何苑菲 孟令強(qiáng)

理想的骨移植材料需具備三個(gè)特性：骨傳導(dǎo)性、成骨性和骨誘導(dǎo)性，目前自體骨仍是傳統(tǒng)意義上骨移植材料的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。除了這三種特性外，自體骨組織還具有容易被忽視的第四種特性—旁分泌性[2]。通過(guò)旁分泌作用，移植的自體骨組織將各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子釋放到缺損區(qū)的周圍環(huán)境中，促進(jìn)缺損區(qū)的組織再生。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，自體骨移植物可通過(guò)旁分泌作用[3]將生長(zhǎng)因子釋放到培養(yǎng)基中，得到骨條件培養(yǎng)基（bone-conditioned medium，BCM），這種培養(yǎng)基的上清液可能是促進(jìn)骨再生自體生長(zhǎng)因子的新來(lái)源。

早在20世紀(jì)90年代初期就有關(guān)于“骨條件培養(yǎng)基”概念的闡述[4]，并在近期的一些研究中指出BCM與骨替代材料聯(lián)合應(yīng)用有較好的成骨效果，同大量移植自體骨相比，BCM與骨替代材料的聯(lián)合應(yīng)用有望減少移植的自體骨體積和其他損傷；與目前常用的幾種生長(zhǎng)因子相比，如濃縮生長(zhǎng)因子（concentrate growth factors，CGF）[5]、成品的骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)[6]、間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（MSCs-conditioned medium，MSCs-CM）[7]，BCM來(lái)源于自體骨組織，可避免免疫排斥反應(yīng)及倫理問(wèn)題，并且更易于制備和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。因此，本文就BCM的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述，旨在為BCM應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

一、BCM的概述

1.BCM的制備、儲(chǔ)存

目前根據(jù)制備BCM時(shí)加入的培養(yǎng)基不同分為兩種，首先收集皮質(zhì)骨屑：剝離骨面軟組織，使用鋒利的骨刮刀取下盡可能長(zhǎng)的皮質(zhì)骨屑，將其置入培養(yǎng)皿中；其次加入培養(yǎng)基，其中一種方式是加入杜爾貝科改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco's modification of eagle's medium，DMEM），另一種為加入生理溶液與自體血清1：1的混合溶液，在加入培養(yǎng)基的同時(shí)加入1%的抗生素和抗真菌藥保持活性，每5 g離體骨屑加入10 ml培養(yǎng)基及1%抗生素和抗菌藥物，置于37°C環(huán)境中，培養(yǎng)時(shí)間從10 min到3 d不等；最后將培養(yǎng)基混合物在200×g下離心10 min，去除骨碎屑后無(wú)菌過(guò)濾（0.2 nm），得到BCM，-80°C冷凍保存[8～10]。

2.BCM中富含生長(zhǎng)因子

骨缺損區(qū)釋放的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子通過(guò)吸引、募集骨源性間充質(zhì)細(xì)胞激活缺損區(qū)骨整合和骨再生。研究顯示，在BCM中檢測(cè)到了與MCMs-CM類似的天然皮質(zhì)骨分泌蛋白混合物，有學(xué)者將其稱為“分泌體”[11]。

目前已檢測(cè)到BCM的分泌體中含有175種不同的蛋白質(zhì)，其中包括43種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)[8，12]。如骨硬化蛋白（sclerostin，SOST）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-23（fibroblast growth factor-23，F(xiàn)GF-23）、血小板因子-4（platelet factor-4，PF-4）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-5（insulin-like growth factor-bindinc protein-5，IGFBPs-5）、血管生成素（angiogenin，ANG）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、成骨刺激因子-1（osteoblaststimulating factor-1，OSF-1）、半乳糖凝集素-1（galectin-1，Gal-1）等。其中SOST和FGF-23是骨細(xì)胞分泌的特有的生長(zhǎng)因子，BCM的分泌體中檢測(cè)到這兩種生長(zhǎng)因子驗(yàn)證了自體骨具有旁分泌性[2]。血管生成素和VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成[13]；TGF-β1參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡，促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化，在骨重塑中具有核心作用[14]；OSF-1可以促進(jìn)人骨祖細(xì)胞的體外黏附、遷移、擴(kuò)增和分化[12]；Gal-1是一種廣泛表達(dá)的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，具有多向生物學(xué)功能，由成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[12]。以上表明BCM可能對(duì)細(xì)胞遷移、增殖、血管形成及成骨功能具有重要影響。

3.制備過(guò)程中影響B(tài)CM活性的因素

BCM中含有多種生長(zhǎng)因子，但其中生長(zhǎng)因子的活性與含量同制備時(shí)的多種因素有關(guān)。與單獨(dú)使用生理溶液相比，在自體血清與生理溶液1:1混合作為培養(yǎng)基制備的BCM中，檢測(cè)到TGF-β在放入骨屑的10分鐘內(nèi)大量且快速釋放，BMP-2在40分鐘后延遲釋放。除培養(yǎng)基外，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)也會(huì)影響B(tài)CM中生長(zhǎng)因子的活性與含量：短期（10、20或40 min）收集的BCM可顯著增加細(xì)胞的增殖活性和膠原基質(zhì)的產(chǎn)生，長(zhǎng)期（1、3或6天）收集的BCM主要作用于成骨細(xì)胞分化和成熟的后期階段[9，10]。

骨屑的采集和處理方式與BCM的旁分泌功能密切相關(guān)。與骨磨、壓電裝置、取骨鉆相比，由骨刮刀收集的骨屑制備的BCM中VEGF和BMP-2等生長(zhǎng)因子的表達(dá)顯著更高[15，16]，不過(guò)骨刮刀切割刀片的角度對(duì)制備的BCM活性影響不大[17]。骨刮刀收集的骨屑，在能夠保證長(zhǎng)度和較大體積離體骨的同時(shí)，也可保持相對(duì)較高的細(xì)胞活力，這可能是使用骨刮刀制備BCM更佳的原因[18]。經(jīng)低溫冷凍或巴氏殺菌法處理的骨屑對(duì)BCM旁分泌信號(hào)的釋放影響不大，但高壓滅菌會(huì)使BCM旁分泌信號(hào)釋放受損[19]。骨屑經(jīng)120 Gy的輻射后制備的BCM也不影響其旁分泌信號(hào)釋放，且輻射能誘導(dǎo)激活潛在的TGF-β，但會(huì)導(dǎo)致血管生成明顯減少[20]。不同胚胎起源的骨被認(rèn)為具有不同的特性[21]，但研究表明由顱骨、下頜骨和脛骨的骨屑制備的BCM具有相似的性能，都可以增加TGF-β1靶基因白細(xì)胞介素11（interleukin 11，IL11）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4，NOX4）和蛋白糖4（proteoglycan 4，PRG4）的表達(dá)[22]。

二、BCM的特性

1.BCM可調(diào)控細(xì)胞的粘附、增殖及分化

骨祖細(xì)胞聚集、附著、增殖并分化為成熟的成骨細(xì)胞，標(biāo)志著組織成骨。研究表明使用添加小鼠顱骨塊的全骨條件培養(yǎng)液培養(yǎng)顱骨細(xì)胞，染色檢測(cè)顯示成骨標(biāo)志物Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OC）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達(dá)顯著增高，并且發(fā)生細(xì)胞聚集、細(xì)胞增殖[4]。即使將離體骨進(jìn)行脫鈣處理，其提取出的BCM在體外仍可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化[23]。多種研究表明，骨組織、骨細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中含有可能來(lái)自于成熟成骨細(xì)胞產(chǎn)生的促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化的活性因子，骨細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及纖維細(xì)胞這三種不同類型的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)BCM浸泡的DBBM及Bio-gide中都表現(xiàn)出了不同程度增加的粘附、增殖及分化特性[10，24～26]。

2.BCM的活性與TGF-β關(guān)系密切

TGF-β是一種多效性分子，不僅能降低小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells of mice，ST2）的ALP活性，并可抑制小鼠胚胎成纖維細(xì)胞即前脂肪細(xì)胞（3T3-Swiss albino，3T3-L1）成脂分化。使用BCM培養(yǎng)ST2細(xì)胞及3T3-L1細(xì)胞，觀察到ST2的ALP活性及3T3-L1細(xì)胞成脂分化程度降低，經(jīng)Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其成骨及成脂分化需要TGF-β-R1信號(hào)傳導(dǎo)，認(rèn)為BCM具有TGF-β1活性[27]。當(dāng)牙周成纖維細(xì)胞暴露于BCM后，受TGF-β受體I型激酶（activin-like kinase，ALK5）影響，BTB/POZ結(jié)構(gòu)域蛋白11（BTB/POZ Domain Containing 11，BTBD11）、IL11和NOX4的表達(dá)上調(diào)，且向BCM中加入ALK5的抑制劑—BMPI型受體激酶抑制劑（LDN193189）后，觀察到BCM的活性顯著降低，驗(yàn)證了BCM通過(guò)ALK5傳導(dǎo)活性[28]。Zimmermann等人[29]的研究得出了類似的結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)骨源性成纖維細(xì)胞在BCM的刺激下，通過(guò)調(diào)節(jié)腎上腺髓質(zhì)素（adrenomedullin，ADM）、五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）、BTBD11、IL11和NOX4的表達(dá)，激活TGF-β1受體信號(hào)通路的顯著反應(yīng)。骨的形態(tài)和維持是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用的動(dòng)態(tài)平衡，破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)清除壞死的骨碎片，它的出現(xiàn)是骨移植術(shù)中骨再生的第一步，研究表明BCM在體外激活間充質(zhì)細(xì)胞TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成時(shí)下游調(diào)節(jié)因子原癌基因蛋白（c-fos proto oncogene，c-fos）的表達(dá)，增加鼠骨髓培養(yǎng)物中破骨細(xì)胞的生成[30]。這些實(shí)驗(yàn)研究都證實(shí)了BCM的活性與TGF-β密切相關(guān)，為將來(lái)研究BCM的作用機(jī)制提供了方向。

三、BCM聯(lián)合骨替代材料應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)性研究

與間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基類似，不少學(xué)者認(rèn)為將含有骨源性生長(zhǎng)因子的溶液與骨支架類材料聯(lián)合應(yīng)用有良好前景，并對(duì)此做了許多實(shí)驗(yàn)研究。使用單獨(dú)脫蛋白牛骨礦物質(zhì)（deprot-einized bovine bone minerals，DBBM）和涂布BCM的DBBM分別培養(yǎng)小鼠ST2細(xì)胞，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)具有BCM涂層的DBBM顯著促進(jìn)了ST2細(xì)胞的遷移、粘附及礦化程度，并且在接種細(xì)胞3天后觀察到成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的顯著表達(dá)[24]。Parisi等人[10]研究表明與單獨(dú)使用生理溶液林格氏液（ringer's solution，RS）作為培養(yǎng)基相比，使用林格氏液（RS）和自體血清（serum，S）1：1的混合溶液培養(yǎng)骨屑20min時(shí)，在BCM-RS+S組檢測(cè)到對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞ST2、前成骨細(xì)胞MC3T3-E1和原代人骨衍生細(xì)胞的細(xì)胞黏附及誘導(dǎo)增殖能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明在20 min制備的BCM-RS+S顯著增強(qiáng)了ST2間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時(shí)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá)。BCM與膜類材料聯(lián)合應(yīng)用也觀察到類似結(jié)果，膠原膜浸泡于BCM中1分鐘即可吸附來(lái)自BCM的生長(zhǎng)因子，并在4小時(shí)后達(dá)到平臺(tái)期[26]。Fujioka等人[25]在增加BCM預(yù)涂層的Bio-gide上觀察到了ST2細(xì)胞附著數(shù)量增加了4倍以上，5天后ST2細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的mRNA水平顯著提高，14天后Bio-gide的茜紅素染色程度增加5倍，提示ST2細(xì)胞在體外礦化程度增加。這些體外實(shí)驗(yàn)表明骨支架類材料能夠吸附BCM中的生長(zhǎng)因子，并顯著增加體外成骨細(xì)胞的附著、分化和礦化，進(jìn)一步改善骨支架類材料的骨傳導(dǎo)性。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用BCM浸泡的膠原膜修復(fù)小鼠顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)在缺損處形成了不與宿主骨相連的骨島[31]，由于目前對(duì)體內(nèi)BCM成骨機(jī)制研究較少，此現(xiàn)象尚無(wú)合理的解釋，因此這也是我們需要進(jìn)一步研究的方向。

這些實(shí)驗(yàn)表明BCM在臨床診療過(guò)程中具有廣闊的應(yīng)用場(chǎng)景，例如：種植手術(shù)時(shí)在頰側(cè)翻瓣區(qū)收集正常骨組織的皮質(zhì)骨屑，并在種植床預(yù)備期間按1g/2ml的比例將骨屑培養(yǎng)于自體血液和生理溶液的混合液中以制備BCM，收集的骨量按最終制備的BCM能完全浸沒(méi)骨替代材料為準(zhǔn)，盡管會(huì)造成新的創(chuàng)傷，但對(duì)骨外形影響不大，且出血量不多，進(jìn)行骨增量時(shí)將骨替代材料浸入于BCM后再植入骨缺損處，以改善缺損區(qū)成骨效果?；蛘咴陬M骨骨折或頜骨腫物患者術(shù)中，按照上述方式制備BCM，待骨折復(fù)位固定或腫物切除后使用BCM混合其他止血材料浸泡創(chuàng)區(qū)一定時(shí)間，以獲得更好的術(shù)后恢復(fù)效果。

四、總結(jié)與展望

新鮮皮質(zhì)骨屑制備骨條件培養(yǎng)基中含有由大量生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子構(gòu)成的分泌體，在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、分化的積極影響。BCM的優(yōu)勢(shì)在于制備時(shí)間短且誘導(dǎo)成骨能力顯著[10]。但是，目前對(duì)BCM制備方式尚未形成統(tǒng)一意見(jiàn)，關(guān)于BCM誘導(dǎo)成骨機(jī)制的認(rèn)識(shí)也有一定的不足；同時(shí)，在臨床應(yīng)用時(shí)對(duì)于浸潤(rùn)性腫瘤患者是否可以使用BCM聯(lián)合骨替代材料的方式，該如何避免腫瘤細(xì)胞的引入還有待研究，并且大面積骨缺損患者所需骨替代材料也較大，制備BCM時(shí)所需的自體骨量也更多，其應(yīng)用仍存在一定的局限性。我們應(yīng)繼續(xù)積極探索BCM制備過(guò)程中的“最優(yōu)條件”和體內(nèi)成骨機(jī)制，以及不同的骨替代材料被完全浸潤(rùn)時(shí)所需BCM的最小量，從而為BCM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。