張 藝， 耿亞飛， 鄭博文， 楊 成， 趙炳天*

(1.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)合成與生物膠體教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

特應(yīng)性皮炎，又稱特應(yīng)性濕疹，是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚炎癥，臨床表現(xiàn)為反復(fù)的濕疹和強(qiáng)烈的瘙癢。特應(yīng)性皮炎好發(fā)于兒童期，但在成人中也很常見(jiàn)[1]。特應(yīng)性皮炎的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，其特征性表現(xiàn)為免疫球蛋白E(IgE)抗體水平升高，肥大細(xì)胞(MCs)浸潤(rùn)[2]。MCs可通過(guò)產(chǎn)生IL-6調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3]，在特應(yīng)性皮炎患者中能觀察到外周血T細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6(IL-6)的分泌增多[4]， 血清和皮膚中有較高水平的TNF-α[5]，還可檢測(cè)到前列腺素(PGE2)、環(huán)氧合酶(COX-2)水平的升高[6]，一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的上調(diào)[7-8]及NF-κB的激活[9]。特應(yīng)性皮炎的局部外用藥物以糖皮質(zhì)激素和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑為主，但局部皮膚灼熱、瘙癢、紅斑和腎毒性等副作用限制了藥物的長(zhǎng)期使用[10]。因此從天然藥物中開(kāi)發(fā)毒副作用較小的抗炎藥物，是目前研究的熱點(diǎn)。

丹梔龍膽逍遙湯是在逍遙散的基礎(chǔ)上增加了丹皮、梔子和龍膽三種中藥，增加了清熱涼血的功效。Zhang等[11]研究了蟾蜍皮中總吲哚烷胺類生物堿的抗炎機(jī)制，蟾蜍皮具有清熱涼血和解毒的功效，清熱涼血與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的抗炎免疫觀念密切相關(guān)，因此推測(cè)丹皮、梔子和龍膽在配方中主要起抗炎作用。通過(guò)文獻(xiàn)檢索，選取3種植物的主要成分進(jìn)行篩選，以NO清除率為指標(biāo)選出了各植物中活性最好的組分。獐牙菜苦苷是龍膽的主要活性成分，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和解痙等作用[12]；京尼平苷酸是梔子的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗心血管疾病等作用[13]；沒(méi)食子酸是丹皮中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[14]。本文研究了丹梔龍膽逍遙湯中抗炎成分獐牙菜苦苷、京尼平苷酸和沒(méi)食子酸復(fù)配物在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥和2，4-二硝基氯苯(DNCB)誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎的抗炎效果。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。36只SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量15～20 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0005，合格證編號(hào)20170005029546，飼養(yǎng)于江南大學(xué)，飼養(yǎng)條件為溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度35%～75%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 試劑與藥物 獐牙菜苦苷、京尼平苷酸、沒(méi)食子酸(純度>98%)均購(gòu)自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司。2，4-二硝基氯苯(DNCB)、噻唑藍(lán)(MTT)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素和鏈霉素溶液均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；胎牛血清購(gòu)自澳洲Ausgenex公司；脂多糖(LPS)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；NO試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioVision公司；HE染色試劑盒、甲苯胺藍(lán)染色試劑盒均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；IgE小鼠試劑盒、PGE2小鼠ELISA試劑盒、iNOS小鼠ELISA試劑盒、COX-2小鼠ELISA試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；IL-6小鼠ELISA試劑盒、TNF-α小鼠ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、超敏ECL發(fā)光試劑盒、GAPDH 抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；NF-κB p65、p-IκBα抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與存活率檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)， 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每天傳代1次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。每孔以1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h后棄液，設(shè)置空白組(培養(yǎng)基)、對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、LPS組(1 μg/mL LPS)、實(shí)驗(yàn)組(不同質(zhì)量濃度的單體以及復(fù)配物)，加藥體積為100 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄液。加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基配制的MTT(0.5 mg/mL)孵育4 h，棄液，PBS洗2次。加入100 μL DMSO，振蕩溶解5 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為存活率=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)] ×100%。

2.2 NO釋放量檢測(cè) 每孔以1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后換液，加入LPS和不同質(zhì)量濃度的復(fù)配物(50、100、200 μg/mL)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，共同孵育24 h，取上層培養(yǎng)基，13 000 r/min離心5 min，吸取上清。采用相關(guān)ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)上清液中NO水平。

2.3 細(xì)胞因子、PGE2水平檢測(cè) 每孔以1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2”項(xiàng)下方法處理、培養(yǎng)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。采用相關(guān)ELISA試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)上清液中IL-6、TNF-α、PGE2水平。

2.4 iNOS、COX-2水平檢測(cè) 每孔以8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h后換液，加入50、100、200 μg/mL的復(fù)配物預(yù)處理2 h后換液，加入LPS孵育22 h，棄上清，冷PBS洗滌2次，使用含蛋白酶抑制劑的強(qiáng)RIPA裂解液于冰上裂解蛋白，13 000 r/min離心10 min，取上清，按照BCA試劑盒操作檢測(cè)蛋白濃度并調(diào)整至同一濃度。采用相關(guān)ELISA試劑盒，檢測(cè)iNOS、COX-2水平。

2.5 Western blot檢測(cè)NF-κB p65核易位 取4×106個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種于60 mm直徑的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，冷PBS洗2次，使用NE-PERTM核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒裂解提取細(xì)胞不同部位的蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，沸水浴5 min滅活蛋白，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離30～75 kDa的蛋白，6%SDS-PAGE凝膠電泳分離75～180 kDa蛋白，200 mA濕轉(zhuǎn)120 min后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入一抗p-IκB-α、NF-κB p65，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，使用ECL發(fā)光液顯影。

2.6 細(xì)胞免疫熒光分析 參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道的方法，取2×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，細(xì)胞貼壁后加入復(fù)配物(200 μg/mL)孵育1 h，換液加入LPS(1 μg/mL)刺激30 min。吸干凈培養(yǎng)基，加入PBS稀釋的4%甲醛，室溫固定細(xì)胞15 min，吸去固定液，PBS洗3次，每次5 min，加入細(xì)胞封閉液封閉標(biāo)本1 h，封閉結(jié)束后加入NF-κB p65，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3次，加入DAPI染液避光孵育5 min，PBS洗3次，使用共聚焦顯微鏡拍攝熒光圖片。

2.7 DNCB誘導(dǎo)小鼠炎癥模型建立 小鼠隨機(jī)分為6組，分別為溶劑組、模型組、DNCB+0.25%復(fù)配物組、DNCB+0.5%復(fù)配物組、DNCB+1%復(fù)配物組、地塞米松(0.1%)組，每組6只，適應(yīng)性培養(yǎng)1周后，在實(shí)驗(yàn)前1天(第0天)用剃須刀剃除小鼠背部區(qū)域內(nèi)毛發(fā)，在造模致敏階段，第1、4天用微量移液器與毛刷配合，將150 μL 1.0%DNCB均勻涂抹于造模小鼠背部剃除毛發(fā)區(qū)域，溶劑組小鼠僅在實(shí)驗(yàn)期間背部涂抹溶劑丙酮、橄欖油體積比為3∶1。在造模激發(fā)階段，從第7天開(kāi)始將100 μL 0.5%DNCB均勻涂抹于造模小鼠背部剃除毛發(fā)區(qū)域，在第10、13、16、19、22天重復(fù)上述刺激。從第10天起開(kāi)始給藥，取不同質(zhì)量濃度的復(fù)配物藥液各100 μL，涂抹于DNCB+復(fù)配物組小鼠誘導(dǎo)部位皮膚，每天1次，地塞米松組每天給予1次100 μL地塞米松。第23天，小鼠眼球摘除取血，脫頸處死，取病灶部位皮膚。

2.8 組織學(xué)觀察及IgE水平檢測(cè) 將小鼠背部皮膚用4%中性福爾馬林固定，制備4 μm厚石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色評(píng)估表皮厚度，甲苯胺藍(lán)染色評(píng)估皮膚組織肥大細(xì)胞數(shù)量，ELISA試劑盒檢測(cè)血清IgE水平。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響 如圖1A所示，沒(méi)食子酸、京尼平苷酸、獐牙菜苦苷質(zhì)量濃度分別在25、25、200 μg/mL時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞的存活率無(wú)顯著性影響(P>0.05)，故確定三者復(fù)配比為8∶1∶1。如圖1B所示，在LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞經(jīng)0～200 μg/mL復(fù)配物處理24 h后，其存活率無(wú)明顯變化(P>0.05)。因此，選擇50～200 μg/mL質(zhì)量濃度檢測(cè)抗炎效果。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 單體及其復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of compounds and compound formula on RAW264.7 cells

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 復(fù)配物對(duì)LPS誘導(dǎo) RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-6水平的影響Fig.2 Effects of compound formula on levels of TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7

3.2 復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平的影響 如圖2所示，與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；與LPS組比較，不同質(zhì)量濃度復(fù)配物處理后細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.3 復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中NO、PGE2水平及細(xì)胞中iNOS、COX-2水平的影響 如圖3A～3C所示，與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞上清液中NO、PGE2水平及細(xì)胞中iNOS、COX-2水平均升高(P<0.01)；與LPS組比較，復(fù)配物處理后細(xì)胞上清液中NO、PGE2水平及細(xì)胞中iNOS、COX-2水平均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.4 復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB核易位的影響 如圖4A所示，隨著LPS刺激時(shí)長(zhǎng)的增加，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65表達(dá)先升高后降低，而細(xì)胞質(zhì)中其表達(dá)恰好相反，同時(shí)p-IκB-α表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)胞核中NF-κB p65表達(dá)一致，表明復(fù)配物處理抑制了NF-κB由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移。如圖4B所示，對(duì)照組細(xì)胞NF-κB p65的綠色熒光分布在細(xì)胞質(zhì)中，而LPS刺激后NF-κB p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，細(xì)胞核綠色熒光增多；與LPS組比較，LPS+復(fù)配物組可以明顯的抑制綠色熒光在細(xì)胞核中的富集，證實(shí)了復(fù)配物處理抑制了NF-κB的核易位。

3.5 復(fù)配物對(duì)DNCB誘導(dǎo)BALB/c小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的影響 如圖5A、5C所示，與溶劑組比較，模型組小鼠皮膚表皮厚度增加(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)配物可以抑制小鼠皮膚表皮厚度的增加(P<0.05，P<0.01)。如圖5B、5D所示，與溶劑組比較，模型組有大量的肥大細(xì)胞出現(xiàn)在真皮層中(P<0.01)；與模型組比較，復(fù)配物治療組中的肥大細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05，P<0.01)，以1%復(fù)配物效果更為明顯。如圖5E所示，與溶劑組比較，模型組小鼠血清IgE水平升高(P<0.01)；與模型組比較，1%復(fù)配物治療組小鼠血清IgE水平降低(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。圖3 復(fù)配物對(duì)RAW264.7細(xì)胞上清液中NO、PGE2水平及細(xì)胞中iNOS、COX-2表達(dá)的影響Fig.3 Effects of compound formula on supernate NO，PGE2 levels, and cellular iNOS，COX-2 levels of RAW264.7

圖4 復(fù)配物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB核易位的影響Fig.4 Effects of compound formula on LPS-induced NF-κB nuclear translocation in RAW264.7 cells

注：紅色箭頭表示肥大細(xì)胞。與溶劑組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 復(fù)配物對(duì)DNCB誘導(dǎo)BALB/c小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的影響Fig.5 Effects of compound formula on DNCB-induced atopic dermatitis-like skin lesions in BALB/c

4 討論

特應(yīng)性皮炎的主要癥狀是瘙癢，由于瘙癢引起的過(guò)度抓撓會(huì)損傷皮膚屏障，導(dǎo)致皮膚暴露在外部微生物中，如細(xì)菌[16]。特應(yīng)性皮炎的特征性表現(xiàn)為IgE抗體水平升高，1型和2型輔助性T細(xì)胞(Th1/Th2)失衡，肥大細(xì)胞(MCs)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)[2]。MCs緊鄰神經(jīng)和淋巴血管，其儲(chǔ)存和分泌的炎癥介質(zhì)不僅可以立即影響周圍的組織，還可以調(diào)節(jié)周圍的免疫細(xì)胞[3]，如通過(guò)產(chǎn)生IL-6調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。TNF-α是多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，也被認(rèn)為是特應(yīng)性皮炎的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。在特應(yīng)性皮炎皮損中可以檢測(cè)到PGE2水平的升高，COX-2抑制劑可以阻斷前列腺素的合成[6]。誘導(dǎo)性iNOS由真皮內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，可催化L-精氨酸生成大量NO[7]，NO是細(xì)胞損傷的效應(yīng)分子，可調(diào)節(jié)參與炎癥反應(yīng)的多種細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)[17]。LPS可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-6，提高iNOS和COX-2水平。本文通過(guò)建立體外細(xì)胞炎癥模型，研究了復(fù)配物的抗炎功效和可能的抗炎機(jī)制。結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度(50、100、200 μg/mL)的復(fù)配物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TNF-α、IL-6、NO、PGE2水平均有抑制作用，并且下調(diào)iNOS、COX-2水平。NF-κB參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、炎癥和凋亡等多過(guò)程的基因轉(zhuǎn)錄。靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到LPS刺激后，IκB磷酸化后降解，NF-κB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)參與基因轉(zhuǎn)錄[18]。本研究結(jié)果顯示，加入高質(zhì)量濃度的復(fù)配物還可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞NF-κB核易位，表明復(fù)配物在體外細(xì)胞炎癥模型中具有保護(hù)作用。

此外本研究建立了DNCB誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎模型，以研究復(fù)配物的體內(nèi)抗炎效果。結(jié)果顯示，外用復(fù)配物可以劑量依賴性地降低小鼠特應(yīng)性皮炎中肥大細(xì)胞數(shù)量的增多，高質(zhì)量濃度的復(fù)配物可以有效降低特應(yīng)性皮炎中的表皮增厚和血清總IgE水平上升，表明復(fù)配物在體內(nèi)炎癥模型中同樣具有良好的抗炎效果。

綜上所述，復(fù)配物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞具有顯著的抗炎效果，其作用機(jī)制可能是復(fù)配物通過(guò)抑制NF-κB的核易位從而進(jìn)一步抑制炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、NO、PGE2)及其相關(guān)酶(iNOS、COX-2)的水平。此外，復(fù)配物還對(duì)DNCB誘導(dǎo)的小鼠特應(yīng)性皮炎具有明顯的抗炎效果。結(jié)果表明復(fù)配物在體外和體內(nèi)炎癥模型中都具有良好的抗炎作用，有潛力進(jìn)一步發(fā)展為特應(yīng)性皮炎的治療藥物。