張金鑫， 童亞楠， 郝珊瑚， 王治國， 張國旭

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016；2.中國醫(yī)科大學(xué) 北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽 110016

阿爾茲海默病(Alzheimer′s disease，AD)又名老年性癡呆，是一類起病較隱蔽、但呈慢性加重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是癡呆癥中最常見的一種類型。其病理特點(diǎn)主要是β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)異常堆積形成炎性斑塊、Tau蛋白異常磷酸化形成纖維纏結(jié)，以及突觸受損、神經(jīng)元大量喪失等。目前，AD發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，且未發(fā)現(xiàn)具有顯著治療效果的藥物和方法[1-3]。隨著人口老齡化，AD將會(huì)帶來嚴(yán)重的醫(yī)療、社會(huì)及經(jīng)濟(jì)問題[4]。因此，尋找能夠高效防治AD的藥物和方法已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。腸道菌群是影響人體健康的關(guān)鍵因素，腸道菌群失衡可能引起AD發(fā)生[5]。合生元制劑是益生元和益生菌的結(jié)合，在調(diào)節(jié)菌群平衡方面，服用合生元制劑比單獨(dú)使用益生元或益生菌更有效[6-7]。本研究以APP/PS1癡呆小鼠為模型，觀察服用合生元制劑對(duì)其行為學(xué)的影響，以及小鼠腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積情況，探討合生元制劑治療AD的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24只APP/PS1癡呆小鼠，5月齡，雄性，體質(zhì)量24～30 g；以及12只C57BL/6J野生小鼠，5月齡，雄性，體質(zhì)量24～30 g。APP/PS1癡呆小鼠由雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和雌性野生型C57BL/6J小鼠交配所得。種鼠購于北京華富康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科動(dòng)物房，所有小鼠自由進(jìn)食水。本實(shí)驗(yàn)已獲得北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[Y(2021)024號(hào)]。

1.2 儀器與試劑 Morris水迷宮，切片機(jī)，攤烤片機(jī)，4%動(dòng)物組織固定液，PV二抗試劑盒，DAB顯色試劑盒，蘇木素染色液，二甲苯，PBS磷酸鹽酸緩沖液，無水乙醇，中性樹膠，生物安全柜，重組Anti-beta Amyloid抗體(Abcam公司，稀釋比例1∶100)，嗜酸乳桿菌(菌種編號(hào)LA-G80)，乳雙歧桿菌(菌種編號(hào)BL-G101)，低聚木糖(上海潤(rùn)盈生物工程有限公司)。乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、低聚木糖制成凍干粉末，即合生元制劑。其中，含乳雙歧桿菌2.5×109cfu/ml，嗜酸乳桿菌2.5×109cfu/ml，低聚木糖0.5 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥 采用隨機(jī)分組的方式將APP/PS1癡呆小鼠分成兩組，對(duì)照組和治療組各12只；另將12只C57BL/6J小鼠作為空白組。所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，治療組和對(duì)照組小鼠分別灌胃合生元制劑和低聚木糖，每次給藥劑量為0.5 ml/只，空白組小鼠灌胃等量的生理鹽水，每天3次，持續(xù)灌胃3個(gè)月。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后第2天，采用Morris水迷宮觀察各組小鼠的記憶和空間學(xué)習(xí)能力。Morris水迷宮設(shè)備是由水下平臺(tái)、圓形水池、標(biāo)志物、視頻采集系統(tǒng)及行為學(xué)分析系統(tǒng)組成。水池直徑100 cm、高60 cm，其中，水深35 cm，留出25 cm的邊緣放置提示方位用的標(biāo)志物，分為4個(gè)象限(E、W、S、N)，平臺(tái)放置于西北象限的中心、水面以下1～2 cm。水中滴加白色素，水溫維持在20℃～22℃。按序?qū)⑿∈髲?個(gè)象限放入水中，放置時(shí)小鼠面朝池壁，下水輕柔，每次游泳60 s，記下小鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間(逃逸潛伏期)和游泳軌跡。若小鼠在規(guī)定時(shí)間找到平臺(tái)則允許小鼠在平臺(tái)停留15 s；若小鼠在規(guī)定時(shí)間未找到平臺(tái)，引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)，并讓小鼠在平臺(tái)停留15 s。每只小鼠每天游泳4次，連續(xù)5 d。第5天訓(xùn)練結(jié)束后，撤掉水下平臺(tái)，將各組小鼠從平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)放入水中，讓其游泳60 s，記錄每只小鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間。

1.3.3 腦組織取材及免疫組化檢測(cè) Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將所有小鼠脫頸處死，取出整個(gè)腦組織放入4%動(dòng)物組織固定液中。將腦組織中的海馬及皮層組織進(jìn)行石蠟包埋，用于免疫組化檢測(cè)，切片厚度為5 μm。檢測(cè)步驟：(1)脫蠟、水化。切片用二甲苯浸泡3次，每次10 min；不同濃度乙醇分別浸泡5 min，蒸餾水沖洗3次，每次2 min。(2)3%甲醇過氧化氫孵育15 min，PBS緩沖液沖洗。(3)高壓修復(fù)后將切片放入PBS緩沖液中。(4)切片上滴加一抗(重組Anti-beta Amyloid抗體)，4℃過夜，次日取出，PBS緩沖液沖洗3遍，每遍3 min。(5)切片上滴加二抗(生物素)，室溫下孵育15 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每遍3 min；DAB顯色5～10 s，蒸餾水沖洗，終止顯色。(6)蘇木素復(fù)染，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明每10 min 2遍，隨后封片。(7)電子顯微鏡觀察，截取不同視野組織進(jìn)行圖像分析，存檔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。Morris水迷宮數(shù)據(jù)采用GraphPad prism 8作圖，統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 合生元制劑對(duì)APP/PS1癡呆小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響 空白組、對(duì)照組、治療組第5天Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠游泳運(yùn)動(dòng)軌跡見圖1。隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間逐漸縮短，但對(duì)照組小鼠進(jìn)步不明顯；與空白組比較，在實(shí)驗(yàn)的第3、4、5天時(shí)，對(duì)照組逃逸潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)的第4、5天時(shí)，治療組逃逸潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。與空白組比較，對(duì)照組穿越平臺(tái)次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，治療組穿越平臺(tái)次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3～4。

圖1 第5天Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠游泳軌跡比較 圖2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠逃逸潛伏期比較

圖3 各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較 圖4 各組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

2.2 合生元制劑對(duì)APP/PS1癡呆小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ表達(dá)的影響 腦組織免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，黃色斑塊為陽性表達(dá)(黑色箭頭示)。與空白組比較，對(duì)照組小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ斑塊表達(dá)增多；與對(duì)照組比較，治療組小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ斑塊表達(dá)減少。見圖5～6。與空白組比較，對(duì)照組腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)平均光密度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，治療組腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)平均光密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖7～8。

圖5 各組小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ表達(dá)情況(400倍，黑色箭頭所指為Aβ斑塊沉積)

圖6 各組小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)Aβ表達(dá)情況(400倍，黑色箭頭所指為Aβ斑塊沉積)

圖7 各組小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)Aβ平均光密度比較 圖8 各組小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)Aβ平均光密度比較

3 討論

Morris水迷宮由英國心理學(xué)家莫里斯于1981年首次提出，主要用于評(píng)定嚙齒類動(dòng)物的記憶和空間學(xué)習(xí)能力[8]。Morris水迷宮利用嚙齒類動(dòng)物天生會(huì)水而又怕水的特點(diǎn)作為驅(qū)動(dòng)力，強(qiáng)迫動(dòng)物搜尋水下隱藏的平臺(tái)，學(xué)會(huì)利用周圍參照物與水下平臺(tái)的關(guān)系，強(qiáng)化其空間探索和認(rèn)知能力，是目前AD動(dòng)物模型研究中使用最為頻繁的行為學(xué)檢測(cè)方法之一[9]。Morris水迷宮一般分為隱匿平臺(tái)實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。隱匿平臺(tái)實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)觀察對(duì)象學(xué)習(xí)能力的大小，觀測(cè)指標(biāo)主要包括潛伏期、游泳軌跡、游泳速度、游泳距離及探索策略等；而空間探索實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)觀察對(duì)象空間記憶的維持能力，觀測(cè)指標(biāo)主要包括穿越平臺(tái)次數(shù)、目標(biāo)象限停留時(shí)間、游泳總距離等[10]。Morris水迷宮在大量嚙齒類動(dòng)物中的廣泛應(yīng)用證實(shí)了其有效性和可靠性[11-13]。

本研究主要以逃逸潛伏期評(píng)定各組小鼠的空間學(xué)習(xí)能力，以穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間評(píng)定各組小鼠的空間記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)與空白組比較，在實(shí)驗(yàn)的第3、4、5天時(shí)，對(duì)照組逃逸潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，在實(shí)驗(yàn)的第4、5天時(shí)，治療組逃逸潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)與空白組比較，對(duì)照組穿越平臺(tái)次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，治療組穿越平臺(tái)次數(shù)增加，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示，APP/PS1癡呆小鼠存在明顯的記憶和空間學(xué)習(xí)障礙，而合生元制劑可有效提高小鼠的記憶和空間學(xué)習(xí)能力，改善其認(rèn)知功能損傷，延緩AD進(jìn)程。免疫組化檢測(cè)可分析合生元制劑干預(yù)后AD小鼠行為學(xué)改變的原因，結(jié)果顯示：(1)與空白組比較，對(duì)照組小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ斑塊表達(dá)增多；與對(duì)照組比較，治療組小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ斑塊表達(dá)減少。(2)與空白組比較，對(duì)照組腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)平均光密度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，治療組腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)平均光密度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明，APP/PS1癡呆小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積多，符合AD小鼠的病理變化，且合生元制劑可降低APP/PS1癡呆小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)的Aβ沉積。

綜上所述，合生元制劑可有效降低APP/PS1癡呆小鼠腦內(nèi)海馬及皮質(zhì)區(qū)Aβ沉積，顯著增強(qiáng)小鼠的記憶和空間學(xué)習(xí)能力，改善認(rèn)知功能損傷，從而延緩AD進(jìn)程，為AD的防治提供了新的方向，但具體作用機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。