組外，其余三組均顯著升高；混合組自8 h開始顯著高于對照組，20 h達到峰值[(5.80±0.17) mmol/L]，預示著機體在短時間內(nèi)受到了較強烈的應激。LHRH-A組乳酸含量在0.5 h時降低，8 h時有所回升，其余組在0.5 h升高后一直降低。各組總蛋白的含量在14 h和20 h差異較大，總體趨勢先降后升；HCG組在14 h達到峰值[(49.0±7.85) g/L]，混合組在20 h達到峰值[(48.5±1.65)g/L]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(圖2-e)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(圖2-f)是表征肝生理功能的指標，混合組谷丙轉(zhuǎn)氨酶0.5 h達到峰值[(11±2.1) IU/L]，此后回落，谷草轉(zhuǎn)氨酶0.5 h后持續(xù)上升，14 h達到峰值[(227±41.5) IU/L]后略有回落；HCG組的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在20 h時均顯著升高。

表2 長春鳊注射催產(chǎn)劑后皮質(zhì)醇及血液指標的變化

圖2 皮質(zhì)醇(COR)、血糖(Glu)、乳酸(lactic acid)、總蛋白(TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)含量的變化情況

2.3 不同催產(chǎn)激素對長春鳊血漿滲透壓及K+、Na+、Cl-的影響

注射催產(chǎn)劑后長春鳊血漿滲透壓、K、Na、Cl含量數(shù)據(jù)及變化情況見表3和圖3?；旌辖M的血漿滲透壓8 h后顯著低于對照組，其余組均先上升后下降?；旌辖M的K持續(xù)降低，14 h時達到最低[(4.35±0.50) mmol/L]，此后回升；HCG組在0.5 h時達到最低，此后回升，其余組呈現(xiàn)降-升-降-升的波動變化。在Na上，混合組與DOM組整體持續(xù)上升，其余兩組在14 h時達到峰值后回落?；旌辖M的Cl含量波動較大，其余組在0.5 h顯著升高后，逐步降至對照組水平。鹽皮質(zhì)醇具有調(diào)控腎臟的滲透壓和離子交換的功能，從圖3可以看出，親本在注射催產(chǎn)劑后，鹽皮質(zhì)醇也發(fā)生了明顯的變化。

表3 長春鳊注射催產(chǎn)劑后血漿滲透壓、K+、Na+、Cl-含量的變化

圖3 血漿滲透壓(osmotic pressure)、K+、Na+、Cl-含量的變化情況

2.4 主成分分析

對不同時間點測得的13個指標進行主成分分析，并根據(jù)第一、二主成分的各因子得分繪圖(圖4)。結(jié)果表明，按累計貢獻率接近85%計，注射后0.5h，得到五個主成分，貢獻率分別為30.42%、20.62%、14.44%、11.17%及8.69%，累計貢獻率達85.34%；第一主成分的主要差異指標為E(載荷值0.411)、ALT(載荷值-0.345)、TG(載荷值0.361)、Na(載荷值0.340)、Cl(載荷值0.383)、OP(載荷值0.398)，顯示了不同的催產(chǎn)激素對促進卵子發(fā)育和各試驗組在抗應激上的差異。注射后8h，得到四個主成分，貢獻率分別為48.34%、18.51%、14.46%及8.61%，累計貢獻率達89.92%；第一主成分的主要差異指標為COR(載荷值-0.344)、AST(載荷值-0.345)、Na(載荷值-0.366)、Cl(載荷值0.390)、OP(載荷值0.392)，顯示了注射后8 h，各試驗組在應激上的差異。注射后14 h，得到四個主成分，貢獻率分別為29.60%、27.56%、15.05%及10.20%，累計貢獻率達82.41%；第一主成分的主要差異指標為TP(載荷值0.445)、GLU(載荷值0.396)、K(載荷值0.391)、Cl(載荷值0.436)，顯示了各試驗組在應對脅迫能力上的差異。注射后20 h，得到四個主成分，貢獻率分別為47.70%、19.35%、11.07%及8.00%，累計貢獻率達86.12%；第一主成分的主要差異指標為COR(載荷值0.332)、PRL(載荷值0.311)、AST(載荷值0.344)、TP(載荷值0.367)、Na(載荷值0.308)，這些指標主要表征機體的應激狀態(tài)和肝腎組織的異常。

圖4 13個指標的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of the 13 indicatorsA：LHRH-A2組，D：DOM組，H：HCG組，W：混合組。

3 討論

3.1 長春鳊的誘導產(chǎn)卵

魚類性腺發(fā)育是GtH緩慢而穩(wěn)定增加的結(jié)果，參與GtH分泌活動調(diào)節(jié)的神經(jīng)激素有很多，在鯉科魚類上，起主要作用的是GnRH和多巴胺。GtH分泌活動受到GnRH刺激和多巴胺抑制的雙重調(diào)節(jié)，并且多巴胺既直接抑制GnRH和GtH的釋放，也抑制GnRH刺激GtH釋放的作用。HCG、DOM及LHRH-A是鯉形目魚類人工繁殖中較為常用的催產(chǎn)劑，不同的魚類適應不同的催產(chǎn)劑，且一些魚類需要幾種催產(chǎn)劑混合使用才能成功催產(chǎn)。與團頭魴等其他魚類的誘導產(chǎn)卵不同，長春鳊的人工催產(chǎn)劑使用HCG+DOM+LHRH-A聯(lián)用效果最好，但親魚的應激反應較大。

雌二醇(E)是卵子發(fā)育和成熟過程中的重要效應分子。研究表明，性腺發(fā)育至成熟過程中，E含量逐漸上升至高峰，排卵前則降低。高水平的E可以促進卵子的發(fā)育，但會抑制排卵。本研究中，LHRH-A組在8 h時上升至對照組的23倍，混合組在14 h時上升至對照組的11倍，此后迅速回落；其余兩組變化不顯著。這與實際生產(chǎn)中，只有混合組和單獨注射LHRH-A組能有效誘導性腺成熟并排卵是一致的，但LHRH-A組過高的E可能是導致最終產(chǎn)卵率很低的重要原因。催乳素(PRL)能刺激卵泡促黃體激素(LH)受體的生成，后者能直接促進生殖細胞成熟。PRL作為一種垂體前葉激素，其分泌受下丘腦催乳素釋放抑制因子和催乳素釋放因子的雙重調(diào)節(jié)，任何干擾下丘腦多巴胺合成、多巴胺向垂體的運送等過程的作用，均可引起抑制性調(diào)節(jié)的減弱而使得PRL水平的升高。DOM組在注射后0.5 h，PRL水平上升。因為DOM不僅阻斷了多巴胺對GnRH的抑制作用，也阻斷了多巴胺對催乳素釋放的抑制作用，使得DOM組的催乳素水平升高；HCG組催乳素水平在0.5 h沒有明顯變化，說明HCG對長春鳊的誘導產(chǎn)卵作用沒有明顯效果；LHRH-A組和混合組在0.5 h催乳素水平明顯降低，這可能是他們對長春鳊的腦垂體產(chǎn)生了較大的刺激。因為腦垂體受刺激造成機能減退后，會降低催乳素的水平。14 h時，混合組和LHRH-A組催乳素回升，說明了這兩組催產(chǎn)劑發(fā)揮了誘導產(chǎn)卵的作用。20 h時，LHRH-A組的催乳素水平降低至最低值，說明效應時間已過。

3.2 長春鳊對不同催產(chǎn)激素的應激反應

在長春鳊的人工繁殖過程中，注射操作等其他行為也可能會對其造成一定的刺激，但主成分分析結(jié)果表明，注射后同一實驗組相同時間點的差異指標近似，而不同時間點的差異指標則不同，這說明，各組應激生理指標的變化確由不同的催產(chǎn)劑造成，實驗結(jié)果存在一定的參考意義。

HCG組的血糖、總蛋白、乳酸、甘油三酯均在短期內(nèi)顯著升高，說明HCG的注射對長春鳊造成了刺激。皮質(zhì)醇和AST在20 h時達到最高值，與混合組相當，血漿滲透壓也在20 h降至與混合組相當?shù)乃?，這可能都說明了混合組中的主要應激反應都與HCG聯(lián)系更緊密。GtH是高度種族特異性的，源自人體的HCG可能并不完全適用于長春鳊。DOM組的皮質(zhì)醇、ALT、AST及血漿滲透壓變化不顯著，說明應激反應不強烈，肝腎的生理功能沒有受到影響。血糖的升高與TP的降低可能是為了應對外源刺激，通過糖異生途徑生成了大量的血糖用于能量的補充。所以，DOM的注射雖引起長春鳊一定的應激反應，但影響不大。LHRH-A組皮質(zhì)醇在20 h顯著降低，說明了機體應對刺激的能力減弱，這可能是腦垂體受到過度刺激而出現(xiàn)紊亂的結(jié)果。因為LHRH-A組在8 h時，E增加至對照組的23倍，但并不能自行產(chǎn)卵。而ALT、AST及血漿滲透壓等其他所有指標都相對穩(wěn)定，說明了肝腎的生理功能正常?；旌辖M的皮質(zhì)醇水平在注射后8 h顯著高于對照組，且此后維持在較高水平，說明混合催產(chǎn)激素的注射對長春鳊造成了較大的刺激，而較高的ALT、乳酸,隨后較高的AST以及較低的TP和TG水平都表明這一刺激可能對肝的生理功能造成了較大的影響。雖然血糖較為穩(wěn)定，后期乳酸回到正常水平，且TP、TG都顯著高于對照組，說明糖類、脂類及蛋白的代謝得到了一定程度的恢復，但較高的AST說明這種恢復并不完全。同時，較低的血壓以及劇烈變化的K、Na、Cl也說明了應激可能對腎的生理功能造成了一定的影響。在魚類體內(nèi)，肝臟在消化、代謝、排泄、蛋白質(zhì)生物合成、內(nèi)分泌功能、能量儲存、激素清除、應激和免疫反應等各種生理過程中發(fā)揮著重要作用，這些特征使得肝臟成為研究魚類健康狀況的主要器官。

綜上所述，在三種激素中，DOM的刺激不強烈；HCG對長春鳊的刺激較大，可能對肝腎的生理功能造成一定的影響；LHRH-A對腦垂體的刺激比較強烈，會降低長春鳊對抗外界刺激的能力。因此，長春鳊人工繁殖中，親魚強烈的應激反應確實與催產(chǎn)劑的使用息息相關(guān)。所以，長春鳊的催產(chǎn)劑在組合和劑量上應該適當調(diào)整。根據(jù)本實驗結(jié)果，建議適當降低HCG的比例，同時應注重對產(chǎn)后親魚的護理，減少其應激。