蘇小茉， 張美英， 高嬡嬡， 郭明洲

中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

隨著對(duì)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在生長發(fā)育和各種生命活動(dòng)中功能的認(rèn)識(shí)，其在疾病發(fā)生發(fā)展及診治中的應(yīng)用價(jià)值也被高度關(guān)注。lncRNA在腫瘤中的表達(dá)異常已被廣泛報(bào)道，但獲得lncRNA全長序列，并明確其在腫瘤中的作用和機(jī)制的lncRNA數(shù)量非常有限。與蛋白編碼基因不同，lncRNA的數(shù)量非常龐大，目前仍無法準(zhǔn)確獲得基因組編碼lncRNA的總數(shù)。由于lncRNA在基因組上的分布比較廣泛，絕大多數(shù)的lncRNA與蛋白編碼基因部分或完全重疊，導(dǎo)致其功能研究受到蛋白質(zhì)編碼基因的影響，如常用的基因敲降或敲除技術(shù)均可能同時(shí)影響非編碼RNA和蛋白編碼基因的功能。因此，目前絕大多數(shù)報(bào)道的具有系統(tǒng)功能研究的lncRNA均為基因間lncRNA。隨著各種前沿生物技術(shù)的發(fā)展，絕大多數(shù)尚未被解析的lncRNA，將不斷被明確其在腫瘤等復(fù)雜性疾病中的作用及機(jī)制，為疾病的診斷和防治提供新的策略。

1 lncRNA概述

非編碼RNA是近年來被人們認(rèn)識(shí)的一類新的轉(zhuǎn)錄子，雖然由基因組編碼但不翻譯為蛋白質(zhì)。非編碼RNA在各種細(xì)胞功能和生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。目前認(rèn)為，>75%的人類基因組均具有轉(zhuǎn)錄功能，并編碼大量的非編碼RNA[1-3]。lncRNA是一類長度>200 nt的非編碼RNA，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞生長和分化、發(fā)育，以及各種信號(hào)通路的調(diào)控中均發(fā)揮重要作用。由于lncRNA功能的多樣性和復(fù)雜性，隨著其數(shù)量的不斷增加，如何將發(fā)現(xiàn)的大量lncRNA轉(zhuǎn)錄子分類已成為一個(gè)挑戰(zhàn)性的問題。根據(jù)在基因組上的位置，將其分為基因內(nèi)(位于內(nèi)含子)、基因間(兩個(gè)蛋白編碼基因之間)、增強(qiáng)子(位于啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū))、雙向(位于編碼基因附近的對(duì)應(yīng)鏈，opposite strand)、有義鏈重疊(與各種編碼基因的一個(gè)或多個(gè)外顯子和內(nèi)含子在有義鏈重疊)和反義(在DNA的反義鏈)lncRNA。根據(jù)其功能將lncRNA分為信號(hào)通路(與特定的信號(hào)通路相關(guān))、誘餌(捕獲轉(zhuǎn)錄因子或抑制因子)、引導(dǎo)(與具有調(diào)控作用或酶活性的蛋白復(fù)合物結(jié)合引導(dǎo)到特定的靶基因啟動(dòng)子區(qū)或基因組的某一特定位點(diǎn)調(diào)控下游基因或信號(hào)通路的功能或基因表達(dá))、支架(作為與各種蛋白復(fù)合物結(jié)合的關(guān)鍵平臺(tái)，并引導(dǎo)至特定的基因組位點(diǎn)或靶基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因的表達(dá)及染色質(zhì)的構(gòu)象)[4-5]。人的lncRNA數(shù)量預(yù)計(jì)為2×104～1×105個(gè)或更多[6]。然而，目前發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)lncRNA的功能和作用機(jī)制仍不清楚，并且還有大量的lncRNA有待發(fā)現(xiàn)。很多l(xiāng)ncRNA在各種腫瘤中異常表達(dá)，且一些lncRNA的異常表達(dá)具有腫瘤特異性。由于某些lncRNA具有組織/細(xì)胞特異性，因此有望獲得新的腫瘤特異性診斷標(biāo)志物和個(gè)體化治療靶標(biāo)。

lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有一些lncRNA扮演癌基因角色，而另一些扮演抑癌基因角色。因此，發(fā)現(xiàn)新的與腫瘤相關(guān)的lncRNA并明確其功能和作用機(jī)制，有望在腫瘤診斷和治療方面獲得新的突破，然而目前仍面臨許多挑戰(zhàn)性的問題。雖然，應(yīng)用高通量測序等技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，能夠在不同腫瘤中分離出大量異常表達(dá)的lncRNA轉(zhuǎn)錄本或片段，然而弄清這些lncRNA的功能和機(jī)制是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作[5]。在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的大量上調(diào)或下調(diào)的lncRNA或其片段，如何獲得具有重要功能的lncRNA也是一個(gè)挑戰(zhàn)性的問題。目前，由于絕大多數(shù)lncRNA的結(jié)構(gòu)和生物功能尚未注釋，因此該領(lǐng)域仍處于起步階段。在未弄清lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能之前而發(fā)展的基于lncRNA的治療方法，就像是在黑暗中打槍一樣缺乏明確的目標(biāo)。另外，與蛋白編碼基因不同，lncRNA在種屬間非常不保守，在體外和動(dòng)物模型中獲得的lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能的信息，以及治療策略，并不一定適合在人類疾病中的應(yīng)用，仍然需要結(jié)合人類疾病的臨床標(biāo)本檢測及進(jìn)一步的試驗(yàn)。因此，需要直接從人類疾病樣本中分離和鑒定出新的lncRNA，并對(duì)其功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究[5, 7]。

2 lncRNA對(duì)腫瘤相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用

腫瘤相關(guān)lncRNA已成為腫瘤生物學(xué)最主要的熱點(diǎn)。大量的證據(jù)表明，異常表達(dá)的lncRNA通過不同的信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的持續(xù)增殖和代謝異常，最終導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[8]。

lncRNA BC032913通過上調(diào)TIMP3的表達(dá)和抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位而抑制Wnt信號(hào)通路，抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移[9]。lncRNA CCAL通過激活Wnt信號(hào)通路而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和細(xì)胞周期的進(jìn)展，導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展[8，10]。lncRNA MALAT1通過增加PI3K和AKT磷酸化激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥[11]。LINC01503通過激活ERK/MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。AK001796通過激活P53信號(hào)通路而影響食管癌的生長[12]。在結(jié)腸癌和肝癌中，lncRNA MT1JP通過與TIAR相互作用而激活P53信號(hào)通路[13]。lncRNA CDKN2B-AS通過調(diào)控hTERT的表達(dá)而影響食管癌的生長。MALAT1、SNHG16等lncRNA通過影響EMT而促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移[12，14-17]。lncRNA NORAD通過激活TGF-β信號(hào)通路而促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移[18]。lncRNA gadd7可通過與TDP-43相結(jié)合誘導(dǎo)Cdk6 mRNA的降解而影響DNA損傷修復(fù)(DNA damage repair，DDR)[19-22]。lncRNA-p21通過調(diào)控Hippo信號(hào)通路而抑制胃癌的轉(zhuǎn)移[23]。lncRNA VESTAR在食管癌中通過直接與VEGFC mRNA的相互作用而促進(jìn)其穩(wěn)定性，有望成為食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的治療靶標(biāo)[24]。

3 DDR機(jī)制及腫瘤的“協(xié)同致死”治療策略

在自然情況下，每天每個(gè)細(xì)胞可以通過各種內(nèi)外因素發(fā)生2×105個(gè)DNA損傷。外部因素包括紫外線、輻射和基因毒性藥物[25-26]，以太陽光來源的紫外線照射為例，每天每個(gè)細(xì)胞可以誘導(dǎo)1×105個(gè)DNA損傷[26-27]。內(nèi)源性因素多數(shù)來自于代謝的副產(chǎn)物，如活性氧。細(xì)胞輕度DNA損傷可以經(jīng)過修復(fù)而恢復(fù)正常；不能完全修復(fù)將導(dǎo)致基因的突變或缺失，累積性的癌基因激活突變(驅(qū)動(dòng)基因突變)或抑癌基因缺失將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。嚴(yán)重的DNA損傷如不能修復(fù)將會(huì)通過染色體災(zāi)難等死亡機(jī)制導(dǎo)致?lián)p傷細(xì)胞的死亡。

為了應(yīng)對(duì)DNA損傷，生物進(jìn)化出幾個(gè)具有部分重疊或互補(bǔ)功能的DDR通路。在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有7個(gè)主要的DDR通路，包括直接修復(fù)(direct repair)、錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)、堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)、核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)、同源重組修復(fù)(homologous recombination repair，HR)、經(jīng)典非同源末端連接修復(fù)(classical non-homologous end joining，cNHEJ)和選擇性末端連接修復(fù)(alternative end joining，Alt EJ)[28-30]。腫瘤的關(guān)鍵治療方法之一，就是利用放療或化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，而腫瘤細(xì)胞DDR的缺陷增加其對(duì)放化療的敏感性[29，31]。

“協(xié)同致死”的概念源于對(duì)果蠅遺傳模型的研究，用于描述兩個(gè)或更多基因同時(shí)發(fā)生突變而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[32]。在腫瘤治療中“協(xié)同致死”的基本原理是，腫瘤細(xì)胞中的一個(gè)DDR通路存在缺陷，通過其另外的補(bǔ)償通路而存活，阻斷該補(bǔ)償通路將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。最經(jīng)典的例子是在BRCA1/2突變而表達(dá)缺失的細(xì)胞，應(yīng)用PARP抑制劑導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[29，33-35]。在腫瘤中，應(yīng)用PARP抑制劑治療BRCA1/2突變的細(xì)胞是一個(gè)完美的“協(xié)同致死”治療模型，目前幾乎所有的“協(xié)同致死”研究均局限于BRCA1/2的突變。然而，BRCA1/2突變在多數(shù)腫瘤中均非常少見。隨著對(duì)DDR機(jī)制的深入理解，新的針對(duì)DDR關(guān)鍵分子的靶向治療成為抗腫瘤治療的新策略。約有450個(gè)基因編碼參與DDR的蛋白均可能成為潛在的治療靶標(biāo)。大量的DDR關(guān)鍵分子的抑制劑仍在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如：CBP-501和Prexasertib(CHK1/2抑制劑)、AZD-1775(WEE1抑制劑)、AZD-6738和VX-970(ATR抑制劑)、LY-3023414(DNA-PK抑制劑)和AZD-0156(ATM抑制劑)[31，36]。

通過對(duì)該模型生物學(xué)功能的學(xué)習(xí)和深度分析，發(fā)現(xiàn)在腫瘤中具有與BRCA1/2突變相似的功能異常改變時(shí)，應(yīng)用與BRCA1/2突變腫瘤同樣的治療方案可以獲得同樣的效果，稱之為“BRCAness”[37]?！癇RCAness”可以是其他DDR相關(guān)基因的異常，如ATM、ATR、PALB2、MGMT等，或與細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)/或參與細(xì)胞周期的信號(hào)通路的功能異常改變，如：Notch、PI3K/AKT、ERK等信號(hào)通路的功能異常；根據(jù)Knudson“二次打擊”學(xué)說，“BRCAness”既可以是基因突變，也可以是表觀遺傳異常，如DNA甲基化或lncRNA表達(dá)異常等[38-40]。因此，明確不同信號(hào)通路之間的補(bǔ)償機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將極大地促進(jìn)“協(xié)同致死”策略的發(fā)展和應(yīng)用?；凇癇RCAness”、Knudson“二次打擊”學(xué)說和“協(xié)同致死”原理，我們在食管癌中發(fā)現(xiàn)NRN1甲基化沉默時(shí)，PI3K和ATR抑制劑具有“協(xié)同致死”效應(yīng)[38]。同時(shí)，在肺癌中發(fā)現(xiàn)TMEM176A甲基化沉默和ATM抑制劑(AZD0156)具有“協(xié)同致死”效應(yīng)[39]。這是我們首次根據(jù)Knudson“二次打擊”學(xué)說、“協(xié)同致死”原理和“BRCAness”原理，成功建立的基于表觀遺傳異常的“協(xié)同致死”策略的例證。

基于表觀遺傳異常所導(dǎo)致的基因/信號(hào)通路功能缺失(loss of function)，特別是DDR基因、細(xì)胞周期調(diào)控基因和細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)基因的表觀遺傳沉默，為腫瘤的“協(xié)同致死”提供了新的治療策略[29，31，36，41-42]。在此基礎(chǔ)上有望解決在腫瘤中應(yīng)用經(jīng)典靶向治療無法解決的問題，如突變導(dǎo)致的抑癌基因功能缺失或表觀遺傳異常導(dǎo)致的基因表達(dá)缺失的“undruggable”靶標(biāo)。值得注意的是，“協(xié)同致死”原理可以用于探索在腫瘤中無法靶向的異常改變，通過靶向其具有補(bǔ)償功能的伙伴而達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[43]，如抑癌基因突變或表觀遺傳異常導(dǎo)致的基因表達(dá)缺失。

4 lncRNA、DDR、細(xì)胞命運(yùn)及其在“協(xié)同致死”策略中的應(yīng)用前景

目前，對(duì)于lncRNA的認(rèn)識(shí)仍處于初始階段，大量新的在腫瘤異常表達(dá)的lncRNA或片段不斷被發(fā)現(xiàn)，但明確其功能仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題。近年的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA具有明顯的組織/細(xì)胞特異性或腫瘤特異性的特點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)部分lncRNA通過調(diào)控腫瘤相關(guān)信號(hào)通路而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。某些lncRNA可直接或間接地調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)或DDR相關(guān)基因而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。Sharma等[44]通過比較新制癌菌素(neocarzinostatin)、喜樹堿(camptothecin)和依托泊甙(etoposide)誘導(dǎo)前后hTert永生化人纖維母細(xì)胞lncRNA的表達(dá)，鑒定出在這三種化療藥物誘導(dǎo)下均高表達(dá)的lncRNA DDSR1(DNA damage-sensitive RNA1)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DDSR1通過同源重組修復(fù)方式(homologous recombination repair, HRR)促進(jìn)DNA損傷的修復(fù)。Shahabi等[45]在腫瘤中鑒定出lncRNA LINC00261通過磷酸化激活A(yù)TM而促進(jìn)DNA損傷修復(fù)。lncRNA SPARCLE(suicidal PARP-1 cleavage enhancer)結(jié)合PARP-1促進(jìn)其降解而影響DNA的損傷修復(fù)[46]。lncRNA Aerrie(LINC01013)通過與YBX1相互作用促進(jìn)DNA的同源重組修復(fù)[47]。lncRNA也可通過參與Wnt、PI3K、AKT等信號(hào)通路而參與DNA的損傷修復(fù)。由于深度測序技術(shù)和表觀基因組前沿技術(shù)的發(fā)展，新的lncRNA的數(shù)量快速增加，且在腫瘤中異常表達(dá)lncRNA的數(shù)量也在不斷增加。目前，最具挑戰(zhàn)性的問題是如何明確lncRNA的特征和闡明其功能和在腫瘤中的作用機(jī)制。隨著更多與DDR或細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)lncRNA特性的明確，靶向這些關(guān)鍵lncRNA或其補(bǔ)償通路關(guān)鍵分子的分子靶向治療或“協(xié)同致死”治療將具有更廣泛的應(yīng)用前景。