陳至威 陳艷霞＊ 秦雷

北京信息科技大學(xué)傳感器北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

0 前言

目前，人們?cè)絹?lái)越重視自身的健康狀況，血液也一直被認(rèn)為是檢測(cè)人體健康的首選分析物。但是，抽血檢查容易受到感染，具有一定的創(chuàng)傷性。相比之下，汗液檢測(cè)是一種非侵入性的分析手段，汗液較容易在表皮上獲取和收集，而且汗液中含有多種與健康評(píng)估和疾病診斷有關(guān)的生物標(biāo)志物[1]，如pH、葡萄糖、乳酸、蛋白質(zhì)、鈣離子、氯離子等。因此，汗液傳感分析作為一種無(wú)創(chuàng)檢測(cè)方式，對(duì)于疾病診斷有著極其重大的意義。

隨著納米材料的引入，基于納米材料的新型生物傳感界面發(fā)展迅速[2]。金屬有機(jī)框架（metal-organic framework，MOF）材料是一類(lèi)新型多孔晶體材料[3]，是由金屬離子/團(tuán)簇和有機(jī)橋接配體配位而成的一維、二維或三維結(jié)構(gòu)。金屬有機(jī)框架具有結(jié)構(gòu)與孔道尺寸可調(diào)控性、多孔性、比表面積大、組成多樣、金屬位點(diǎn)不飽和性等特點(diǎn)[4-5]。近年來(lái)，金屬有機(jī)框架也作為一種新興傳感材料被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境、重金屬、有毒氣體等檢測(cè)[6-11]。郭穎等人[6]利用分子印跡聚合物、石墨烯量子點(diǎn)以及金屬有機(jī)框架制備了一種熒光傳感器，用于檢測(cè)食品中的強(qiáng)力霉素，其檢出限低至0.029 mg/L。劉娜等人[7]利用金屬有機(jī)框架材料摻雜的水凝膠（PAAM-SA/MOF）快速萃取和檢測(cè)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠。韓璐等人[8]利用3種鑭系元素Ce、Tb、Gd合成了金屬有機(jī)框架納米酶，并將其用于多巴胺（DA）的快速、靈敏檢測(cè)，其檢出限為6.47×10-8M。趙吉星等人[9]以Zn/Co-ZIF為前驅(qū)體，制備了雙金屬M(fèi)OF衍生ZnCo多孔碳骨架，并用它來(lái)修飾電極，制備出一種新型的電化學(xué)傳感器，用于水環(huán)境中Hg(Ⅱ)的檢測(cè)，具有較好的靈敏度和較低的檢測(cè)限。DANG W等人[10]制備出AuNPs-NH2/Cu-MOF復(fù)合材料，用其修飾玻碳電極（GCE），用于H2O2的電化學(xué)檢測(cè)。劉金彤等人[11]設(shè)計(jì)了一種多功能的金屬有機(jī)框架發(fā)光探針，用于對(duì)烯啶蟲(chóng)胺的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)0.16 μg/mL。

目前，基于金屬有機(jī)框架材料的熒光生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器等，多借助外用精密設(shè)備，檢測(cè)流程較為復(fù)雜，且其在汗液生物傳感中的應(yīng)用較少。本研究設(shè)計(jì)了一種基于微納米金屬有機(jī)框架的汗液生物傳感界面，用于人體汗液的比色檢測(cè)。這種微納米金屬有機(jī)框架制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，穩(wěn)定性好，可以長(zhǎng)時(shí)間保存。本研究通過(guò)比色法對(duì)汗液中的葡萄糖、pH進(jìn)行檢測(cè)，可以較為直觀地觀察到反應(yīng)過(guò)程中的顏色變化，操作方便，檢測(cè)快速、靈敏。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 試劑與材料

載玻片（25.4 mm×76.2 mm×1 mm，帆船牌）、六水合硝酸鋅（（Zn(NO3)2·6H2O，99%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、三乙胺鹽酸鹽（C6H16ClN，99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、2-甲基咪唑（C4H6N2，98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、乙醇（75%，Sigma-Aldrich公司）、甲苯（C7H8，Sigma-Aldrich公司）、十八烷基三氯硅烷（OTS，95%，Sigma-Aldrich公司）。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mmol/L）、葡萄糖檢測(cè)試劑盒、紫色石蕊指示劑、酸堿溶液（pH為5.0～8.0）均購(gòu)自伊勢(shì)久生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用的水為去離子水、超純水，其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器

數(shù)控超聲波清洗機(jī)（KQ3200DE）、電熱恒溫干燥箱（DHG-9031A）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9075A）、等離子清洗機(jī)（CPC-A）、紫外臭氧清洗機(jī)、光學(xué)接觸角張力測(cè)試儀（LSA-100）、掃描電子顯微鏡（SEM）、智能手機(jī)（Android）。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 微納米金屬有機(jī)框架的制備

將載玻片用超聲波清洗器清洗后，放入40 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，然后將烘干的載玻片放置在玻璃培養(yǎng)皿中，用等離子清洗機(jī)清洗，用乙醇清洗稱(chēng)量瓶，并自然晾干。

稱(chēng)取150 mg六水合硝酸鋅，70 mg三乙胺鹽酸鹽，120 mg二甲基咪唑，將其倒入盛有50 mL超純水的離心管中混勻。將清洗干凈的載玻片放置在稱(chēng)量瓶中，取25 mL配制好的溶液倒入稱(chēng)量瓶中，用封口膜密封好，將其放到80 ℃的恒溫干燥箱中沉積24小時(shí)，制得微納米金屬有機(jī)框架基底。

1.2.2 表面改性

用乙醇將稱(chēng)量瓶清洗干凈，自然晾干，將所制得的微納米金屬有機(jī)框架基底用等離子清洗機(jī)處理5分鐘。

用移液槍分別取10 mL的甲苯與100 μL的十八烷基三氯硅烷，加入稱(chēng)量瓶中混勻；然后將潔凈的載玻片放入稱(chēng)量瓶中，用封口膜密封好，在避光處?kù)o置30分鐘；半小時(shí)后取出載玻片，用無(wú)水乙醇輕輕沖洗，然后放入120 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干10分鐘或自然晾干，以獲得表面改性的樣品；接著，在樣品表面覆蓋上定制的掩模板，置于紫外臭氧清洗機(jī)中圖案化處理10分鐘，得到超浸潤(rùn)微孔傳感界面。

1.2.3 工作液及濃度梯度溶液配制

配制葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶（GOD-POD）工作液；另外，利用雙蒸水（ddH2O）配制濃度梯度為 0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、 5 mmol/L的葡萄糖梯度溶液，備用。

1.2.4 功能化底物修飾

用移液槍取1 μL GOD-POD工作液滴加在微孔中進(jìn)行功能化修飾，待溶劑揮發(fā)后（室溫下自然靜置10分鐘），用于檢測(cè)葡萄糖的活性成分會(huì)負(fù)載到微孔中，以獲得用于檢測(cè)汗液中葡萄糖的檢測(cè)區(qū)域。

用移液槍取1 μL紫色石蕊指示劑滴加在微孔中進(jìn)行功能化修飾，待溶劑揮發(fā)后（室溫下自然靜置10分鐘），用于檢測(cè)pH的活性成分會(huì)負(fù)載到微孔中，以獲得用于檢測(cè)汗液pH的檢測(cè)區(qū)域。

1.2.5 檢測(cè)

用移液槍取1 μL待測(cè)液滴加在功能化修飾過(guò)的微孔檢測(cè)區(qū)，觀察顏色反應(yīng)變化。

1.3 表征

1.3.1 樣品表征

樣品的表面微觀形貌采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征，樣品的接觸角采用LSA-100光學(xué)接觸角張力測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)量。

1.3.2 傳感器比色表征

用手機(jī)拍攝相同反應(yīng)時(shí)間的不同濃度葡萄糖及不同pH值的比色圖像，并用分析軟件將其數(shù)值化為RGB信號(hào)的變化趨勢(shì)，作出檢測(cè)柱狀圖。

RGB，指的是常用的RGB模型，它以R（Red，紅）、G（Green，綠）、B（Blue，藍(lán)）3個(gè)通道為基礎(chǔ)，且這3個(gè)組分的值的范圍均為0到255。當(dāng)這3種基本色以不同比例進(jìn)行混合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的顏色。這意味著，在一般情況下，每種顏色均可由其對(duì)應(yīng)的RGB值進(jìn)行數(shù)值化表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品表征

圖1為微納米金屬有機(jī)框架在掃描電子顯微鏡下的表面微觀形貌圖像。從圖中可以看出，金屬有機(jī)框架呈大小均勻的米粒狀，參差不齊，相互交疊，孔隙較多，具有較高的粗糙度及較大的比表面積，有利于待測(cè)物的牢固吸附與富集，可以提高檢測(cè)靈敏度。

圖2（a）為制備出的微納米金屬有機(jī)框架在光學(xué)接觸角張力測(cè)試儀下的圖像，當(dāng)2 μL的液滴觸碰到微納米界面后會(huì)完全鋪展，接觸角接近于0°，呈超親水性；圖2（b）為微納米金屬有機(jī)框架經(jīng)表面改性后在光學(xué)接觸角張力測(cè)試儀下的圖像，接觸角為154.3±3.0°，呈超疏水性，因此，通過(guò)圖案化處理形成的超疏水-超親水傳感界面能夠使待測(cè)液滴完全限制在超親水區(qū)域內(nèi)；圖2（c）為2 μL不同濃度的紫色染料滴加到圖案化傳感界面的實(shí)物圖，從圖中可以看出，由于浸潤(rùn)性差異，液滴完全位于超親水微孔中且沒(méi)有溢出，液滴之間不會(huì)互相干擾，這使得待測(cè)液滴能夠富集在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)，有利于后續(xù)樣本的分析檢測(cè)。

2.2 檢測(cè)性能

2.2.1 葡萄糖檢測(cè)

葡萄糖氧化酶能夠催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，繼而產(chǎn)生紅棕色絡(luò)合物。圖3是葡萄糖溶液在濃度梯度為0 mmol/L、1.25 mmol/L、2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L的檢測(cè)柱狀圖，從圖中可以看出，隨著葡萄糖溶液濃度的增加，其對(duì)應(yīng)的R、G、B值有著明顯的變化趨勢(shì)，都隨著葡萄糖溶液濃度的增加而顯著降低。

2.2.2 pH檢測(cè)

紫色石蕊試劑是一種常用的酸堿指示劑，遇酸變紅，遇堿變藍(lán)。圖4是pH為6、6.5、7、7.5、8的檢測(cè)柱狀圖，從圖中可以看出，隨著pH值的變大，溶液由酸性變?yōu)閴A性，其對(duì)應(yīng)的R值逐漸減小，G、B值的整體趨勢(shì)呈先增大后減小。

2.3 人體汗液檢測(cè)

收集志愿者有氧運(yùn)動(dòng)半小時(shí)后的汗液，取1 μL滴加在基于微納米金屬有機(jī)框架的功能化微孔中，進(jìn)行實(shí)際人體汗液的葡萄糖與pH檢測(cè)，分別進(jìn)行6組檢測(cè)。

圖5（a）是實(shí)際汗液的葡萄糖檢測(cè)柱狀圖，與圖3進(jìn)行比對(duì)，可以得出，該志愿者的汗液中幾乎沒(méi)有葡萄糖，健康狀況良好。

由于出汗率的差異，人體汗液的pH值正常范圍一般為4.2～7.5。圖5（b）是實(shí)際汗液的pH檢測(cè)柱狀圖，與圖4進(jìn)行比對(duì)，可以得出，該志愿者的汗液pH值在6.5～7之間。

上述檢測(cè)結(jié)果可以得出，本研究的基于微納米金屬有機(jī)框架的生物傳感界面可實(shí)現(xiàn)人體汗液的高靈敏、可靠檢測(cè)，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究制備了微納米金屬有機(jī)框架，對(duì)其進(jìn)行表面改性、圖案化處理以及功能化修飾，設(shè)計(jì)出了一種制備簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性好的汗液生物傳感界面。這種基于微納米金屬有機(jī)框架的汗液生物傳感界面實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、pH的準(zhǔn)確比色分析，可用于實(shí)際人體汗液檢測(cè)。本研究的基于微納米金屬有機(jī)框架的汗液生物傳感界面，在多組分生物傳感和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用前景。