余錦欣，吳學(xué)成，白 雪，蔣詠梅，章文賢

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350007；2.福建飛紅酒業(yè)有限公司， 福建 三明 366105)

蛋白肽通常是指蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解釋放出來的小分子量肽[1-2]，除了易被機體消化吸收外，還具有降血壓、抗菌、抗氧化、免疫活性調(diào)節(jié)等多種生物活性[3]，在營養(yǎng)保健品、功能性產(chǎn)品等領(lǐng)域有良好的發(fā)展前景。其制備方法主要有酸堿水解法、酶解法和微生物發(fā)酵法3種[4]。酸堿水解法氨基酸破壞嚴(yán)重，酶解法工藝復(fù)雜，比較而言，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的蛋白肽分子量更小、活性更高，成本也相對低廉。

芝麻粕是芝麻榨油后主要的農(nóng)副產(chǎn)物，含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白(38%～50%)[5]，是蛋白肽的良好來源。研究者利用米曲霉[6]、枯草芽孢桿菌[7]等菌種發(fā)酵芝麻粕生產(chǎn)蛋白肽，袁艷超等[8]將植物乳桿菌和解淀粉芽孢桿菌兩種菌混合發(fā)酵芝麻粕，有效地提高了發(fā)酵液中的肽含量。目前微生物發(fā)酵法產(chǎn)芝麻粕蛋白肽多通過液體發(fā)酵方式，固態(tài)發(fā)酵的相關(guān)研究較少，尚未發(fā)現(xiàn)利用紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽的相關(guān)報道。

本研究利用紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽，加入糖類碳源物質(zhì)彌補培養(yǎng)基碳源的不足，以肽得率為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗對固態(tài)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為實現(xiàn)芝麻粕蛋白資源的高值化利用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.2主要儀器 SHP-150生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，恒溫振蕩器(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，UV-1100紫外分光光度計(上海美普達(dá)儀器有限公司)，TG16-WSD臺式高速離心機(湖南湘儀儀器有限公司)。

1.1.3主要材料和試劑 芝麻粕，市售；結(jié)晶牛血清蛋白，購于阿拉丁試劑有限公司；三氯乙酸、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碘化鉀，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1斜面培養(yǎng)基 PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，七水硫酸鎂1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，維生素B10.05 g，去離子水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2.2種子培養(yǎng)基 葡萄糖35 g，蛋白胨5 g，酵母精粉2.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.1 g，維生素B10.05 g，去離子水1 L，121℃滅菌20 min。

1.2.3固態(tài)培養(yǎng)基 使用高速粉碎機將芝麻粕磨成粉末后過20目篩。在250 mL錐形瓶中裝入芝麻粕粉末10 g，含水量為60%。后續(xù)根據(jù)需要稱量一定質(zhì)量比的糖類，充分溶解于去離子水中，倒入芝麻粕固態(tài)培養(yǎng)基中混合均勻，封口膜包扎，于121℃高壓滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1固態(tài)發(fā)酵方法 接種環(huán)挑取菌絲孢子在PDA斜面培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)7 d待菌絲長滿斜面。取10 mL無菌水加入斜面，刮取孢子制成孢子懸液，轉(zhuǎn)移至種子培養(yǎng)基(40 mL)，恒溫振蕩(30℃、120 r·min-1)培養(yǎng)2 d，倒入裝有玻璃珠的無菌錐形瓶振蕩打碎制得種子液。吸取2 mL種子液，均勻接種至已滅菌的芝麻粕固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，31℃恒溫培養(yǎng)6 d。

1.3.2單因素試驗 以未加入碳源、未接種的芝麻粕培養(yǎng)基為初始培養(yǎng)基條件，以發(fā)酵時間6 d、含水量60%、溫度31℃為初始發(fā)酵條件，所有試驗均設(shè)置3次平行。(1)紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。將未接種與接種的芝麻粕培養(yǎng)基置于同等條件下恒溫培養(yǎng)，以未接種的芝麻粕培養(yǎng)基為空白對照組，以肽得率為指標(biāo)，考察紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽的能力。(2)碳源類型對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。以接種未添加碳源的芝麻粕培養(yǎng)基為對照組，分別添加質(zhì)量比為10%的糖類碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖)，考察不同碳源類型對肽得率的影響。(3)碳源比例對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。確定最優(yōu)碳源類型后，分別向芝麻粕固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)中加入不同比例(5%、10%、15%、20%、25%)葡萄糖，考察不同碳源比例對肽得率的影響。(4)發(fā)酵時間對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。確定最優(yōu)碳源比例后，考察發(fā)酵時間(0、2、4、6、8 d)對肽得率的影響。(5)含水量對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。確定發(fā)酵時間后，在添加碳源的芝麻粕培養(yǎng)基中分別以一定比例(30%、40%、50%、60%、70%)加入去離子水，考察含水量對肽得率的影響。(6)溫度對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響。在確定最優(yōu)含水量后，考察溫度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃)對肽得率的影響。

1.3.3正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過SPSS軟件設(shè)計三因素三水平的正交試驗，研究發(fā)酵時間、含水量、溫度對肽得率的影響，得出最優(yōu)組合，進(jìn)行驗證，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。正交試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4蛋白肽的測定 固態(tài)發(fā)酵物于50℃烘48 h，磨成細(xì)粉，過60目篩。按照料液比1∶10加入發(fā)酵物粉末和蒸餾水，于160 r·min-1中振蕩2 h，充分溶解其中的蛋白肽。之后于10 000 r·min-1離心15 min，收集上清液并定容。上清液用0.22 μm濾膜過濾除去菌體碎片和不溶性雜質(zhì)，備用。

總之，當(dāng)代計算機科學(xué)和形式化數(shù)學(xué)的發(fā)展開創(chuàng)了經(jīng)典計算主義的時代，計算認(rèn)知的思想日益深入人心，它順應(yīng)了當(dāng)代科學(xué)研究活動，特別是計算機科學(xué)、信息科學(xué)、人工智能以及應(yīng)用互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展，它是新技術(shù)革命背景下誕生的新的哲學(xué)思維，無論是從理論的角度，還是從實際應(yīng)用的角度，都具有重要的意義和價值。但是，在認(rèn)知、計算等問題上始終存在著激烈的爭議，也暴露了經(jīng)典計算認(rèn)知觀念的局限，對那些爭論問題的否定回答，將經(jīng)典計算主義推向了風(fēng)口浪尖，經(jīng)典計算主義陷入了危機之中。

肽得率的測定：參考Ma等[9]的方法稍做調(diào)整，采用雙縮脲試劑和比色法測定發(fā)酵物上清液中蛋白肽濃度，計算肽得率。取1 mL濾液，加入等體積10%的三氯乙酸(TCA)溶液，靜置30 min后，于8 000 r·min-1離心15 min以去除大分子量蛋白和酸不溶性物質(zhì)。再取1 mL上清液，加入4 mL雙縮脲試劑進(jìn)行反應(yīng)，靜置30 min，測定OD540，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算溶液中肽濃度，換算得到發(fā)酵物中的蛋白肽總質(zhì)量。肽得率為發(fā)酵物中蛋白肽總質(zhì)量與培養(yǎng)基的質(zhì)量比。

雙縮脲試劑的配制：1.5 g硫酸銅和6.0 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL蒸餾水中，攪拌加入300 mL的10%NaOH溶液，用蒸餾水定容至1 000 mL。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：參考何勇錦等[10]用結(jié)晶牛血清蛋白(BSA)配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，用雙縮脲試劑和比色法測定OD540，以BSA溶液濃度(x)為自變量，以吸光度(y)為因變量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.046x+0.0027。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖1可知，紫紅曲霉發(fā)酵物中肽得率為7.34%，與未接種芝麻粕對照組相比，提高了69%，說明紫紅曲霉具有豐富的蛋白酶體系，能夠?qū)庵ヂ槠膳囵B(yǎng)基中的蛋白水解為小分子量的肽，可適用于固態(tài)發(fā)酵芝麻粕生產(chǎn)蛋白肽。

2.2 碳源類型對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖2可知，在沒有添加碳源的條件下，肽得率偏低，發(fā)酵物中的蛋白肽較少。這可能是因為脫脂芝麻粕中蛋白質(zhì)含量很高，氮源豐富，但其中含碳物質(zhì)的量不足[5]，影響紫紅曲霉的生長，導(dǎo)致肽得率不高。分別添加10%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖后，肽得率均有提高，說明加入碳源均有利于芝麻蛋白肽的合成。各碳源對肽得率的促進(jìn)作用依次為葡萄糖>果糖>淀粉>蔗糖>乳糖，其中葡萄糖對肽得率的影響最大，達(dá)到12.70%，與未添加碳源的芝麻粕發(fā)酵物相比提高了73%，這可能是因為在發(fā)酵初期，葡萄糖作為結(jié)構(gòu)最簡單的物質(zhì)，可直接進(jìn)入糖酵解途徑，利于菌體的吸收利用。

圖1 紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.1 Effect on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

圖2 不同碳源類型對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.3 葡萄糖添加量對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基葡萄糖添加量為10%時，肽得率最高，可達(dá)12.93%；低于或高于10%添加量，肽得率都有所降低。這可能是因為低濃度糖類容易被紫紅曲霉吸收，從而促進(jìn)菌體生長，分泌更多的蛋白酶將基質(zhì)中的蛋白水解成肽；當(dāng)糖類濃度過高時，基質(zhì)黏度增大溶氧不足，影響菌絲在培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)部的擴散，從而影響最終的肽得率。

圖3 不同葡萄糖添加量對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.3 Effect of different glucose addition on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.4 發(fā)酵時間對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，肽得率持續(xù)升高，直到第6 d達(dá)到峰值12.96%，然后趨于平緩，第8 d肽得率稍有降低，說明發(fā)酵前中期可能是酶促反應(yīng)最快速的時期，發(fā)酵物中蛋白肽不斷生成和積累，而由于氮源逐漸被消耗，在發(fā)酵后期這些蛋白肽可能會進(jìn)入代謝循環(huán)，導(dǎo)致肽得率降低。因此，選擇發(fā)酵時間6 d進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖4 發(fā)酵時間對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.5 含水量對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為50%時，肽得率最高可達(dá)14.49%。當(dāng)含水量較低時，肽得率偏低，原因可能是菌絲生長和酶解反應(yīng)均需要水分，而低含水量不利于菌絲生長和代謝；高含水量使得培養(yǎng)基過于濕潤，影響基質(zhì)間透氣，不利于菌絲在基質(zhì)內(nèi)部擴散，導(dǎo)致部分基質(zhì)未能被充分利用，從而影響蛋白肽的生成。因此，選擇50%含水量進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖5 含水量對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.5 Effect of water content on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.6 溫度對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響

由圖6可知，在溫度為25℃時，肽得率最低；在溫度為31℃時，肽得率最高可達(dá)14.52%。這可能是因為較低的溫度不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，從而影響蛋白肽的生成；而在一定范圍內(nèi)較高的溫度對基質(zhì)中蛋白的酶解反應(yīng)有促進(jìn)作用，此時酶系活躍[11]，各種成分代謝旺盛。因此，選擇31℃為進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖6 溫度對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響Fig.6 Effect of temperature on the yield of protein peptide from sesame meal fermented by Monascus purpureus

2.7 正交試驗結(jié)果

由表2可知，以肽得率為考察指標(biāo)，從發(fā)酵時間(A)、含水量(B)、溫度(C)3個因素中確定最佳發(fā)酵工藝條件。極差分析可知，3個因素對肽得率的影響強度順序依次為B(含水量)>A(培養(yǎng)時間)>C(溫度)。優(yōu)化后的最佳組合方案為A2B2C2，即發(fā)酵時間6 d、含水量50%，溫度31℃。以正交試驗結(jié)果所得到的最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行驗證試驗，最終測定肽得率為14.95%，高于正交試驗表格中的結(jié)果，可確定該組合是最佳試驗方案。

表2 正交試驗結(jié)果分析

3 討論與結(jié)論

本研究以芝麻粕為發(fā)酵原料，采用紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽。采用單因素試驗分別考察了碳源種類、碳源比例、發(fā)酵時間、含水量、溫度對紫紅曲霉發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率的影響，通過正交試驗確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。結(jié)果表明，碳源的加入能促進(jìn)芝麻粕蛋白水解，其中葡萄糖的效果最為明顯，葡萄糖添加量為10%時，肽得率最高達(dá)到12.93%，說明葡萄糖是最容易被菌絲吸收利用的營養(yǎng)碳源。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定發(fā)酵時間6 d、含水量50%、溫度31℃是最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，經(jīng)驗證后肽得率最高可達(dá)14.95%，是未接種芝麻粕基質(zhì)的2.44倍，該結(jié)果高于米曲霉液體發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽得率[5]，說明采用紫紅曲霉固態(tài)發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)蛋白肽的方法可行，可以為芝麻粕蛋白的高值化利用提供數(shù)據(jù)參考。