王榮慧，白 云，王海青

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西省婦幼保健院/山西省兒童醫(yī)院，山西 太原 030001)

早發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI)是指女性40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)或頻發(fā))，血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的濃度升高及雌二醇(estradiol，E2)水平波動(dòng)性下降，并伴隨月經(jīng)稀發(fā)及閉經(jīng)癥狀[1]。POI在一般人群發(fā)病率為1%～5%[2]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，女性社會(huì)精神壓力增大、生育時(shí)間推后及環(huán)境等因素的綜合影響，POI的發(fā)病率呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)且主要集中于高知識(shí)群體[3]。POI患者病情繼續(xù)進(jìn)展，即發(fā)展為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，POF是其終末階段。目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，可造成患者全身多系統(tǒng)疾病。因此，POI及POF的研究受到越來(lái)越多的臨床關(guān)注。程序性死亡受體1(programmed-death-1，PD-1)表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面，是免疫抑制分子之一，當(dāng)T淋巴細(xì)胞增殖、活化后，細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量增加，并產(chǎn)生負(fù)向刺激信號(hào)，使得T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，功能受到抑制。本文對(duì)POI患者外周血雌二醇(E2)水平與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)量變化及PD-1表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行研究，探討雌激素水平變化與T淋巴細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性。

1研究對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2019年12月至2021年1月就診于山西省婦幼保健院門診的POI患者20例為研究組，選取同期孕前健康體檢婦女30例為對(duì)照組，所有研究對(duì)象的年齡為28～40歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組婦女為月經(jīng)周期規(guī)律、無(wú)高雄激素血癥的臨床表現(xiàn)及多囊卵巢樣改變、無(wú)自身免疫性疾病及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史，血清FSH/LH和催乳素(prolactin，PRL)檢查無(wú)異常，超聲檢測(cè)有正常排卵的育齡期女性；研究組患者為自然月經(jīng)周期狀態(tài)下，停經(jīng)6個(gè)月或3個(gè)周期以上，F(xiàn)SH>25IU/L至少2次，間隔>4周，超聲檢查雙側(cè)卵巢體積小，雙側(cè)卵巢無(wú)10mm以上卵泡。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肝腎疾病，無(wú)免疫系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，無(wú)惡性腫瘤及放化療病史，無(wú)婦科及卵巢手術(shù)史，近3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)激素類藥物，2周內(nèi)無(wú)感染性疾病病史。所有研究對(duì)象均知情同意，自愿完成本研究。

1.2臨床資料的收集

收集資料包括：研究對(duì)象的年齡、基礎(chǔ)疾病、婦產(chǎn)科病史、腫瘤病史、手術(shù)史、放化療病史及藥物使用情況。

1.3方法

1.3.1主要試劑

FITC-anti-human CD4熒光素標(biāo)記單抗、PE-anti-human CD8熒光素標(biāo)記單抗、PerCP/Cyanine5.5-anti-human PD-1熒光素標(biāo)記單抗、PE/Cyanine5.5-anti-human CD45熒光素標(biāo)記單抗(單克隆抗體均購(gòu)自Biolegend公司)、溶血?jiǎng)约に丶凹谞钕俟δ茉噭┖小?/p>

1.3.2主要儀器

流式細(xì)胞儀貝克曼FC500型、Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、CentaurXP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

1.3.3外周血樣本的采集和制備

外周血樣本采集時(shí)，于清晨8時(shí)抽取空腹靜脈血2管，各3mL，用EDTA抗凝。所有研究對(duì)象均需空腹8h以上，對(duì)照組于月經(jīng)周期第3天采靜脈血，研究組可隨時(shí)采靜脈血。抽血后立即進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本取50μL全血，加入CD4/CD8/PD-1/CD45，單抗均加入20μL，混勻后避光孵育15min，加入500μL溶血?jiǎng)?，振蕩混勻，室溫避光孵?5min，加入1mL生理鹽水振蕩混勻，以1 500r/min離心5min，棄上清，加入PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定。性激素的檢測(cè)采用Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國(guó)羅氏診斷有限公司)，使用上海羅氏診斷有限公司提供的試劑。甲狀腺功能的檢測(cè)采用CentaurXP全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)西門子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司)，使用美國(guó)西門子醫(yī)學(xué)診斷股份有限公司提供的試劑。血清抗繆勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)水平檢測(cè)由太原金域臨床檢驗(yàn)所輔助完成。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)情況

對(duì)照組的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比與研究組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組的CD4+/CD8+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組的CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群及PD-1檢測(cè)結(jié)果的比較Table 1 Comparison of T lymphocyte subsets and PD-1 in the peripheral blood of the women between the POI group and the control

注：A正常女性CD4+T細(xì)胞百分比；B正常女性CD8+T細(xì)胞百分比；C正常女性CD4+PD-1+T細(xì)胞百分比；D正常女性CD8+PD-1+T細(xì)胞百分比；E為POI組CD4+T細(xì)胞百分比；F為POI組CD8+T細(xì)胞百分比；G正常女性CD4+PD-1+T細(xì)胞百分比；H正常女性CD8+PD-1+T細(xì)胞百分比。

2.2 POI患者外周血CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞百分比及其PD-1表達(dá)量與E2水平等的相關(guān)性

POI患者血清E2水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.530，P=0.001)，與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比無(wú)相關(guān)性(r=-0.131，P=0.363)；血清E2水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.415，P=0.003；r=0.437，P=0.000)；血清E2水平與AMH水平呈正相關(guān)(r=0.589，P<0.001)。

POI患者血清AMH水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.504，P=0.004)，與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.430，P=0.002)；血清AMH水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達(dá)量均呈正相關(guān)(r=0.415，P=0.003；r=0.649，P<0.001)。

POI患者血清促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.400，P=0.004)，與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)(r=0.467，P=0.001)；血清TSH水平與CD4+PD-1+和CD8+PD-1+表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.340，P=0.016；r=-0.352，P=0.012)；血清TSH水平與AMH水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.484，P<0.05)。

3討論

POI是育齡期女性中較常見(jiàn)的生殖障礙性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大多無(wú)明確的病因。有研究表明，細(xì)胞免疫異常是POI發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制之一[4]。另有研究顯示，女性進(jìn)入絕經(jīng)狀態(tài)后予以雌激素替代治療，可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群免疫平衡，改善免疫功能[5]。但目前有關(guān)POI患者T淋巴細(xì)胞亞群變化的研究較少，且結(jié)論各異，尚不能準(zhǔn)確描述T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量在POI患者中的變化及作用。近年來(lái)國(guó)家調(diào)整了生育政策，保存女性生育能力日趨重要，而對(duì)POI患者進(jìn)行行之有效的干預(yù)刻不容緩。

3.1 POI患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

秦姍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，POF患者CD4+T淋巴細(xì)胞含量下降，CD8+T淋巴細(xì)胞含量上升，CD4+/CD8+T降低。但Tuohy等[7]在POF患者與自身免疫的相關(guān)研究中表明，POF患者外周血中，CD4+/CD8+T明顯升高。本研究顯示，與正常女性相比，研究組POI患者外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群百分比下降，CD8+T淋巴細(xì)胞亞群百分比升高；但CD4+/CD8+變化無(wú)明顯差異，考慮可能與樣本量不足有關(guān)。

PD-1表達(dá)于T淋巴細(xì)胞表面，是免疫抑制分子之一，T淋巴細(xì)胞增殖后，PD-1表達(dá)量增加，并產(chǎn)生負(fù)向刺激信號(hào)，使T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，功能受到抑制。PD-1與其配體可參與自身免疫性疾病及腫瘤等多種疾病的病理進(jìn)程。T淋巴細(xì)胞表面PD-1分子與其配體PD-L1結(jié)合后對(duì)T淋巴細(xì)胞功能產(chǎn)生負(fù)向作用，其增殖、活化能力明顯降低[8]。在慢性乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染中，PD-1/PD-L1發(fā)揮著很重要的作用，在肝炎活動(dòng)期PD-1表達(dá)量上調(diào)，在恢復(fù)期下調(diào)[9]，其表明PD-1的過(guò)度上調(diào)與T淋巴細(xì)胞衰竭和持續(xù)性病毒感染有關(guān)。近年來(lái)的研究集中于以PD-1為靶點(diǎn)，使用PD-1/PD-L1抑制劑對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療，阻斷PD-1信號(hào)通路來(lái)治療各種腫瘤[10]，PD-1在細(xì)胞免疫功能紊亂的過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。本研究顯示，POI患者外周血T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量降低，考慮其細(xì)胞免疫功能紊亂與PD-1表達(dá)異常存在一定的聯(lián)系。

3.2 E2與外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化及PD-1表達(dá)的相關(guān)性

雌激素水平在免疫功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著舉足輕重的作用，女性相較于男性，其自身免疫性疾病發(fā)病率及自身免疫抗體檢出率均增高。Oktem等[11]關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的研究表明，雌激素在免疫細(xì)胞上存在同源受體ER-α和ER-β，E2可以通過(guò)同源受體調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的免疫功能。邵明君等[12]的研究中通過(guò)切除小鼠卵巢后建立絕經(jīng)模型，檢測(cè)其淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，小鼠的E2水平與CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化存在相關(guān)關(guān)系，E2水平下降直接導(dǎo)致了T淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量降低。Polanczyk等[13]在人工絕經(jīng)的小鼠模型中進(jìn)行了有關(guān)E2與PD-1的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)PD-1受體的表達(dá)與雌激素水平存在劑量依賴關(guān)系，增加小鼠體內(nèi)E2水平，可導(dǎo)致外周血CD4+PD-1+表達(dá)量升高。Raimondi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，E2可增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory cells，Treg)PD-1的表達(dá)，激活Treg抑制功能。

本研究顯示，POI患者血清E2水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比呈正相關(guān)，與CD8+T淋巴細(xì)胞百分比無(wú)相關(guān)性，與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量均呈正相關(guān)，這說(shuō)明POI患者體內(nèi)E2水平降低可能導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞表面PD-1表達(dá)量及CD4+T淋巴細(xì)胞百分比均下降。POI患者E2水平降低后，通過(guò)CD8+T淋巴細(xì)胞表面E2受體發(fā)揮免疫作用，導(dǎo)致CD8+PD-1+表達(dá)量下降，PD-1對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞的抑制作用減弱，直接導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞百分比上升；而CD4+T淋巴細(xì)胞百分比上升可能與Treg對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖的抑制有關(guān)。POI疾病進(jìn)展早期，E2水平因FSH升高維持于高水平階段，同時(shí)增強(qiáng)Treg表面PD-1的表達(dá)[15]，Treg凋亡增加，削弱了Treg對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞百分比上升，但隨著卵巢功能進(jìn)一步衰退，E2水平降低，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量下降。

3.3 TSH和AMH與外周血T淋巴細(xì)胞百分比及PD-1的相關(guān)性

在甲狀腺疾病相關(guān)研究中，有學(xué)者分析了951例POF患者的臨床資料，對(duì)其臨床特征和發(fā)病危險(xiǎn)因素及合并癥進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)此類患者極易合并存在自身免疫性疾病史，其中以自身免疫性甲狀腺炎最常見(jiàn)[16]。橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)是一種特異性自身免疫性疾病，發(fā)病過(guò)程中CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，促進(jìn)甲狀腺抗體的產(chǎn)生，破壞甲狀腺腺泡，引起甲狀腺激素水平下降。由此可見(jiàn)，免疫系統(tǒng)紊亂極大地影響了甲狀腺功能。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HT發(fā)病機(jī)制與CD4+T淋巴細(xì)胞各亞群穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。本研究顯示，POI患者血清TSH水平與CD4+T淋巴細(xì)胞百分比、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比均具有相關(guān)關(guān)系，可考慮POI患者體內(nèi)雌激素水平下降之后，T淋巴細(xì)胞亞群受雌激素水平的影響，引發(fā)CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能紊亂，影響了甲狀腺功能，導(dǎo)致TSH水平上升。

綜上所述，POI發(fā)病過(guò)程中，免疫功能與神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系，隨著生殖醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，將為其發(fā)病機(jī)理的研究開(kāi)辟新的途徑。本研究探討POI患者外周血E2水平與CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及PD-1表達(dá)量變化的關(guān)系，有助于指導(dǎo)臨床診療工作，重視E2與免疫功能的相關(guān)性，盡早對(duì)POI患者進(jìn)行雌激素補(bǔ)充治療。