王 梅, 王亞文, 賀 英, 李 剛, 景 瑞, 閻雄飛

(榆林學(xué)院 生命科學(xué)院, 陜西 榆林 719000)

老瓜頭(CynanchumkomaroviiAl. Lljinsk)又名牛心樸子、牛心樸子草、華北白前、對葉子草等，是蘿藦科(Asclepiadaceae)鵝絨藤屬(Cynanchum)一種生長于我國西北荒漠和半荒漠地區(qū)的重要有毒沙生植物之一，主要分布在內(nèi)蒙古自治區(qū)、寧夏回族自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)、陜西、甘肅和青海等地的荒漠和半荒漠地區(qū)，是草場退化和土地沙化的重要標(biāo)志性植物之一[1]。老瓜頭作為一種有毒植物，由于具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、繁殖快等特性，在干旱少雨等惡劣天氣情況下，大面積成片繁殖生長，擠占優(yōu)良牧草的生態(tài)位，抑制牧草的正常生長，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)啬撩穹拍梁筒輬鼋?jīng)濟(jì)的健康發(fā)展[2]。因此，對老瓜頭毒草資源進(jìn)行科學(xué)合理的開發(fā)和利用，對保護(hù)牧草資源、恢復(fù)草場經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)力和防止沙漠化具有重要的意義。

植物源農(nóng)藥的提取物大部分是多成分共同作用，且作用的方式多種多樣，在自然環(huán)境下非常容易降解；對于靶標(biāo)害蟲來說，不容易對農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，且對天敵等非靶標(biāo)生物相對安全[3]。此外，利用植物根、莖、葉等材料加工的農(nóng)藥具毒性相對低、殘留相對少的優(yōu)點(diǎn)，植物源農(nóng)藥將有毒植物器官中具有殺蟲、殺菌、除草等具有生物活性物質(zhì)(生物堿、萜類、黃酮類、菊酯類、精油類等)等提取出來，并將這些物質(zhì)通過選擇直接或間接加工成新的農(nóng)藥[4～8]。加之我國植物源農(nóng)藥資源豐富，因此，兼具有取材方便，成本低廉等優(yōu)勢，越來越受到人們的重視和關(guān)注。

二十一世紀(jì)以來，隨著分析化學(xué)和植物化學(xué)等科學(xué)技術(shù)的日新月異，老瓜頭具有抑菌[9～12]、除草[13～14]、殺蟲除螨[15～21]等多種生物活性逐漸被科研工作者發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。老瓜頭生物活性成分分離鑒定和作用機(jī)理的分析闡明，老瓜頭作為重要的植物源農(nóng)藥資源而成為研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著人們對農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境安全的日益重視，綠色植保逐漸融入人們的理念。鑒于此，開發(fā)和利用沙區(qū)有毒植物老瓜頭作為植物源農(nóng)藥，不僅可以解決該植物的資源合理利用問題，還為開發(fā)和研究老瓜頭為主的新植物源農(nóng)藥提供新的資料，進(jìn)而給我國西北荒漠地區(qū)帶來較高的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

供試藥物：2017年4月于陜西省榆林市佳縣朱家坬鎮(zhèn)采摘老瓜頭全株若干，帶回榆林學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。將老瓜頭全草置于50℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重。進(jìn)行充分干燥后，使用40目粉碎機(jī)粉碎，將老瓜頭粉末放入密封袋中備用。陽性對照藥物為銀黃顆粒，購自成都神鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司。

供試?yán)ハx：粘蟲(Mythimnaseparata)、棗飛象(Scythropusyasumatsui)、山楂葉螨(Tetranychuscinnbarinus)和小地老虎(Agrotisypsilon)均由榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院提供。棗飛象供試蟲態(tài)為成蟲，山楂葉螨為成螨，粘蟲、小地老虎均為3齡幼蟲。試驗(yàn)中選取大小、形態(tài)一致的昆蟲備用。

儀器與試劑：JK-450數(shù)控超聲波清洗儀；GZX-9070數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；SHZ-D(III)循環(huán)水多用真空泵；RE52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；分析純乙醇、石油醚、正丁醇，天津福晨化學(xué)試劑廠；分析純丙酮、乙酸乙酯，上海邦成化工有限公司；200～300目柱層析色譜硅膠，奧普斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 老瓜頭提取物的制備 每次取老瓜頭樣品1 000 g，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、純凈水，在超聲波清洗儀中浸提3次，每次30 min，合并浸提液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸浸提液，至浸提液成為膏狀后，回收溶劑；得到老瓜頭不同溶劑的提取物。裝入試劑瓶中，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 老瓜頭殺蟲活性 研究所用的實(shí)驗(yàn)的提取物濃度均為400 mg/mL，打孔器直徑d=0.80 cm，養(yǎng)蟲瓶高度h=10 cm，直徑d=8 cm。采用小葉碟法[22]測定不同提取物對粘蟲和小地老虎3齡幼蟲以及棗飛象成蟲的胃毒活性。具體方法：將新鮮的玉米葉片用圓形打孔器打成葉碟，置于配制好的400 mg/mL藥液中浸漬3～5 s，自然晾干后，放入養(yǎng)蟲瓶中，再接入饑餓4 h的粘蟲和小地老虎；將新鮮的棗樹葉片用圓形打孔器打成葉碟，置于配制好的藥液中浸漬3～5 s，自然晾干后，接入饑餓4 h的棗飛象成蟲。

采用微量點(diǎn)滴法[23]測定試材對粘蟲、棗飛象和小地老虎的觸殺作用，以微量點(diǎn)滴儀點(diǎn)滴藥液至粘蟲和小地老虎3齡幼蟲前胸背板及棗飛象成蟲腹面，以點(diǎn)滴等量丙酮為對照。采用玻片浸漬法[23]測定試材對山楂葉螨的觸殺作用。以吐溫-80水溶液稀釋老瓜頭不同提取物至供試質(zhì)量濃度，將粘好的山楂葉螨玻片在藥液中浸漬3～5 s取出，用吸水紙吸去多余藥液，以吐溫-80水溶液作為空白對照。

上述殺蟲活性反應(yīng)中，各處理均重復(fù)3次，其中粘蟲、棗飛象和小地老虎每重復(fù)30頭試蟲，山楂葉螨每重復(fù)50頭試蟲。處理后，均放置于養(yǎng)蟲室，溫度26±1℃，相對濕度為65±15%，光和暗周期為12 h∶12 h飼養(yǎng)，分別于處理后24 h和48 h進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算校正死亡率。

分別對石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物進(jìn)行同等劑量下的殺蟲活性比較，確定正丁醇提取物的殺蟲活性最高，對其進(jìn)一步進(jìn)行柱層析分離，以100頭粘蟲3齡幼蟲為供試?yán)ハx進(jìn)行活性追蹤試驗(yàn)。具體步驟：取25 g正丁醇提取物，用少量正丁醇溶解后吸附在一定硅膠上進(jìn)行硅膠柱層析，用正丁醇/乙酸乙酯(體積比100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次洗脫。測定各洗脫組分的殺蟲活性，每種昆蟲的供試數(shù)量為80頭，進(jìn)一步選取高活性組分段進(jìn)行二次硅膠柱層析，依次使用用正丁醇/丙酮(體積比同上)、丙酮和甲醇洗脫。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 2.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 老瓜頭不同溶劑提取物對棗飛象成蟲殺蟲活性

溶劑提取物對棗飛象成蟲殺蟲活性測定結(jié)果見(表1)，不難看出400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物對粘蟲的殺蟲活性最高，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)。正丁醇提取物胃毒處理?xiàng)楋w象24 h和48 h后，校正死亡率分別為68.4%和73.4%，觸殺處理24 h和48 h，棗飛象校正死亡率分別為55.2%和64.8%，正丁醇提取物對棗飛象的胃毒活性優(yōu)于觸殺活性。水提取物對棗飛象的殺蟲活性最差。棗飛象胃毒處理24 h和48 h，校正死亡率分別為8.3%和12.6%；觸殺處理24 h和48 h，校正死亡率分別為14.3%和15.1%。老瓜頭石油醚提取物與乙酸乙酯提取物對棗飛象的胃毒和觸殺效果較差，胃毒校正死亡率為30%～45%，觸殺校正死亡率為25%～40%，石油醚和乙酸乙酯提取物對棗飛象殺蟲活性無顯著差異。

2.2 老瓜頭不同溶劑提取物對粘蟲幼蟲殺蟲活性

由表2可知，老瓜頭水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物濃度為400 mg/mL時(shí)，正丁醇提取物處理粘蟲24 h和48 h，觸殺校正死亡率分別為58.7%和63.9%，而胃毒校正死亡率分別為68.7%和72.3%。正丁醇提取物對粘蟲的殺蟲活性最好，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)，且正丁醇提取物對粘蟲的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。水提物處理粘蟲24 h和48 h，觸殺校正死亡率分別為13.1%和15.8%，而胃毒校正死亡率分別為25.1%和32.2%。老瓜頭水提取物對粘蟲的觸殺和胃毒效果最差。老瓜頭石油醚提取物與乙酸乙酯提取物對粘蟲的胃毒和觸殺效果較差，觸殺校正死亡率為22%～32%，胃毒校正死亡率為34%～48%，石油醚和乙酸乙酯提取物對粘蟲殺蟲活性無顯著差異。

表1 老瓜頭不同極性提取物對棗飛象成蟲的殺蟲活性

表2 老瓜頭不同溶劑提取物對粘蟲3齡幼蟲的毒殺活性

2.3 老瓜頭不同溶劑提取物對小地老虎殺蟲活性

老瓜頭不同溶劑提取物對小地老虎幼蟲殺蟲活性測定結(jié)果見(表3)，由表可知400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物正丁醇的殺蟲活性最好，顯著高于其它3種溶劑提取物(P<0.05)。正丁醇提取物對小地老虎的胃毒活性顯著優(yōu)于觸殺活性。胃毒處理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率為64.1%和68.2%，而觸殺處理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率為37.9%和42.4%。其次為老瓜頭石油醚提取物處理24 h和48 h，對小地老虎的觸殺效果分別為24.2%和29.4%，而胃毒校正死亡率分別為48.7%和55.6%；老瓜頭水提取物與乙酸乙酯提取物對小地老虎的胃毒和觸殺效果最差，48 h觸殺校正死亡率為13%～19%，48 h胃毒校正死亡率為26%～39%，水和乙酸乙酯提取物對小地老虎殺蟲活性無顯著差異。

表3 老瓜頭不同溶劑提取物對小地老虎3齡幼蟲的毒殺活性

2.4 老瓜頭不同溶劑提取物對山楂葉螨殺蟲活性

老瓜頭不同溶劑提取物對山楂葉螨觸殺活性測定結(jié)果見(表4)，由表可知400 mg/mL老瓜頭水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，乙酸乙酯和正丁醇的觸殺活性較好，乙酸乙酯處理24 h和48 h，校正死亡率分別為53.4%和58.2%，正丁醇處理24 h和48 h，校正死亡率分別為55.7%和60.7%，即老瓜頭乙酸乙酯和正丁醇提取物對山楂葉螨觸殺活性無顯著差異。老瓜頭水提取物對山楂葉螨的觸殺活性最差，處理24 h和48 h，校正死亡率分別為26.3%和31.1%；而老瓜頭石油醚提取物處理24 h和48 h，校正死亡率分別為44.2%和50.5%。

表4 老瓜頭不同溶劑提取物對山楂葉螨的觸殺活性

2.5 老瓜頭正丁醇提取物柱層析不同組分對粘蟲的殺蟲活性測定

經(jīng)薄層層析分離老瓜頭正丁醇提取物，得到11個(gè)組分，按照洗脫順序分別標(biāo)記為X1～X11。對這11個(gè)組分進(jìn)行生測，測定其對粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性，結(jié)果如表5，表明正丁醇提取物的活性成分主要集中在X4中。測定X4組分對棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的殺蟲活性，由表6可知，老瓜頭正丁醇段提取物X4組分對棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的24 h和48 h的觸殺校正死亡率為70%～80%，而對棗飛象、粘蟲和小地老虎24 h和48 h的胃毒校正死亡率為大于90%。研究結(jié)果表明X4組分對棗飛象、粘蟲和小地老虎的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。因此，今后以老瓜頭正丁醇提取物X4組分為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行其類似化合物的合成，為研發(fā)植物源殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

表5 老瓜頭正丁醇提取物薄層層析不同組分對粘蟲3齡幼蟲的殺蟲活性

表6 老瓜頭正丁醇段提取物X4組分的殺蟲活性

3 討論與結(jié)論

老瓜頭是一種廣泛的分布于陜北地區(qū)的一種毒草資源。研究將的老瓜頭通過不同溶劑萃取獲得不同溶劑提取物，并測定其對棗飛象、粘蟲、小地老虎和山楂葉螨的殺蟲活性。老瓜頭正丁醇提取物對棗飛象、粘蟲和小地老虎的殺蟲活性最好，且其胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。這和張維庫[15]對粘蟲的研究結(jié)果并不一致。主要原因?yàn)楣P者研究的提取物含有的物質(zhì)可能不是生物堿。老瓜頭水提取物的殺蟲活性最差，胃毒和觸殺處理48 h，供試?yán)ハx的校正死亡率小于35%。這和美國白蛾[18]等的研究結(jié)果不一致，主要原因?yàn)樗疄闃O性溶劑，提取出的老瓜頭活性物質(zhì)和其它三種溶劑并不相同，也可能是不同處理方法造成的。

通過對山楂葉螨殺蟲活性測定發(fā)現(xiàn)，老瓜頭正丁醇和乙酸乙酯提取物對山楂葉螨的觸殺活性最好，觸殺處理48 h，校正死亡率分別為60.7%和58.2%，石油醚提取物次之，校正死亡率為50.5%，老瓜頭水相提取物最差，校正死亡率為31.1%。研究結(jié)果表明，老瓜頭水相的殺蟲活性最差，這于劉晨[17]等對地紅蝽的研究結(jié)果一致，主要原因?yàn)槔瞎项^內(nèi)吸性溶劑存在于正丁醇和乙酸乙酯中。

筆者研究對老瓜頭正丁醇提取物進(jìn)行柱層析分離，獲得11個(gè)不同組分，對粘蟲3齡幼蟲進(jìn)行殺蟲活性測定發(fā)現(xiàn)，X4組分的殺蟲活性最好，即老瓜頭殺蟲活性物質(zhì)主要集中在X4組分中，且X4組分的胃毒效果優(yōu)于觸殺效果。剡根姣等[19]研究發(fā)現(xiàn)，老瓜頭乙醇提取物對小菜蛾具有較好的拒食作用，觀察發(fā)現(xiàn)老瓜頭乙醇提取物對小菜蛾的口器感受器具有破壞性，楊曼[18]研究發(fā)現(xiàn)，老瓜頭水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮5種溶劑粗提物中甲醇提取物和乙醇提取物對美國白蛾的胃毒活性強(qiáng)烈，筆者研究結(jié)果與之一致，可能是由于老瓜頭生物堿中的殺蟲活性物質(zhì)溶于醇類有機(jī)溶劑。

老瓜頭作為植物藥用資源有很大的研發(fā)空間與價(jià)值，開發(fā)和利用沙區(qū)有毒植物老瓜頭作為植物源農(nóng)藥，可以解決該植物的資源合理利用問題。研究初步明確了老瓜頭正丁醇提取物的殺蟲活性較好，對鱗翅目和鞘翅目的胃毒和觸殺效果均較好，且對山楂葉螨的觸殺效果也較好，即老瓜頭是一種潛在的與可開發(fā)的資源。研究為植物源殺蟲劑的研發(fā)奠定了一定的理論基礎(chǔ)。