楊雯迪，李亞軍

(清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，北京 100016)

卵巢癌作為臨床常見的女性生殖系統(tǒng)腫瘤，早期癥狀隱匿，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀時，大多已是晚期，故而卵巢癌的存活時間較發(fā)病率相對更高的宮頸癌和子宮體癌更短，其死亡率在婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中居首位[1-2]。卵巢癌與遺傳、激素等有著密切的關(guān)系，同時任何年齡段的女性均有患上卵巢癌的可能性[3]。已有研究顯示，miRNA通過與下游相關(guān)靶基因相互作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵調(diào)控功能[4]。miR-203a-3p是近年來研究較多的一種miRNA，在調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)特征中起著重要的作用。Zhen等[5]研究表明，miR-203a-3p過表達(dá)可以通過調(diào)控AKT信號通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖。Liu等[6]研究表明，miR-203a-3p可以通過AKT/GSK-3β信號通路抑制卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征。張海生[7]研究表明，miR-203a-3p可以通過抑制KCNE2表達(dá)靶向調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能。但關(guān)于miR-203a-3p對卵巢癌增殖、侵襲和遷移的影響，相關(guān)研究較少且觀點不完全統(tǒng)一。本文旨在通過體外實驗探究miR-203a-3p靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，以期尋找新的抗卵巢癌治療靶點。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源

收集2019年2月至10月在清華大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的20例卵巢癌患者手術(shù)切除的癌組織及對應(yīng)癌旁組織(已經(jīng)過倫理審查)，將手術(shù)切除的組織標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定、梯度乙醇脫水后制作石蠟包塊并切片。

1.2細(xì)胞及主要試劑

SKOV3細(xì)胞株(湖南豐暉生物科技有限公司)；miR-203a-3p mimic(Invitrogen公司)，VEGF-C、PCNA抗體(Abcam公司)；TRAIL(英國Pepro Tech公司)；E-cadherin、Vimentin、N-cadherin抗體(碧云天公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；顯微鏡(Olympus公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(武漢普諾塞生物生命科技有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Forma公司)。

1.3方法

1.3.1分組及轉(zhuǎn)染

SKOV3細(xì)胞于配好的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗設(shè)Control組、miR-203a-3p組、pc-VEGF-C組和miR-203a-3p+pc-VEGF-C組。Control組使用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；miR-203a-3p組轉(zhuǎn)染miR-203a-3p mimic；pc-VEGF-C組使用VEGF-C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；miR-203a-3p+pc-VEGF-C組使用miR-203a-3p mimic和VEGF-C重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行操作。

1.3.2熒光素酶報告基因驗證靶基因

TargetScanHuman預(yù)測miR-203a-3p與VEGF-C結(jié)合位點，將含有VEGF-C結(jié)合位點的miR-203a-3p 3′-UTR片段及其突變體插入到pLV-EGFP(2A)Puro載體熒光素酶報告基因的下游，分別命名為VEGF-C wt和VEGF-C mut，與miR-203a-3p mimics共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)48h后，以雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性變化。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

二喹啉甲酸(BCA)法對提取的蛋白樣品進(jìn)行定量后，取適量經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2h，以GAPDH為內(nèi)參，分別加入兔抗大鼠VEGF-C、PCNA、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、GAPDH一抗(1∶500)，4℃過夜后以TBST洗膜，加入二抗(1∶1 000)常溫反應(yīng)2h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯色，Image J分析計算目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

1.3.4實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后PCR儀擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算目的RNA相對表達(dá)量。

GAPDH：上游引物為5′-CTCAGACACCATGGGGAGGTGA-3′，下游引物為5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3′。

VEGF-C：上游引物為5′-GAGGAGCATTACGGTCTGTG-3′，下游引物為5′-TCCCCTTAGCTGACAATTGT-3′。

miR-203a-3p：上游引物為5′-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3′，下游引物為5′-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3′。

1.3.5克隆形成實驗

取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后配成單細(xì)胞懸液，以500個/孔接種于6孔板，每間隔3d更換新鮮培養(yǎng)基，待培養(yǎng)2w后肉眼可見克隆形成，終止培養(yǎng)、依次使用中性甲醇固定、結(jié)晶紫染色后拍照。

1.3.6 Transwell實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞常規(guī)消化后，以無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，取200μL細(xì)胞懸液加入鋪好Matrigel基質(zhì)膠的上室，24孔板下室內(nèi)加入500μL含10%FBS的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后，用結(jié)晶紫對侵至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色并計數(shù)。

1.3.7劃痕實驗

取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后配成單細(xì)胞懸液，并接種在6孔板中(5×105個/孔)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿單層，使用200μL移液槍頭于培養(yǎng)孔內(nèi)劃一直線，PBS洗滌后更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，顯微鏡觀察0、24h劃痕寬度并拍照。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q法；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-203a-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)

與正常癌旁組織中miR-203a-3p表達(dá)(0.99±0.09)比較，卵巢癌組織中miR-203a-3p表達(dá)(0.47±0.10)顯著下調(diào)(t=17.112，P<0.05)，見圖1。

注：*與正常癌旁組織比較P<0.05。圖1 miR-203a-3p在卵巢癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of miR-203a-3p in ovarian cancer tissues

2.2 miR-203a-3p與VEGF-C靶向的關(guān)系

miR-203a-3p與VEGF-C存在可結(jié)合的位點，相比Control組，miR-203a-3p組VEGF-C蛋白相對表達(dá)水平、熒光素酶活性顯著降低(q值分別為12.430、5.047，P<0.05)，pc-VEGF-C組VEGF-C蛋白相對表達(dá)水平上調(diào)(q=10.146，P<0.05)，熒光素酶活性無顯著變化(q=0.131，P>0.05)；相比pc-VEGF-C組，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組VEGF-C蛋白相對表達(dá)水平顯著降低(q=6.710，P<0.05)，提示miR-203a-3p與VEGF-C存在靶向結(jié)合關(guān)系，見圖2、表1。

注：A為miR-203a-3p與靶細(xì)胞結(jié)合位點；B為VEGF-C表達(dá)情況。

表1 各組miR-203a-3p與VEGF-C靶向關(guān)系檢測的比較Table 1 Comparison of miR-203a-3p and VEGF-C targeting relationship detection in each

2.3 miR-203a-3p對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

克隆形成實驗顯示，相比Control組，miR-203a-3p組卵巢癌細(xì)胞克隆形成率、PCNA蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低(q值分別為11.773、12.246，P<0.05)，pc-VEGF-C組克隆形成率、PCNA蛋白相對表達(dá)水平均顯著增加(q值分別為5.753、3.034，P<0.05)，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組克隆形成率顯著增加(q=3.914，P<0.05)、PCNA蛋白相對表達(dá)水平無顯著變化(q=0.700，P>0.05)；相比pc-VEGF-C組，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組卵巢癌細(xì)胞克隆形成率、PCNA蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低(q值分別為3.086、3.342，P<0.05)，提示miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的體外增殖，見圖3、表2。

注：A為Control組；B為miR-203a-3p組；C為pc-VEGF-C組；D為miR-203a-3p+pc-VEGF-C組。

表2 各組卵巢癌細(xì)胞克隆形成率的比較Table 2 Comparison of clone formation rate of ovarian cancer cells in each

2.4 miR-203a-3p對卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

Transwell實驗和劃痕實驗顯示，相比Control組，miR-203a-3p組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率均顯著降低(q值分別為6.258、5.325，P<0.05)，pc-VEGF-C組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率均顯著增加(q值分別為12.286、12.267，P<0.05)，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率均顯著增加(q值分別為3.583、5.984，P<0.05)；相比pc-VEGF-C組，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率均顯著降低(q值分別為6.343、5.364，P<0.05)，提示miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C表達(dá)抑制SKOV3細(xì)胞的體外侵襲和遷移，見表3、圖4。

表3 各組卵巢癌細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率的比較Table 3 Comparison of the invaded ovarian cancer cell number and cell healing rate in each

注：A為Transwell實驗；B為劃痕實驗；1為Control組；2為miR-203a-3p組；3為pc-VEGF-C組；4為miR-203a-3p+pc-VEGF-C組。

2.5 miR-203a-3p對卵巢癌細(xì)胞E-cadherin和Vimentin及N-cadherin蛋白表達(dá)的影響

與Control組比，miR-203a-3p組E-cadherin表達(dá)顯著升高，Vimentin、N-cadherin表達(dá)均顯著降低(q值分別為4.082、7.746、7.570，P<0.05)，pc-VEGF-C組E-cadherin表達(dá)顯著降低，Vimentin、N-cadherin表達(dá)均顯著升高(q值分別為7.386、3.979、3.861，P<0.05)，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組E-cadherin、Vimentin、N-cadherin表達(dá)均顯著降低(q值分別為3.430、3.055、2.961，P<0.05)；與pc-VEGF-C組比，miR-203a-3p+pc-VEGF-C組E-cadherin表達(dá)顯著升高，Vimentin、N-cadherin表達(dá)均顯著降低(q值分別為5.586、5.115、3.778，P<0.05)，見圖5、表4。

注：A為Control組；B為miR-203a-3p組；C為pc-VEGF-C組；D為miR-203a-3p+pc-VEGF-C組。

表4 各組卵巢癌細(xì)胞E-cadherin、Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)的比較Table 4 Comparison of E-cadherin,Vimentin and N-cadherin protein expression in ovarian cancer cells in each

3討論

3.1 miR-203a-3p靶向結(jié)合VEGF-C mRNA的3′UTR區(qū)并抑制VEGF-C的表達(dá)

細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等眾多生物學(xué)過程參與癌變，在這一復(fù)雜的病理生理過程中，存在著由大量癌基因和抑癌基因組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中miRNA正是這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成員。miR-203a-3p是一種新型的miRNA，在多種腫瘤細(xì)胞及組織中均可檢測到其表達(dá)。Liu等[6]的研究表明，miR-203a-3p參與調(diào)控了卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。作為一類調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的重要生長因子，VEGF已被發(fā)現(xiàn)存在多個亞型，并在腫瘤的生長、侵襲及遷移等相關(guān)惡性生物學(xué)行為的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用[8]。既往研究中，miRNA通過調(diào)控VEGF-C表達(dá)抑制包括肝癌[9]、膀胱癌[10]等的侵襲及轉(zhuǎn)移過程。本研究首先使用靶基因預(yù)測軟件TargetScanHuman提示miR-203a-3p可能具有VEGF-C的結(jié)合位點，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)行了驗證，實驗中表現(xiàn)為miR-203a-3p組熒光素酶活性相比Control組顯著降低，表明VEGF-C確實存在和miR-203a-3p的結(jié)合位點，為后續(xù)功能實驗的開展奠定了基礎(chǔ)。在功能實驗中，VEGF-C對SKOV3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響被miR-203a-3p削弱，進(jìn)一步提示miR-203a-3p可能通過靶向調(diào)控VEGF-C調(diào)節(jié)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

3.2 miR-203a-3p下調(diào)VEGF-C表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖

腫瘤細(xì)胞異常升高的增殖能力是導(dǎo)致腫瘤惡性生長的主要原因，也保證了其向周圍組織浸潤及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的數(shù)量基礎(chǔ)[11]。本研究表明，miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤的惡性增殖與相關(guān)增殖蛋白的表達(dá)關(guān)系密切，其中PCNA與細(xì)胞增殖和分化關(guān)系密切。Barboule等[12]研究提示，當(dāng)PCNA表達(dá)高時，卵巢癌細(xì)胞增殖能力提高，而PCNA表達(dá)水平低時，則其增殖能力被抑制。本研究顯示，與單獨轉(zhuǎn)染VEGF-C相比，共轉(zhuǎn)染miR-203a-3p和VEGF-C使PCNA蛋白表達(dá)下降，這提示miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C表達(dá)并引起下游PCNA表達(dá)降低，從而抑制SKOV3細(xì)胞的惡性增殖。相關(guān)研究證實微小RNA在體外實驗中通過調(diào)節(jié)VEGF-C表達(dá)，抑制PCNA表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖行為[13]，本研究與該結(jié)論相符合。

3.3 miR-203a-3p下調(diào)VEGF-C表達(dá)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，在該生物學(xué)過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程為關(guān)鍵的起始環(huán)節(jié)，其中調(diào)節(jié)上皮粘附連接的相關(guān)分子被一些連接靈活性較大的分子所取代，從而導(dǎo)致細(xì)胞分離和運動性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞更易于侵入血管，并穿過血管壁外滲，形成繼發(fā)性轉(zhuǎn)移灶[14-16]。本研究提示miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C可以有效地抑制SKOV3細(xì)胞的侵襲和遷移能力，表現(xiàn)為視野內(nèi)單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞愈合率相比顯著降低。在功能上，miRNAs通過靶向其下游分子調(diào)控癌變。本研究顯示，miR-203a-3p在SKOV3細(xì)胞中調(diào)控其下游靶點的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin；而以往研究中，其三者是人卵巢癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[17]，說明miR-203a-3p通過靶向調(diào)控VEGF-C來抑制SKOV3細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。葉俊等[18]的研究表明，miRNA可以通過調(diào)控VEGF-C，抑制腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，抑制其侵襲和遷移能力，本研究與其研究結(jié)果相符合。

綜上所述，miR-203a-3p在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，其可通過靶向抑制VEGF-C表達(dá)，抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮抑癌基因作用。本研究為卵巢癌靶向位點治療提供了一定的理論基礎(chǔ)，但還需要更多的功能性體內(nèi)實驗來驗證miR-203a-3p調(diào)控卵巢癌進(jìn)程的具體機(jī)制。