張 婷， 王太恒， 祁建華， 李先國， 張大海??

(1. 中國海洋大學化學化工學院， 山東 青島 266100； 2. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100)

近年來，中國經(jīng)濟迅猛發(fā)展，隨之而來的副產(chǎn)物——霧霾，頻繁覆蓋全國各大城市，且多以“組合”的形式出現(xiàn)在大眾視野[1]。一方面雖然霧、霾產(chǎn)生的機理不同，但都伴隨著能見度低、風速小、相對濕度高的特點。另一方面，均與大氣氣溶膠有密不可分的聯(lián)系[2]，并且特定時間段內(nèi)，隨著相對濕度的變化，二者可以相互轉化[3]。Meng等[4]研究發(fā)現(xiàn)，霧滴可以促進細顆粒物在近地表層的積累，進而影響其時空分布。

霾又稱灰霾和陰霾，其中PM2.5是霾發(fā)生的主要原因[5]，霧霾天氣下生物氣溶膠群落結構特征已經(jīng)有很多相關報道[6-7]。Wei等[8]利用紫外空氣動力學粒子光譜儀檢測霧霾環(huán)境下大氣生物氣溶膠，發(fā)現(xiàn)霧霾天氣下熒光粒子濃度是晴天的6倍以上，同時霧霾環(huán)境下生物氣溶膠中具有更多的致敏和致病性微生物。生物氣溶膠受霧霾天氣影響顯著，同時也有研究發(fā)現(xiàn)，生物氣溶膠的群落結構表現(xiàn)出明顯的季節(jié)變化。Du等[9]發(fā)現(xiàn)，北京市霧霾期間生物氣溶膠群落結構與污染水平?jīng)]有明顯的相關性，主要是由季節(jié)變化驅動。在天氣監(jiān)測與研究中，霧和霾是兩種不同的天氣現(xiàn)象[10]。霧是一種低層云，作為一種災害性自然現(xiàn)象，會對交通運輸、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和公共生活造成影響。霧天相對濕度高、光照較弱，不益于人們進行室外活動，容易造成胸悶、氣短和注意力不集中等不良反應。但是微生物在這種生存條件下可以保持良好的活性及代謝能力[11]。霾是空氣中顆粒物增多，導致能見度降低的大氣污染現(xiàn)象[12]。霾天細顆粒物增多，為微生物提供了附著、傳播的載體，同時大氣中金屬離子、有機化合物(例如多環(huán)芳烴)和硝基衍生物等濃度發(fā)生顯著波動，某些成分對微生物的生存具有毒性作用，從而導致耐性差的物種消失[13]。簡而言之，以霧霾或顆粒物水平進行研究，會導致霧天生物氣溶膠的群落特征認知模糊，健康風險被忽視。由于霧、霾本質(zhì)上的差異，應該在研究中對二者進行嚴格地區(qū)分。

本研究排除采樣時間跨度帶來的影響，同時基于霧和霾本質(zhì)上的差異，采集青島市2020年7—9月空氣質(zhì)量指數(shù)(Air Quality Index,AQI)小于100且不同相對濕度下的生物氣溶膠樣品。分析霧天與晴天環(huán)境下細菌群落結構差異，結合BugBase細菌功能預測和人間傳染微生物的研究結果，評估了高相對濕度下生物氣溶膠給人體帶來的健康風險。

1 材料和方法

1.1 采樣時間及地點

采樣地點位于中國海洋大學嶗山校區(qū)氣象觀測站(36°10′N, 120°30′E)(見圖1)。于2020年7—9月采集不同相對濕度生物氣溶膠樣品，按AQI<100，相對濕度90.00%為標準[14]分為2個霧天(F1、F2)和2個晴天樣本(S1、S2)。

圖1 采樣位置

1.2 采樣方法

采用KC-1000型大流量TSP采樣器(青島嶗山電子儀器總廠有限公司)采集生物氣溶膠樣品，流量1 m3·min-1，采樣時間24 h，采樣膜采用石英纖維濾膜，采樣前用馬弗爐500 ℃灼燒4 h，采樣后用無菌錫箔紙包裹，放置在超低溫冰箱內(nèi)保存。氣象數(shù)據(jù)來源于青島市氣象局(http://qdqx.qingdao.gov.cn/)，顆粒物和氣體污染物濃度來源于青島市環(huán)境保護局資料(http://www.qepb.gov.cn/m2/index.aspx)(見表1)。

表1 采樣期間氣象參數(shù)、顆粒物及氣體污染物濃度

1.3 DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[15]對樣本的基因組DNA進行提取，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋。以稀釋后的基因組DNA作為聚合酶鏈式(PCR)反應模板，對16SrRNA基因的V4-V5區(qū)域進行擴增。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫，經(jīng)過量子(Qubit)和定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)定量。文庫合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣本的測序讀段(Reads)進行拼接、過濾和去除嵌合體的處理，得到最終的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。利用Uparse軟件對所有樣本的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97.00%的一致性將序列聚類成為可操作分類單元(OTU)，根據(jù)OTUs序列進行物種注釋[16]。

1.4 功能注釋

利用BugBase[17]對細菌進行功能注釋，以97.00%的一致性將序列聚類成為的OTU表作為輸入文件。首先通過預測的16S拷貝>數(shù)對OTU表進行標準化處理，然后使用預先處理好的數(shù)據(jù)庫和BugBase工具自動選擇的閾值來預測微生物表型。分為以下七類：革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、生物膜形成、致病性、移動元件、氧需求(好氧型、厭氧型和兼性厭氧型)及氧化脅迫耐受。

2 結果與討論

2.1 Alpha多樣性分析

兩組樣品經(jīng)拼接、質(zhì)控和去嵌合體后共得到有效數(shù)據(jù)124 466條，以97.00%的一致性聚類為352個OTU，注釋到34門、58綱、118目、163科、201屬和91種。兩組樣品覆蓋率均為1，說明測序深度已達到要求，樣品具有代表性。樣品韋恩圖(見圖2)顯示，霧天總OTUs數(shù)值為237、獨有OTUs數(shù)值為58，晴天總OTUs數(shù)值為294、獨有OTUs數(shù)值為115，均高于晴天。Dong等[18]研究發(fā)現(xiàn)，霧天微生物的濃度為9.00×105cells·m-3，漲幅約為晴天的37.00%，采樣期間霧天PM2.5濃度為76.50μg·m-3，晴天為52.20μg·m-3，而本研究采樣期間霧天AQI，PM2.5和PM10等污染物濃度均低于晴天(見表1)，顆粒物污染可能是導致研究結果相反的重要原因，說明本研究排除了類似霾天的顆粒物污染。

圖2 樣本韋恩圖

霾天細菌氣溶膠相關研究發(fā)現(xiàn)，霾發(fā)生時微生物總數(shù)增加[19]，不同天氣下微生物總數(shù)呈現(xiàn)：霾天>晴天>霧天。兩組樣品共有OTUs數(shù)為179，說明這些物種具有較強的適應能力，可以在不同天氣條件下穩(wěn)定生存。隨著相對濕度的升高，樣品中OTUs呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢。當相對濕度開始升高時，一些細菌物種不能適應環(huán)境的改變而消失，OTUs降低；當相對濕度高達90%(霧天)以上時，一些適應高相對濕度環(huán)境的物種變多，OTUs升高；但當相對濕度高達99%時，此時的生存環(huán)境對于微生物是比較苛刻的，導致OTUs再次下降。

晴天香農(nóng)指數(shù)(3.63)、辛普森指數(shù)(0.72)、Chao1指數(shù)(222.01)均大于霧天(香農(nóng)指數(shù)(2.73)、辛普森指數(shù)(0.55)、Chao1指數(shù)(216.39))，說明晴天樣品的生物多樣性、豐富度和均勻度更高，這與霾天物種多樣性的變化趨勢相同。霧、霾天氣發(fā)生時，生物多樣性呈下降趨勢。相關研究表明，相對濕度與微生物多樣性呈顯著負相關[9,20]，解釋了霧天生物多樣性的下降。霧天時，一些細菌不能適應生存條件的改變而大規(guī)模消失，與此同時適應霧天環(huán)境的物種增加，組內(nèi)親緣指數(shù)上升(霧天：26.115、晴天：19.611)，說明霧天樣品的組內(nèi)親緣關系更復雜，晴天兩個樣本群落結構更加相似，F(xiàn)2采樣期間相對濕度高達99%，與另一個樣品區(qū)別較大，說明相對濕度越高，生物多樣性變化幅度越大。

2.2 細菌群落結構

由前十門相對豐度圖(見圖3(a))可知，前十門相對豐度差別較大，變形菌門占主導地位，具有絕對優(yōu)勢，是霧天和晴天樣品的優(yōu)勢菌門，霧天相對豐度為79.48%、晴天相對豐度為69.67%。斯皮爾曼相關性分析(見圖4(a))顯示，變形菌門與氣象因子并沒有明顯的相關性。相關研究表明，變形菌門是細菌中最大門類，也是不同地區(qū)，不同生物氣溶膠樣本中優(yōu)勢菌門[21-22]。其次是放線菌門(霧天11.72%、晴天13.91%)和厚壁菌門(霧天2.67%、晴天3.80%)。霾天相關研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門與厚壁菌門相對豐度差別不大[23-24]。然而本研究中二者相對豐度相差極大，變形菌門的相對豐度是厚壁菌門的20倍，采樣時平均相對濕度高達87%，同時厚壁菌門在霧天的相對豐度小于晴天，說明變形菌門受相對濕度變化影響較小，但厚壁菌門影響較大。當霧發(fā)生時藍細菌門和脫硫菌門相對豐度明顯降低(藍細菌門：晴天5.38%、霧天0.55%；脫硫菌門：晴天相對0.17%、霧天小于0.01%)。由圖4(a)可以看出，以上兩個細菌門與相對濕度呈負相關，說明藍細菌門與脫硫菌門不適應高濕度的生存環(huán)境，相對濕度增加，兩種門類的一些菌種消失。擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門等在兩組樣品中差別不大，說明以上幾種菌門對環(huán)境的耐性較好，受環(huán)境影響較小。

由前十屬相對豐度圖(見圖3(b))可以看出，羅爾斯通氏菌在兩組樣品中相對豐度均超過50%(霧天64.29%、晴天51.28%)，是兩組樣品的絕對優(yōu)勢菌屬。羅爾斯通氏菌又名青枯菌，是一種已知的植物病原體，被稱為植物“癌癥”，會造成農(nóng)作物減產(chǎn)[25]，屬水平相關性分析熱圖(見圖4(b))。圖4(b)顯示，羅爾斯通氏菌屬與O3呈正相關，采樣時霧天O3平均濃度高于晴天，因此相對濕度高的環(huán)境下需要對農(nóng)作物進行青枯病的防治。除羅爾斯通氏菌屬外，其他菌屬相對豐度較為均勻，丙酸菌(7.89%)和副球菌(4.39%)是晴天優(yōu)勢菌屬(相對豐度>2%)，短桿菌(4.33%)、丙酸菌(2.91%)和短波單胞菌(2.10%)是霧天優(yōu)勢菌屬。丙酸菌是皮膚病原菌，暴露于高濃度的丙酸桿菌，會引起面部以及軀干皮膚疾病[26]，丙酸菌與NO2呈正相關與相對濕度呈負相關，副球菌屬與溫度呈負相關，因此以上兩種菌屬在晴天相對豐度較高。短桿菌屬與溫度呈現(xiàn)正相關，不動桿菌屬與NO2呈現(xiàn)負相關，因此兩種菌屬在霧天相對豐度較高。

圖3 不同天氣下物種相對豐度圖

圖4 Spearman相關性分析熱圖

通過實驗結果發(fā)現(xiàn)：霧天微生物幾乎來源于本土，這一點與霾天相關研究有很大區(qū)別。霾天顆粒物增多，會帶來顆粒物源區(qū)的微生物菌屬[27-29]，同時不同地區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，霾發(fā)生時微生物群落變化較大，且優(yōu)勢菌屬具有很大差異[30]。但是霧天相對濕度高，不利于微生物的擴散和釋放[31]，出現(xiàn)新物種的概率較低，與晴天的細菌在屬水平上差異性較小，只是相對豐度有所不同。

2.3 基因功能注釋及健康風險

生物氣溶膠是微生物病原體(內(nèi)毒素、過敏原)的已知來源[32]，會對人類及動植物的健康造成不良影響[33-36]。國內(nèi)外對于生物氣溶膠健康風險的評估方式大體分為四種：動物實驗、沉積動力學、大數(shù)據(jù)和平均日暴露劑量率模型推算。其中最常用的還是1999年美國環(huán)境保護署提出的平均日劑量率(ADD)模型[37]，但可培養(yǎng)類微生物在空氣中微生物總數(shù)的占比不到1%，隨著高通量技術的發(fā)展，基因功能預測開始被應用于環(huán)境樣本的研究中。

由BugBase預測的細菌7種表型豐度圖(見圖5)可以看出，兩種天氣中好氧細菌相對豐度高達85%以上，晴天好氧細菌比霧天相對豐度高(晴天93.64%、霧天84.75%)，同時霧天厭氧細菌占比高于晴天(霧天0.80%、晴天0.47%)。霧天相對濕度高，空氣中聚集大量水珠，使氣溶膠粒子散射吸濕增長、消光特性增強[38]，從而導致霧天紫外線照射空氣透過率低，植物光合作用不充分，氧氣含量低于晴天。氧氣含量的降低使得一些對氧氣需求比較大的好氧型細菌物種消失，導致其豐度低于晴天。兩組樣品中兼性厭氧型細菌相差不大，相對豐度約為4%。霧天樣品中移動原件型細菌相對豐度70.13%，高于晴天樣品(56.55%)，移動原件型細菌可以使細菌進行表型進化，從而最大限度地獲得和適應環(huán)境，并生存繁殖出所必須的功能，霧天相對豐度高是因為一部分細菌進行了表型的進化，適應了高相對濕度的環(huán)境。兩種天氣中革蘭氏陰性菌占比均高于陽性菌，豐度相差不大。革蘭氏陰性菌相對豐度為85%左右，革蘭氏陽性菌相對豐度為13%左右。常見的藍細菌和大多數(shù)致病性芽孢桿菌均呈現(xiàn)革蘭氏陰性反應，如：傷寒桿菌、百日咳桿菌、霍亂桿菌等。相關研究表明，革蘭氏陰性菌細胞壁外層特有的結構——內(nèi)毒素[39]，作為外源性致熱源會影響體溫調(diào)節(jié)中樞，引起宿主發(fā)熱、發(fā)炎，同時很容易附著在顆粒上造成肺擴散能力降低[40-41]。葡萄球菌、肺炎雙球菌、破傷風等致病菌呈革蘭氏陽性反應，產(chǎn)生外毒素從而感染疾病。霧天潛在性致病菌相對豐度高達73.42%，高于晴天(59.95%)，霧天生物氣溶膠中的致病性細菌更多，給人體帶來的健康風險更大。

圖5 微生物預測表型豐度圖

兩種天氣條件下均檢測出棒狀桿菌、沙雷氏菌、葡萄球菌、奈瑟菌、不動桿菌和摩根氏菌6種人間傳染致病性微生物，霧天總相對豐度為6.51%，晴天為4.42%。其中棒狀桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌在兩種天氣下相對豐度相差不大，梭狀芽孢桿菌是棒狀桿菌屬中最需要關注的菌種，是引起傳染性疾病——白喉的病原體[42]。沙雷氏菌和不動桿菌廣泛分布于環(huán)境中，屬于條件性致病菌和醫(yī)院獲得性病原體，粘質(zhì)沙雷氏菌會引發(fā)術后病人敗血癥，鮑曼不動桿菌會引起肺炎、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及腦膜炎等。葡萄球菌分為兩大類：金黃色葡萄球菌和非金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌是社區(qū)和醫(yī)院獲得性感染的主要原因之一，會引起淺表膿腫和傷口感染、深部和全身性感染，例如骨髓炎和中毒性休克綜合征等疾病，在非金黃色葡萄球菌中，表皮葡萄球菌會造成導管的相關感染[43]。奈瑟菌在晴天含量較高(1.63%)，霧天相對豐度小于0.01%。不動桿菌以及摩根氏菌在霧天相對豐度較高(>1.5%)，晴天相對豐度小于0.01%，致病性奈瑟氏菌(淋病奈瑟氏球菌和腦膜炎奈瑟氏球菌)具有改變表面結構從而在人類黏膜組織上定殖的能力，進而導致淋病和流行性腦膜炎[44]。摩根氏菌常見于糞便中，是一種機會性致病菌。兩種天氣下潛在病原體與人間傳染微生物相對豐度變化結果表明，霧天致病性以及傳染性菌種更為豐富，需要更加引起關注。

3 結論

(1) 霧天OTUs、物種多樣性及豐富度均低于晴天，組內(nèi)親緣復雜度高于晴天。相對濕度越高，物種多樣性變化幅度越大。羅爾斯通氏菌、短桿菌、丙酸菌和短波單胞菌是霧天優(yōu)勢菌屬。霧天微生物幾乎來源于本土，與晴天存在的細菌屬水平上幾乎相同，只是相對豐度上有一定差異性。

(2) 革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌在兩組樣品中差別不大，霧天潛在致病性細菌相對豐度(73.42%)高于晴天(59.95%)。兩種天氣條件下均檢測出棒狀桿菌、沙雷氏菌、葡萄球菌、奈瑟菌、不動桿菌和摩根氏菌6種人間傳染致病性微生物，霧天總相對豐度為6.51%，晴天為4.42%。其中棒狀桿菌、沙雷氏菌和葡萄球菌在兩種天氣下相對豐度相差不大，奈瑟菌在晴天含量較高，不動桿菌和摩根氏菌在霧天相對豐度較高。

(3) 結合潛在病原體和人間傳染微生物分析，結果表明霧天生物氣溶膠給人體帶來的健康風險高于晴天。